第二代測(cè)序數(shù)據(jù)分析原理第1頁(yè)，課件共67頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月第二代測(cè)序數(shù)據(jù)分析原理徐汪節(jié)第2頁(yè)，課件共67頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月三代DNA測(cè)序技術(shù)之比較第一代測(cè)序技術(shù)：Sanger測(cè)序法第二代測(cè)序技術(shù)：454測(cè)序……

第三代測(cè)序技術(shù)：？直接測(cè)序法：？第3頁(yè)，課件共67頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月第一代測(cè)序技術(shù)：

Sanger測(cè)序法

——簡(jiǎn)便、快速第4頁(yè)，課件共67頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月逐漸被遺忘的測(cè)序技術(shù)：

Maxam-Gilbert的DNA化學(xué)降解法

第5頁(yè)，課件共67頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月Sanger測(cè)序的局限通過(guò)幾十年的改進(jìn)，第1代測(cè)序儀的讀長(zhǎng)可以超過(guò)1000bp，原始數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確率可以高達(dá)99.999%，測(cè)定每千堿基序列的成本是0.5美元,每天的數(shù)據(jù)通量可以達(dá)到60萬(wàn)堿基。但是，不管怎么改進(jìn)，第1代測(cè)序技術(shù)在速度和成本方面都已達(dá)到了極限（因?yàn)閷?duì)電泳分離技術(shù)的依賴,使其難以進(jìn)一步提升分析的速度和提高并行化程度，并且難以通過(guò)微型化降低測(cè)序成本）。在此種情況下，第二代測(cè)序技術(shù)（Next-generationsequencing)應(yīng)運(yùn)而生。第6頁(yè)，課件共67頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月概要主要的測(cè)序平臺(tái)基因組分析原理轉(zhuǎn)錄組分析原理分析策略的選擇第7頁(yè)，課件共67頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月第二代測(cè)序技術(shù)454測(cè)序IlluminaSOLIDPolonatorCompleteGenomics……第8頁(yè)，課件共67頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月454第9頁(yè)，課件共67頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月SOLID第10頁(yè)，課件共67頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月Illumina第11頁(yè)，課件共67頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月其他PolonatorCompleteGenomics……第12頁(yè)，課件共67頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月第13頁(yè)，課件共67頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月第二代測(cè)序技術(shù)的共同點(diǎn)1將目標(biāo)DNA剪切為小片段2單個(gè)小片段DNA分子結(jié)合到固相表面3單分子獨(dú)立擴(kuò)增4每次只復(fù)制一個(gè)堿基（A,C,T,G）并檢測(cè)信號(hào)5高分辨率的成像系統(tǒng)。第14頁(yè)，課件共67頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月第二代測(cè)序技術(shù)的局限與第一代測(cè)序儀相比，以合成測(cè)序?yàn)榛A(chǔ)的下一代測(cè)序平臺(tái)速度顯著提高，成本明顯降低。每臺(tái)設(shè)備每天產(chǎn)出千兆堿基的序列不足為奇。但是,除了羅氏的454平臺(tái)之外，讀長(zhǎng)短成了下一代測(cè)序平臺(tái)的致命傷，這主要是由于DNA簇中存在的光學(xué)信號(hào)移相造成的。而應(yīng)運(yùn)而生的單分子測(cè)序技術(shù)是解決這一問(wèn)題的一種方法。第15頁(yè)，課件共67頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月第三代測(cè)序技術(shù)：?jiǎn)畏肿訙y(cè)序HelicosBiosciencesVisiGenPacificBiosciencesMobiousNexusI……第16頁(yè)，課件共67頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月第17頁(yè)，課件共67頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月直接測(cè)序法在所有上述三代測(cè)序技術(shù)中，序列都是在熒光或者化學(xué)發(fā)光物質(zhì)的協(xié)助下，通過(guò)讀取DNA聚合酶或DNA連接酶將堿基連接到DNA鏈上過(guò)程中釋放出的光學(xué)信號(hào)而間接確定的。除了需要昂貴的光學(xué)監(jiān)測(cè)系統(tǒng)，還要記錄、存儲(chǔ)并分析大量的光學(xué)圖像，這都使儀器的復(fù)雜性和成本增加。依賴生物化學(xué)反應(yīng)讀取堿基序列更增加了試劑、耗材的使用，在目前測(cè)序成本中比例相當(dāng)大。直接讀取序列信息，不使用化學(xué)試劑，對(duì)于進(jìn)一步降低測(cè)序成本是非常可取的。為了實(shí)現(xiàn)這樣的目標(biāo)，目前就有很多人在研究納米物理技術(shù)。在全球，許多公司和組織，如Agilent，DNAElectronics，IBM,NabSys，OxfordNanoporeTechnologies，Sequenom等都在進(jìn)行納米孔測(cè)序的開(kāi)發(fā)，不同的只是采用的方法或策略。第18頁(yè)，課件共67頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月第19頁(yè)，課件共67頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月第20頁(yè)，課件共67頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月SecondgenerationsequenceRoche454MetagenomicsDenovosequencingRNA-seqillumiaSolexaDenovosequencingRe-sequencingRNA-seq(ChromatinImmunoprecipitation，ChIP)Meth-seqABISOLiDRe-sequencingChIP-seq

