生物工業菌種與種子的擴大培養第1頁，課件共96頁，創作于2023年2月本章內容一、工業生產常用的微生物及要求二、工業微生物菌種的選育與改良三、工業微生物菌種的衰退、復壯和保藏四、種子的擴大培養第2頁，課件共96頁，創作于2023年2月第一節工業生產常用微生物及要求一、工業生產常用的微生物工業上用的微生物主要有六類：1．細菌（bacteria）例：枯草芽孢桿菌、乳桿菌2．酵母菌（yeast）例：啤酒酵母3．霉菌（mould）例：曲霉、青霉第3頁，課件共96頁，創作于2023年2月第一節工業生產常用微生物及要求一、工業生產常用的微生物工業上用的微生物主要有六類：4．放線菌（actinomyeetes）

主要是生產各種抗生素。例：鏈霉菌生產鏈霉素；小單孢菌生產慶大霉素。5．擔子菌（basidiomycetes）也就是菇類。例：靈芝、香菇6．藻類（alga）一類自養性生物。例：螺旋藻、藍綠藻第4頁，課件共96頁，創作于2023年2月第一節工業生產常用微生物及要求

二、微生物工業對菌種的要求具備四個條件：原料廉價、生長迅速、目的產物產量高；易于控制培養條件，酶活性高，發酵周期較短；抗雜菌和噬菌體的能力強；菌種遺傳性能穩定，不易變異和退化，不生產任何有害的生物活性物質和毒素，保證生產安全。第5頁，課件共96頁，創作于2023年2月第二節工業微生物菌種的選育與改良微生物篩選基因突變（菌種選育）基因重組（菌種改良）基因直接進化自然選育（非定向篩選）誘變育種雜交原生質體融合DNA重組（半定向篩選）點突變易錯PCR同序法DNAshuffling(體外同源重組)（定向篩選）第6頁，課件共96頁，創作于2023年2月第二節工業微生物菌種的選育與改良一、工業微生物菌種的選育1.定義(1)自然選育在生產過程中，不經過人工誘變處理，而根據菌種的自發突變進行菌種篩選的過程，叫做自然選育或者自然分離。用各種物理、化學的因素人工誘發基因突變，從而進行的篩選，稱為誘變育種。(2)誘變育種第7頁，課件共96頁，創作于2023年2月第二節工業微生物菌種的選育與改良一、工業微生物菌種的選育2.兩者間的區別(1)選育過程自然選育：被動選擇，不對菌體做任何人工處理誘變育種：主動選擇，對菌體施加人工影響(2)選育效果要達到相同的水平，誘變育種所需要的時間要比自然選育的時間短很多；對選育工藝而言，一般先對菌群做自然選育；然后再做誘變育種，使其生產性能進一步提高。第8頁，課件共96頁，創作于2023年2月一、工業微生物菌種的選育3.自然選育自然選育又可以分為兩種情況：從自然界中分離獲得菌株從自發突變體中獲得菌株（重點）第二節工業微生物菌種的選育與改良第9頁，課件共96頁，創作于2023年2月一、工業微生物菌種的選育從自然界中分離獲得菌株一般過程：土樣（水樣）的采集預處理

增殖培養純種分離產品的鑒定及篩選復篩較優菌株1-3株生產性能測試初步工藝條件摸索保藏、進一步做生產試驗或作為育種的出發菌株某些必要試驗和毒性試驗等第二節工業微生物菌種的選育與改良第10頁，課件共96頁，創作于2023年2月土樣（水樣）的采集地點的確定要根據篩選的目的、微生物的分布情況以及菌種的主要特征與外界環境關系等進行綜合、具體的分析來決定。I.地點的確定一般的話，可以從土壤中采樣，種類是最多的。II.采樣的操作方法用小鏟除去表層土壤，取離地面5-15cm處的土樣，放入預先消毒好的塑料袋中，扎好，記錄采樣時間、地點、環境情況等，以備日后考查。第11頁，課件共96頁，創作于2023年2月預處理處理土樣，為即將進行的培養做準備。I.目的II.操作方法如果是水樣，則不需要再制備懸液；如果是土樣，則將采集的土樣按一定的比例溶解在去離子水中，振蕩攪勻，制成樣品懸液。等待劃線。一般制成10-2菌懸液，也就是1g土樣放入99ml去離子水中。第12頁，課件共96頁，創作于2023年2月增殖培養針對目標菌株可能較少、雜菌較多而進行。操作目的是為了增加目標菌株的數量；如果目標菌株較多，則沒有必要，直接分離即可。I.目的II.定義給混合菌種提供一些有利于所需菌株生長或不利于其他菌型生長的條件，以促使目標菌株大量繁殖，有利于分離，也叫富集培養。第13頁，課件共96頁，創作于2023年2月增殖培養(i)定向培養III.富集培養的方案采用特定的有利于目的微生物富集的條件進行培養。使用專一性底物、pH條件、培養時間以及培養溫度都是定向培養的方法。第14頁，課件共96頁，創作于2023年2月增殖培養III.富集培養的方案(ii)從菌種的分類學角度考慮目標菌種分離方法細菌霉菌放線菌培養基中添加濃度一般為50μg/ml的抗真菌劑(如放線菌酮和制霉素)，可以抑制真菌的生長分離培養基中加入一定的抗生素，如青霉素和鏈霉素，抑制細菌生長懸液中加入10%的酚數滴，就可以抑制霉菌和細菌的生長第15頁，課件共96頁，創作于2023年2月III.富集培養的方案(iii)隨機分離從產物入手，通過設計高產培養基和建立快速靈敏專一的篩選方法，從隨機分離的菌落中篩選出所需的目的菌。技術關鍵：產物合成條件的選擇與控制及相應篩選方法的確定。增殖培養第16頁，課件共96頁，創作于2023年2月純種分離單菌落分離法分離方法：具體的操作主要有稀釋分離法和劃線分離法兩種。I.稀釋分離法操作步驟：①將樣品不斷的稀釋，使其分散到最低限度②然后將稀釋液涂布于培養基平板上進行培養③待長出獨立的單個菌落，進行挑選分離。優勢：在培養基上分離的菌落單一均勻，獲得純種的概率大。第17頁，課件共96頁，創作于2023年2月I.稀釋分離法單菌落第18頁，課件共96頁，創作于2023年2月單菌落分離法分離方法：II.劃線分離法操作步驟：①首先倒培養基平板②然后用接種針（接種環）挑取樣品，在平板上有規則的劃線。優勢：簡單、快捷注意點：

采用單菌落分離法要注意菌體的分散度。有不同的菌體長在一起的話，有時會發生吻合現象，形成異核菌落。純種分離第19頁，課件共96頁，創作于2023年2月II.劃線分離法斜線法曲線法方格法放射法四格法第20頁，課件共96頁，創作于2023年2月產品鑒定及篩選從兩個角度出發：產物角度、形態角度I.從產物角度出發也就是在培養時以產物的形成來有目的的設計培養基。例：醛肟水解酶的篩選在培養基中加入0.05%的Z-PAOx，每隔2-3天移去一半培養物，補充新鮮培養基，不斷分析樣品。第21頁，課件共96頁，創作于2023年2月II.從形態角度出發也就是觀察菌落的外觀形態，它是微生物的一個重要表征。例：多糖產生菌在適當的培養基上生長時，產生粘液性的菌落產品鑒定及篩選從兩個角度出發：產物角度、形態角度第22頁，課件共96頁，創作于2023年2月第二節工業微生物菌種的選育與改良一、工業微生物菌種的選育實例：堿性纖維素酶產生菌的篩選產生菌：嗜堿芽孢桿菌