RNA-seq第21頁(yè)，課件共67頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月ExperimentsDNA-seq:denovo,resequencingRNA-seq:mRNA,ncRNA,smRNA...ChIP-seq:ChromatinImmunoPrecipitationMethyl-seq:methylatedDNA(epigenome)第22頁(yè)，課件共67頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月主要的測(cè)序平臺(tái)基因組分析原理轉(zhuǎn)錄組分析原理分析策略的選擇第23頁(yè)，課件共67頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月SequencingGlossaryReads.Acollectionofclonesthatover-samplethetargetgenome.Pair-endreads.Sequencereadsderivedfrombothendsofasequencing-libraryclone.Mate-pairreads.Sequencereadsderivedfrombothendsofamate-pairlibraryclonewhichinsertsizeisusually>1kb.Insertsize.Thesizeoftheclone-insertfromwhichaclone-endpairistaken.Contig.Theresultofjoininganoverlappingcollectionofsequencereads.Scaffold.Theresultofconnectiingnon-overlappingcontigesbyusingpir-endreads.N50size.Asappliedtocontigsorscaffolds,thatsizeabovewhich50%odtheassembled第24頁(yè)，課件共67頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月第25頁(yè)，課件共67頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月第26頁(yè)，課件共67頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月第27頁(yè)，課件共67頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月 全基因組denove分析工具PlatformCorrectionAssemblySolexaSOAPdenovoSOAPdenovoVelvet,AbyssSolidSAETVelvet454newbler第28頁(yè)，課件共67頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月分析所需工具Bowtiesoftware-/index.shtml/SAMtools-/TopHatsoftare-/Cufflinkssoftware-http://C/CummeRbundsoftware-/cummeRbund/第29頁(yè)，課件共67頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月外顯子組分析工具PlatformAlignmentFindVariationsSolexaSOAP,bwaSOAPsnpsamtoolsSolidBioscope,BFASTBioscope,BFAST454BLAST,NEWBLERnewbler第30頁(yè)，課件共67頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月主要的測(cè)序平臺(tái)基因組分析原理轉(zhuǎn)錄組分析原理分析策略的選擇第31頁(yè)，課件共67頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月常規(guī)分析TranscriptsquantificationSplicingsitesdiscoveryandquantificationGenediscoverySNP/INDELdetectionAllelespecificexpression第32頁(yè)，課件共67頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月第33頁(yè)，課件共67頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月第34頁(yè)，課件共67頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月第35頁(yè)，課件共67頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月UniGene拼接目的：將預(yù)處理后reads進(jìn)行拼接，得到拼接結(jié)果。

原理：應(yīng)用deBruijngraphpath算法對(duì)reads進(jìn)行denovo拼接；對(duì)上一步的拼接結(jié)果，再用HamiltonPath算法拼接。

結(jié)果：UniGene序列，UniGene統(tǒng)計(jì)信息，序列長(zhǎng)度分布圖第36頁(yè)，課件共67頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月第37頁(yè)，課件共67頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月3.數(shù)據(jù)庫(kù)注釋目的：對(duì)拼接得到的UniGene進(jìn)行功能注釋

原理：通過(guò)blast+算法將拼接得到的UniGene序列與數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)

結(jié)果：比對(duì)結(jié)果表格，物種分布統(tǒng)計(jì)和Evalue分布統(tǒng)計(jì)

第38頁(yè)，課件共67頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月第39頁(yè)，課件共67頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月UniGene表達(dá)分析目的：UniGene定量分析。

原理：以UniGene為reference，分別將每個(gè)樣本的reads進(jìn)行referencemapping,從而得到每個(gè)樣本在每個(gè)UniGenes中的一個(gè)reads覆蓋度，然后應(yīng)用RPKM/FPKM標(biāo)準(zhǔn)化公式對(duì)富集片段的數(shù)量進(jìn)行歸一化。