自然選育過程：(a)采樣：造紙廠土樣(b)預處理：1g土樣溶于99ml去離子水中，振蕩均勻，過濾，得菌懸液(c)增殖培養：經80℃，30分鐘預處理第23頁，課件共96頁，創作于2023年2月自然選育過程：(e)鑒定篩選：選擇有凹陷圈的菌落，而且越大越好，得到初篩菌種。(f)復篩：通過生產性能測試，摸索條件，分析產酶率，得到1-3株較好菌株(g)保藏及進一步育種第二節工業微生物菌種的選育與改良一、工業微生物菌種的選育實例：堿性纖維素酶產生菌的篩選(d)分離純化：固體分離培養基采用CMC為唯一碳源，pH10.5條件下涂布培養3-4天第24頁，課件共96頁，創作于2023年2月4.誘變育種定義：通過誘變劑處理菌種，大大提高菌種的突變頻率，擴大變異幅度，從中選出具有優良特性的變異菌株，稱為誘變育種。原理：采用物理、化學等誘變因素使微生物DNA堿基對排列發生變化，造成突變，從而使細胞功能發生改變。第二節工業微生物菌種的選育與改良一、工業微生物菌種的選育第25頁，課件共96頁，創作于2023年2月突變方向正突變負突變對生產有利的突變稱為正突變。造成菌株衰退及生產質量下降的突變稱為負突變。菌株發生正突變的概率低。誘變育種的關鍵：以合適的誘變劑處理大量而均勻分散的微生物細胞懸浮液，使個別存活的個體中DNA堿基變異頻率大幅提高；4.誘變育種第二節工業微生物菌種的選育與改良一、工業微生物菌種的選育第26頁，課件共96頁，創作于2023年2月優勢：方法簡便、工作速度快、效果顯著。用合適的方法淘汰負效應變異株，選出極少數性能優良的正變異株，培育優良高產菌株。意義：誘變育種不僅能提高菌種的生產性能，而且能改進產品的質量、擴大品種和簡化生產工藝等。4.誘變育種第二節工業微生物菌種的選育與改良一、工業微生物菌種的選育第27頁，課件共96頁，創作于2023年2月誘變育種的一般程序：出發菌株的選擇菌懸液制備前培養誘變

中間培養變異菌株分離篩選4.誘變育種第二節工業微生物菌種的選育與改良一、工業微生物菌種的選育第28頁，課件共96頁，創作于2023年2月出發菌株的選擇1、定義工業上用來進行誘變或基因重組育種處理的起始菌株稱為出發菌株(parentstrain)。2.滿足要求對誘變劑敏感性大、變異幅度廣、產量高第29頁，課件共96頁，創作于2023年2月出發菌株的選擇3.出發菌株種類出發菌株特點從自然界中分離得到的野生型菌株自發突變經篩選得到的高產菌株（√）已誘變過的菌株對誘變因素敏感，容易發生變異與野生型菌株較相象，容易達到較好的誘變效果多次誘變可能效果迭加，積累更多的提高，但難度大第30頁，課件共96頁，創作于2023年2月菌懸液的制備方法：同步培養法在誘變育種中，處理材料一般采用生理狀態一致的單倍體、單核細胞，即菌懸液的細胞應盡可能達到同步生長狀態，稱為同步培養。第31頁，課件共96頁，創作于2023年2月菌懸液的制備同步化方法：菌種培養方法細菌霉菌放線菌一般要求培養至生長旺盛的對數期，變異率較高，重復性好使用剛剛成熟的分生孢子（將其放在液體培養基中短時間培養，使孢子孵化，處于活化狀態，并恰好未形成菌絲體，易于誘變。）第32頁，課件共96頁，創作于2023年2月菌懸液的制備具體操作：關鍵是制備一定濃度的分散均勻的單細胞或單孢子懸液。(1)細胞的同步培養；(2)過濾或離心、洗滌，并收集菌體；(3)配制菌懸液第33頁，課件共96頁，創作于2023年2月菌懸液的制備具體操作：(i)用生理鹽水或緩沖溶液配制；注意點：(ii)應注意分散度；(iii)最后制得的菌懸液，霉菌孢子或酵母菌細胞的濃度大約為106~107個/ml，放線菌和細菌的濃度大約為108個/ml。第34頁，課件共96頁，創作于2023年2月前培養誘變處理前，可以在加入嘌呤、嘧啶等堿基或酵母膏的培養基中培養20-30min。前培養可以使變異率大幅提高。第35頁，課件共96頁，創作于2023年2月誘變定義：能夠提高生物體突變頻率的物質稱為誘變劑。誘變劑種類1.誘變劑物理誘變劑化學誘變劑紫外、X射線、γ射線、α射線、β射線、等離子、快中子、超聲波等甲基磺酸乙酯(EMS)、硫酸二乙酯(DES)、亞硝基胍(NTG)第36頁，課件共96頁，創作于2023年2月誘變2.誘變機理核酸物質吸收一定能量的紫外線后，它的某些電子將被提升到較高的能量水平，從而引起分子激發而造成突變。因此，紫外線的誘變作用是由于它引起DNA分子結構變化而造成的。第37頁，課件共96頁，創作于2023年2月誘變2.誘變機理這種變化包括：DNA鏈的斷裂，DNA分子內和分子間的交聯形成嘧啶二聚體。第38頁，課件共96頁，創作于2023年2月誘變3.誘變儀器265nm的紫外光，對應于功率為15W的紫外燈4.誘變操作(1)將10ml菌懸液放在直徑為9cm的培養皿中，液層厚度約為2mm，啟動磁力攪拌器；(2)使用15W的紫外燈管，照射距離為30cm左右，照射時間以幾秒至數十分鐘為宜，具芽孢的菌株需處理10min左右。第39頁，課件共96頁，創作于2023年2月誘變5.注意點(1)為準確起見，照射前紫外燈應先預熱20~30min，然后再進行處理；(2)不同的微生物對于紫外線的敏感程度不一樣，誘變劑量也不同。目前趨向采用低劑量、長時間處理；(3)為了避免光復活現象，處理過程應在暗室的紅光下操作，處理完畢后，將盛菌懸液的器皿用黑布包起來培養，然后再進行分離篩選。第40頁，課件共96頁，創作于2023年2月中間培養1.目的對于剛經誘變劑處理過的菌株，有一個表現遲滯的過程（生理延遲），需3代以上的繁殖才能將突變性狀表現出來。若不經液體培養基的中間培養，直接在平皿上分離就會出現不同變異菌體同時存在于一個菌落內的可能，形成混雜菌落，以致造成篩選結果的不穩定和將來的菌株退化。2.后果第41頁，課件共96頁，創作于2023年2月中間培養3.操作誘變處理后細胞在液體培養基中培養幾小時，使細胞的遺傳物質復制，繁殖幾代，以得到純的變異細胞。這樣，穩定的變異就會顯現出來。一般也就是過夜。第42頁，課件共96頁，創作于2023年2月變異菌株的分離和篩選1.目的從誘變后的突變菌體中將少數發生正突變的菌體挑出來。2.分離篩選過程（以營養缺陷型突變體的篩選為例）(1)淘汰野生型菌株(富集培養)幾個定義營養缺陷型菌株

通過誘變而產生的缺乏合成某些營養物質的能力，必須在其基本培養基中加入相應缺陷的營養物質才能正常生長繁殖的變異菌株。第43頁，課件共96頁，創作于2023年2月變異菌株的分離和篩選(1)淘汰野生型菌株(富集培養)基本培養基(MM)凡是能滿足野生菌株正常生長的最低成分的合成培養基。完全培養基(CM)

在基本培養基中加入一些富含氨基酸、維生素及含氮堿基之類的天然有機物質，如蛋白胨、酵母膏等，能滿足各種營養缺陷型菌株生長繁殖的培養基；第44頁，課件共96頁，創作于2023年2月變異菌株的分離和篩選補充培養基(SM)在基本培養基中只是有針對性的加入某一種或某幾種自身不能合成的有機營養成分，以滿足相應的營養缺陷型菌株生長的培養基。(1)淘汰野生型菌株(富集培養)第45頁，課件共96頁，創作于2023年2月變異菌株的分離和篩選分離方法：采用抗菌素法或菌絲過濾法菌種采用方法原理細菌酵母絲狀真菌、霉菌、放線菌抗生素法菌絲過濾法青霉素制霉菌素野生型菌株能在MM中生長，而缺陷型不能生長，于是將誘變處理液在MM中培養短時讓野生型生長，處于活化階段，而缺陷型無法生長，仍處于“休眠狀態”，這時，加入一定量的抗生素，結果活化狀態的野生型就被殺死，保存了缺陷型。在基本培養基中，野生型的孢子能發芽成菌絲，而營養缺陷型則不能。因此將誘變處理后的孢子在基本培養基中培養一段時間后，再進行過濾。第46頁，課件共96頁，創作于2023年2月變異菌株的分離和篩選(2)檢出缺陷型(分離純化)目的：從淘汰野生型之后的混合菌株中篩選出純的缺陷型菌株。方法：影印法、夾層法、逐個檢出法、限量補充培養法第47頁，課件共96頁，創作于2023年2月變異菌株的分離和篩選(2)檢出缺陷型(分離純化)影印法檢出缺陷型的操作將誘變處理后的細胞涂布在完全培養基（CM）表面上，經培養后長出菌落；然后用一小塊直徑比平皿稍小的圓柱形木塊覆蓋于滅過菌的絲絨布上作為接種工具，將長出菌落的平皿倒轉過來，在絲絨上輕輕按一下，轉接到另一基本培養基（MM）平板上；第48頁，課件共96頁，創作于2023年2月變異菌株的分離和篩選(2)檢出缺陷型(分離純化)影印法檢出缺陷型的操作經培養后，比較這兩個平皿長出的菌落。如果發現前一平板上某一部位長有菌落，而在后一培養基上的相應部位卻沒有，就說明這是一個營養缺陷型菌落。第49頁，課件共96頁，創作于2023年2月變異菌株的分離和篩選影印法圖例(2)檢出缺陷型(分離純化)第50頁，課件共96頁，創作于2023年2月變異菌株的分離和篩選(3)確定生長譜(產品鑒定)方法：隨機篩選、形態篩選以及理性化篩選隨機篩選：菌種經過誘變處理后，進行平板分離，隨機挑選單菌落，從中篩選高產菌株。形態篩選：一種半理性化的篩選方式。利用形態突變直接淘汰低產變異菌株，或利用平皿反應直接挑取高產變異菌株。第51頁，課件共96頁，創作于2023年2月變異菌株的分離和篩選形態篩選方法形態突變某些菌株的形態和生產性能直接相關，可以采用此種方法。如灰黃霉素產生菌。(3)確定生長譜(產品鑒定)第52頁，課件共96頁，創作于2023年2月變異菌株的分離和篩選理性化篩選分為兩種情況：初級代謝產物高產菌株的篩選、次級代謝產物高產菌株的篩選。平皿反應平皿反應是指每個變異菌落產生的代謝產物與培養基內的指示物在培養基平板上作用后表現出一定的生理效應，如變色圈、透明圈、生長圈、抑菌圈等，這些效應的大小表示變異菌株生產活力的高低，以此作為篩選的標志。(3)確定生長譜(產品鑒定)形態篩選方法第53頁，課件共96頁，創作于2023年2月聯系區別初級代謝次級代謝①初級代謝是次級代謝的基礎，它可以為次級代謝產物合成提供前體物和所需要的能量；②次級代謝途徑并不是獨立的，與初級代謝途徑有密切關系，是它的延伸或支路。