RPKM：ReadsPerKilobaseofexonmodelperMillionmappedreads，公式下:第40頁(yè)，課件共67頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月UniGene表達(dá)分布圖，1X，5X分別為FPKM=1，F(xiàn)PKM=5分界點(diǎn)，可以大體觀察到低表達(dá)，中表達(dá)以及高表達(dá)的比例關(guān)系第41頁(yè)，課件共67頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月UniGene樣本間表達(dá)相關(guān)性散點(diǎn)圖第42頁(yè)，課件共67頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月樣本間表達(dá)差異程度的MA圖，可以體現(xiàn)差異表達(dá)總體偏差第43頁(yè)，課件共67頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月UniGene表達(dá)差異分析目的：對(duì)定量結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)分析，找出差異表達(dá)UniGene

原理：雙層過(guò)濾篩選差異基因

FC值篩選：采用Fold-change(FC)，表達(dá)差異倍數(shù)進(jìn)行第一層此的差異基因篩選

FDR檢驗(yàn)：一般采用卡方檢驗(yàn)中的fisher精確檢驗(yàn)進(jìn)行p值檢驗(yàn)，采用BenjaminiFDR(Falsediscoveryratio)校驗(yàn)方法對(duì)p值進(jìn)行假陽(yáng)性檢驗(yàn)，即，通過(guò)FDR顯著性參數(shù)進(jìn)行第二層次的差異基因篩選。

第44頁(yè)，課件共67頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月組間差異基因上調(diào)與下調(diào)個(gè)數(shù)統(tǒng)計(jì)，可以通過(guò)此圖觀察上調(diào)與下調(diào)的一個(gè)總體趨勢(shì)第45頁(yè)，課件共67頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月差異基因火山圖，可以觀察到差異基因總體分布第46頁(yè)，課件共67頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月GO功能分類

目的：利用數(shù)據(jù)庫(kù)注釋信息將UniGene進(jìn)行GO功能分類。

原理：利用數(shù)據(jù)庫(kù)的注釋結(jié)果，應(yīng)用blast2GO算法進(jìn)行GO功能分類，得到所有序列在GeneOntology的三大類：molecularfunction,cellularcomponent,biologicalprocess的各個(gè)層次所占數(shù)目，一般取到14層。

結(jié)果：MF，BP，CC三大分類結(jié)果文件以及UniGene2GO關(guān)系列表，三大類別中第二層次上的柱狀分布圖和餅圖，GO功能的層次分布圖。

第47頁(yè)，課件共67頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月第48頁(yè)，課件共67頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月第49頁(yè)，課件共67頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月第50頁(yè)，課件共67頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月第51頁(yè)，課件共67頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月KEGG代謝通路分析目的：對(duì)拼接得到UniGene進(jìn)行KEGGpathway映射。

原理：應(yīng)用KEGGKAAS在線pathway比對(duì)分析工具對(duì)拼接得到的UniGene進(jìn)行KEGG映射分析。

結(jié)果：標(biāo)記的Pathway通路圖。第52頁(yè)，課件共67頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月第53頁(yè)，課件共67頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月IPApathwayanalysis

(/)第54頁(yè)，課件共67頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月COG注釋目的：對(duì)拼接得到UniGene進(jìn)行COG功能分類。

原理：利用blast+算法將拼接得到的UniGene與CDD庫(kù)中的COG/KOG庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，進(jìn)行COG功能分類預(yù)測(cè)，將其映射到COG分類中。

結(jié)果：COG分類分布情況圖。第55頁(yè)，課件共67頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月第56頁(yè)，課件共67頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月SSR重復(fù)序列注釋目的：對(duì)拼接得到UniGene進(jìn)行SSR簡(jiǎn)單重復(fù)序列的查找。

原理：篩選標(biāo)準(zhǔn)：?jiǎn)魏塑账嶂貜?fù)的次數(shù)在10次或10次以上，二核苷酸重復(fù)的次數(shù)在6次或6次以上，三至六核苷酸重復(fù)的次數(shù)在5次或5次以上。同時(shí)，也篩選中間被少數(shù)堿基(間隔小于100或等于100)打斷的不完全重復(fù)的SSR。

結(jié)果：重復(fù)序列的信息文件以及統(tǒng)計(jì)文件。

第57頁(yè)，課件共67頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月LncRNA預(yù)測(cè)目的：對(duì)拼接得到的UniGene進(jìn)行LncRNA(LongnoncodingRNA)預(yù)測(cè)。

原理：通過(guò)以下過(guò)程對(duì)UniGene進(jìn)行過(guò)濾，最終得到候選LncRNA序列。

1)Unigenelength>200bp；

2)UnigeneORF(OpenReadingFrame)length<300；

3)將滿足長(zhǎng)度條件的UniGene與多個(gè)近源物種進(jìn)行進(jìn)化分析，得到序列的保守性和進(jìn)化特性；

4)根據(jù)上述的特性和已知數(shù)據(jù)庫(kù)中coding、noncoding區(qū)域的特性建立編碼篩選模型；

5)將符合noncoding模型的UniG