定義產物合成期能使營養物質轉換成細胞結構物質、維持微生物正常生命活動的生理活性物質或能量的代謝。為了避免在初級代謝過程中某些中間產物積累所造成的不利作用而產生的一類有利于生存的代謝類型。生長繁殖所必需，如氨基酸、核苷酸、維生素，酶、輔酶非生長繁殖必需，如抗生素、毒素、甾體化合物等隨菌體生長不斷的合成通常在細胞生長后期形成第54頁，課件共96頁，創作于2023年2月變異菌株的分離和篩選(3)確定生長譜(產品鑒定)初級代謝產物高產菌株的篩選例：如何從缺陷型菌種中篩選能夠積累C的高產菌株？思路：了解涉及C這種物質在菌體中的代謝途徑ABCDE(i)C為中間產物，正常途徑不可能積累；兩個結論：(ii)E為終產物，生長必需；第55頁，課件共96頁，創作于2023年2月變異菌株的分離和篩選思路：分析積累C在代謝途徑中的可能性(ii)切斷C→D，代謝終止，終產物E不能繼續合成；(i)若要積累C，必須切斷C→D的代謝；(iii)E生長必需，若不能合成，菌體無法生存；ABCDE小結：若想達到既能累積C，又能保持菌體不斷生長的目的，可在切斷C→D之后，人工添加E。(3)確定生長譜(產品鑒定)第56頁，課件共96頁，創作于2023年2月變異菌株的分離和篩選(3)確定生長譜(產品鑒定)思路：分析積累C在代謝途徑中的可能性生物反應具有一個特點：ABCDE反饋抑制現象也就是說，即使C→D切斷后，C的積累量也不可能很多；而E的添加量也不能很大解決方案總的原則：繞過反饋抑制第57頁，課件共96頁，創作于2023年2月變異菌株的分離和篩選(3)確定生長譜(產品鑒定)解決方案篩選類型思路方法原理初級代謝產物高產菌株的篩選需要繞過反饋調節a.降低終產物濃度b.篩選抗反饋突變菌株c.控制細胞膜滲透性利用營養缺陷型積累中間代謝物，采用低濃度終產物供給在含有抗代謝物（結構類似物）的培養基中培養，篩選抗性突變株，其中一些可分泌大量末端產物通過生理學或遺傳學方法，改變膜透性，使胞內代謝物迅速滲漏到胞外，解除反饋抑制第58頁，課件共96頁，創作于2023年2月變異菌株的分離和篩選結構類似物：在化學和空間結構上與代謝中間物（終產物）相似，因而在代謝調節方面可以代替代謝中間物（終產物）的功能，但細胞不能以其作為自身的營養物質。第59頁，課件共96頁，創作于2023年2月變異菌株的分離和篩選(3)確定生長譜(產品鑒定)具體操作兩種方法：(i)將缺陷型菌株培養后，收集菌體，洗滌培養基，制備成細胞懸液后，與MM培養基（融化并涼至50℃）混合并傾注平皿。待凝固后，分別在平皿的5~6個區間放上不同的營養組合的混合物或吸飽此組織營養物的濾紙圓片，培養后若在組合區長出，就可測得營養缺陷類型。第60頁，課件共96頁，創作于2023年2月變異菌株的分離和篩選(3)確定生長譜(產品鑒定)具體操作兩種方法：(ii)以不同組合的營養混合物與融化涼至50℃的MM培養基鋪成平皿，然后在這些平皿上劃線接種各個缺陷型菌株于相應位置，培養后根據菌種在什么組合長出可推知其營養缺陷類型。第61頁，課件共96頁，創作于2023年2月變異菌株的分離和篩選(3)確定生長譜(產品鑒定)例：黃色短桿菌中賴氨酸的合成調節機制初級代謝產物產生菌的篩選(i)Thr、Lys生長繁殖必需；(ii)Thr和Lys共同反饋抑制ASP激酶；(iii)Lys反饋抑制雙氫吡啶合成酶；第62頁，課件共96頁，創作于2023年2月變異菌株的分離和篩選(3)確定生長譜(產品鑒定)例：黃色短桿菌中賴氨酸的合成調節機制初級代謝產物產生菌的篩選思路：(i)切斷天冬氨酸半醛→高絲氨酸途徑，并低濃度添加Thr；(ii)篩選Lys的抗反饋突變菌株；第63頁，課件共96頁，創作于2023年2月變異菌株的分離和篩選(3)確定生長譜(產品鑒定)例：黃色短桿菌中賴氨酸的合成調節機制初級代謝產物產生菌的篩選操作：(i)篩選Thr營養缺陷性菌株；(ii)在培養基中加入Lys的結構類似物AEC，篩選生長旺盛的抗反饋突變菌株；第64頁，課件共96頁，創作于2023年2月變異菌株的分離和篩選(3)確定生長譜(產品鑒定)例：黃色短桿菌中賴氨酸的合成調節機制結果：誘變菌株名稱缺陷型Lys產量（g/L）As1.495Leu-2.1F6-16Leu-，Thr-20.8F9-50Leu-，Thr-，AECr33.5第65頁，課件共96頁，創作于2023年2月第二節工業微生物菌種的選育與改良二、生產菌種的改良方法有3種：雜交育種、原生質體融合以及DNA重組改良方式定義優勢雜交育種常規雜交育種原生質體融合將兩個基因型不同的菌株經細胞的互相聯結或原生質體融合使遺傳性狀會出現重新組合，然后經分離和篩選，獲得符合要求的生產菌株。克服原有菌種生活力衰退的趨勢；遺傳物質重新組合，菌種對誘變劑更為敏感。二親株的細胞質和細胞核進行合二為一的過程，因此遺傳物質的交換更為完整，提高菌株產量的潛力更大。第66頁，課件共96頁，創作于2023年2月第二節工業微生物菌種的選育與改良二、生產菌種的改良方法有3種：雜交育種、原生質體融合以及DNA重組改良方式定義優勢DNA重組是一個將含目的基因DNA片段經體外操作與載體連接，轉入一個受體細胞并使之擴增、表達的過程。更有目的性和方向性，效率更高。第67頁，課件共96頁，創作于2023年2月第二節工業微生物菌種的選育與改良二、生產菌種的改良DNA重組過程(a)目的基因的獲得；(b)載體的選擇；(c)含目的基因的DNA片段克隆入載體中構成重組載體；(d)將重組載體引入宿主細胞內進行復制、擴增；(e)篩選出帶有重組目的基因的轉化細胞；(f)鑒定外源基因的表達產物；第68頁，課件共96頁，創作于2023年2月目的基因的獲得一般有四條途徑：(i)從生物細胞中提取、純化染色體DNA并經適當的限制性內切酶部分酶切；(ii)經反轉錄酶的作用由mRNA在體外合成互補DNA(cDNA)，此主要用于真核微生物及動，植物細胞中特定基因的克隆；(iii)化學合成，主要用于那些結構簡單、核苷酸順序清楚的基因的克隆；(iv)從基因庫中篩選、擴增獲得，目前認為是取得任何目的基因的最好和最有效的方法。第69頁，課件共96頁，創作于2023年2月載體的選擇基因工程中所用的載體系統主要有各種質粒（細菌質粒、粘性質粒、酵母菌質粒）、λ噬菌體以及動物病毒等。載體一般為環狀DNA，能在體外經限制酶及DNA連接酶的作用同目的基因結合成環狀DNA質粒pBR322第70頁，課件共96頁，創作于2023年2月重組載體DNA體外重組是將目的基因用DNA連接酶連接到合適的載體DNA上，可采用粘端連接法和末端連接法。第71頁，課件共96頁，創作于2023年2月引入宿主質粒為載體的重組DNA以轉化方式進入宿主細胞；以噬菌體為載體以轉染方式進入；柯斯質粒以轉導方式進入。第72頁，課件共96頁，創作于2023年2月篩選轉化細胞根據導入基因的表達產物來篩選。轉化子能在氨芐青霉素及四環素培養基中生長轉化子只能在氨芐青霉素培養基中生長第73頁，課件共96頁，創作于2023年2月基因工程菌的獲得經重組DNA的轉化與鑒定，得到符合“設計藍圖”的工程菌。第74頁，課件共96頁，創作于2023年2月第二節工業微生物菌種的選育與改良二、生產菌種的改良DNA重組實例：天冬酰胺酶II在大腸桿菌中的高效表達(i)宿主的選擇：大腸桿菌菌株DH5α

(ii)目的基因的選擇：EC-II的基因ansB序列是已知的，通過基因庫可以查到。(iii)載體的選擇：高效原核表達載體pBV220(iv)引物的設計：P1:5’-GGAATTCCATGTTACCCAATATCACCATT-3’P2:5’-CGGATCCGATGGACGTGAGTCTG-3’第75頁，課件共96頁，創作于2023年2月第二節工業微生物菌種的選育與改良二、生產菌種的改良DNA重組實例：天冬酰胺酶II在大腸桿菌中的高效表達(v)ansB的PCR擴增：PCR循環參數為：94℃變性1min、55℃復性1min、72℃延伸1min，30個循環，最后一個循環，72℃延伸5min。(vi)重組載體的構建：將載體pBV220與ansB通過T4連接酶連接，得到pBV-EC；(vii)引入宿主細胞：將重組表達質粒pBV-EC轉化進大腸桿菌DH5α，得到重組表達菌株DH5α/pBV-EC，第76頁，課件共96頁，創作于2023年2月第二節工業微生物菌種的選育與改良二、生產菌種的改良DNA重組實例：天冬酰胺酶II在大腸桿菌中的高效表達(viii)菌種的篩選與鑒定：高效原核表達載體pBV220本身帶有抗氨芐的基因，而DH5α本身不抗氨芐。如果載體轉入菌中，那么它也就帶了抗氨芐的基因。在含有氨芐青霉素的LB培養基上就能生長，未轉入的就不行。第77頁，課件共96頁，創作于2023年2月第三節工業微生物菌種的衰退、復壯和保藏

一、菌種發生衰退的現象1.定義菌株生產性狀的劣化或有些遺傳標記的丟失稱為菌種的退化。2.現象①菌落形態、細胞形態和生理等多方面的改變，如菌落顏色的改變，畸形細胞的出現等；②菌株生長變得緩慢，產孢子越來越少直至產孢子能力喪失；③菌種的代謝活動，代謝產物的生產能力或其對寄主的寄生能力明顯下降。第78頁，課件共96頁，創作于2023年2月第三節工業微生物菌種的衰退、復壯和保藏

二、菌種發生衰退的原因1.根本原因菌種退化的根本原因是有關基因的負突變。2.直接原因①一般而言，菌種的退化是一個從量變到質變逐步演變的過程。因此，突變在數量上的表現依賴于傳代。②連續傳代，使得菌種經常處于旺盛的生長狀態，而細胞的代謝水平與基因突變關系密切，因此其發生突變的機率比處于休眠狀態的細胞大得多。菌種的連續傳代。第79頁，課件共96頁，創作于2023年2月第三節工業微生物菌種的衰退、復壯和保藏

三、防止菌種發生退化的措施1.菌種分離使用單細胞分離的方法，從退化的菌株中篩選出性能優良的單細胞菌落。2.菌種的復壯分為廣義的和狹義兩種復壯。狹義的復壯就是對衰退菌種的分離，屬于被動措施；廣義的復壯則是在菌種尚未衰退之前就有意識的進行純種分離和生產性能的測定，篩選正突變的菌種，屬于積極的措施。第80頁，課件共96頁，創作于2023年2月第三節工業微生物菌種的衰退、復壯和保藏

三、防止菌種發生退化的措施2.菌種的復壯復壯方法：(a)純種分離(b)通過寄主進行復壯如殺螟桿菌(c)淘汰已衰退個體如5406菌種3.提供良好的環境條件(a)選用合適的培養基(b)控制傳代次數第81頁，課件共96頁，創作于2023年2月第三節工業微生物菌種的衰退、復壯和保藏

三、防止菌種發生退化的措施4.優良的保藏方法(1)保藏方法：斜面冰箱保存法、砂土管保存法、真空冷凍干燥保存法、干孢子保存法、液氮超低溫保藏法等(2)保藏原理：用低溫、干燥、缺氧、缺乏營養、添加保護劑或酸度中和劑等方法，挑選優良純種，最好是它們的休眠體，使微生物生長在代謝不活潑，生長受抑制的環境中。第82頁，課件共96頁，創作于2023年2月第三節工業微生物菌種的衰退、復壯和保藏

三、防止菌種發生退化的措施4.優良的保藏方法(3)菌種保藏機構：中國微生物菌種保藏管理委員會(CCCCM)成立普通、農業、工業、醫學、抗生素和獸醫等微生物學有關的六個菌種保藏管理中心普通微生物菌種保藏管理中心(CCGMC)中國科學院微生物研究所，北京(AS)：真菌、細菌。

中國科學院武漢病毒研究所，武漢(AS-IV)：病毒。農業微生物菌種保藏管理中心(ACCC)中國農業科學院土壤肥料研究所，北京(ISF)第83頁，課件共96頁，創作于2023年2月第三節工業微生物菌種的衰退、復壯和保藏

三、防止菌種發生退化的措施4.優良的保藏方法(3)菌種保藏機構：工業微生物菌種保藏管理中心(CICC)中國食品發酵工業科學研究所，北京(IFFI)醫學微生物菌種保藏管理中心(CMCC)中國醫學科學院皮膚病研究所，南京(ID)：真菌。

衛生部藥品生物制品鑒定所，北京(NICPBP)：細菌

中國醫學科學院病毒研究所，北京(IV)：病毒。第84頁，課件共96頁，創作于2023年2月第三節工業微生物菌種的衰退、復壯和保藏

三、防止菌種發生退化的措施4.優良的保藏方法(3)菌種保藏機構：抗生素菌種保藏管理中心(CACC)

中國醫學科學院抗菌素研究所，北京(IA)四川抗菌素工業研究所，成都(SIA)華北制藥廠抗菌素研究所，石家莊(IANP)獸醫微生物菌種保藏管理中心(CVCC

農業部獸醫藥品監察所，北京(CIVBP)第85頁，課件共96頁，創作于2023年2月第三節工業微生物菌種的衰退、復壯和保藏

三、防止菌種發生退化的措施4.優良的保藏方法(3)菌種保藏機構：國外著名菌種保藏機構

美國標準菌種收藏所(ATCC)，美國馬里蘭州

冷泉港研究室(CSH)，美國紐約

國立衛生研究院(NIH)，美國馬里蘭州

國立標準菌種收藏所(NCTC)，英國倫敦

日本東京大學應用微生物研究所(IAM)，日本東京

發酵研究所(IFO)，日本大阪世界衛生組織(WHO)第86頁，課件共96頁，創作于2023年2月第四節種子的擴大培養

一、種子擴大培養的任務1.定義種子擴