第四章動物細胞工程RobertHooke及其制作的顯微鏡AntonievanLeeuwenhoek（1677）首次觀察到了活的細胞第一節概述德國植物學家Schleiden和動物學家Schwann創立了細胞學說1885年Roux用生理鹽水成功培養雞胚組織1907年Harrison成功培養了離體的蛙胚神經組織，并觀察到神經細胞突起的生長過程。開創現代細胞培養的新紀元。發展史細胞工程是以細胞為單位，按人們的意志，應用細胞生物學、分子生物學等理論和技術，有目的地進行精心設計，精心操作，使細胞的某些遺傳特性發生改變，從而達到改良或產生新品種的目的，以及使細胞增加或重新獲得產生某種特定產物的能力，從而在離體條件下進行大量培養、增殖，并提取出對人類有用的產品。發展史第二節

動物細胞的形態和生理特性一、動物細胞的形態動物細胞屬于真核細胞，形態各異，結構復雜，分化精確，不同細胞執行不同的功能。根據不同的需要將離體培養的細胞分為兩類：貼壁依賴型和貼壁非依賴型，或貼壁細胞和懸浮細胞。二、動物細胞的化學組成和代謝動物細胞的主要化學組成

無機成分：水、無機鹽

有機成分：蛋白質、糖類、脂類、核酸動物細胞的代謝

糖，脂肪和蛋白質的代謝分為三個降解階段（大分子降解為小分子，小分子代謝產生三個主要的中間產物，中間產物進入三羧酸循環）三、動物細胞的生理特點細胞的分裂周期長：一般12-48h細胞生長需貼附于基質，并有接觸抑制現象接觸抑制現象：指細胞在生長過程中達到相互接觸時停止分裂的現象。正常二倍體細胞（Diploidcell）的生長壽命是有限的:時間長短決定于細胞來源的種族和年齡原代培養有限細胞系無限細胞系（連續細胞系）動物細胞對周圍環境十分敏感對理化因素敏感：如滲透壓、pH、離子強度、剪切力、微量元素等。動物細胞對培養基的要求高必需氨基酸、維生素、無機鹽、微量元素、葡萄糖、細胞生長因子、貼壁因子等。動物細胞對蛋白質的合成途徑和修飾功能與細菌不同

三、動物細胞的生理特點動物細胞生產藥物缺點：培養條件高、成本貴、產量低優點：分泌胞外、收集純化方便，較完善的翻譯后修飾，與天然產品一致第三節生產用動物細胞的要求和獲得一、生產用動物細胞的要求二、生產動物細胞的獲得三、基因工程細胞的構建和篩選四、常用生產用動物細胞的特性五、細胞庫的建立一、生產用動物細胞的要求原來只有從正常組織中分離的原代細胞Primarycell才能用來生產生物制品，如雞胚細胞、兔腎細胞等；二倍體細胞Diploidcell，即使經過多次傳代也可用于生產，如WI-38，2BS細胞等；用異倍體傳代細胞Aneuploidcell生產重組基因產品，如t-PA、EPO、Ⅷ因子等；按照FDA對細胞株的要求，控制最終產品中DNA殘留量二、生產用動物細胞的獲得原代細胞：直接取自動物組織、器官，經過粉碎、消化而獲得的細胞懸液。如雞胚細胞、原代兔腎細胞或鼠腎細胞、淋巴細胞等；用原代細胞生產生物制品常需要大量的動物，費錢費力；二倍體細胞系diploidcell：原代細胞經過傳代、篩選、克隆，從多種細胞成分的組織中挑選并純化出某種具有一定特征的細胞株由于該類細胞壽命有限，一般從動物的胚胎組織中獲取（壽命更長）。如WI-38、MRC-5、2BS等二、生產用動物細胞的獲得轉化細胞系transformedcellline：失去了正常細胞的特點，獲得了無限增殖的能力轉化細胞系具有無限生命力，常常倍增時間較短，對培養條件和生長因子等要求較低，更適于大規模工業化生產。如:

Namalwa、CHO、BHK-21、Vero細胞等。二、生產用動物細胞的獲得融合細胞系Fusioncellline細胞融合：指兩個或兩個以上的細胞合并成一個細胞的過程目前常用的融合方法有：仙臺病毒融合法、聚乙二醇融合法、電融合法二、生產用動物細胞的獲得仙臺病毒融合法（很少使用）融合過程：病毒加入兩種細胞（4℃），附膜，細胞凝聚37℃，病毒與細胞膜反應，細胞膜被破壞兩細胞連接部穿通，周邊連接部修復細胞融合二、生產用動物細胞的獲得聚乙二醇（PEG）融合法常用相對分子量為1000，濃度為50%，pH在8.0-8.2時融合率可達100%目前主要用于產生單克隆抗體的雜交瘤細胞的制備二、生產用動物細胞的獲得電融合法：在短時間的強電場作用下，細胞膜發生可逆性的電擊穿，使相鄰細胞的細胞膜發生繼發性融合。優點：操作簡單，無化學毒性、對細胞損傷小、融合同步、融合率高，可在顯微鏡下直接觀察；決定因素：電場強度、脈沖寬度、溫度、緩沖液的性質（pH、離子強度、滲透壓）；二、生產用動物細胞的獲得重組工程細胞系采用基因工程的手段構建各種工程細胞既為重組工程細胞系.二、生產用動物細胞的獲得三、基因工程細胞的構建和篩選1.真核細胞Eukaryoticcell基因表達載體的構建病毒載體：牛痘病毒Vacciniavirus

腺病毒Adenovirus

反轉錄病毒Retrovirus

桿狀病毒Baculovirus質粒載體：穿梭質粒載體shuttleplasmidvectorPolyhedrin多角體蛋白用桿狀病毒Baculovirus做載體的優點該病毒基因組是雙鏈DNA，容易進行重組；插入7-8kb的DNA不影響正常病毒粒子的形成；多角體蛋白polyhedrin和病毒粒子的形成無直接關系，因此用外源基因更換多角體蛋白基因，仍能形成有感染力的病毒粒子；多角體蛋白基因有非常強的啟動子，產生的蛋白質可占全部蛋白質的20-30%；用光學顯微鏡可看到多角體，容易以此為標記物來挑選陽性克隆；如果用家蠶桿狀病毒，還可在蠶體直接表達外源基因。構建質粒載體一般含有如下基本成分：允許載體在細菌體內擴增的質粒序列。含有能使基因轉錄表達的調控元件。能用以篩選出外源基因已整合的選擇標記。僅適用于密切相關的突變細胞株，如tk基因顯性作用基因，如neo基因有時還帶有選擇性增加拷貝數的擴增系統。用桿狀病毒Baculovirus做載體的優點2.基因載體的導入和高效表達工程細胞株的篩選DNA導入動物細胞的常用方法

融合法化學法物理法病毒法細胞融合法 DNA-磷酸鈣沉淀法電穿孔法重組逆轉錄病毒介導法脂質體介導法DEAE-葡聚糖法顯微注射法重組DNA病毒介導法原生質融合法染色體介導法基因槍法多瘤病毒樣顆粒介導法微細胞介導法鬼影紅細胞介導法細胞融合法:cellfusion脂質體介導法:liposomemediatedgenetransfer原生質融合法:protoplastfusion微細胞介導法:microcellmediatedmethod鬼影紅細胞介導法:ghostmediatedmethod磷酸鈣沉淀法：將溶解的DNA加在Na2HPO4中，逐漸加入CaCl2溶液，當Na2HPO4(disodiumhydrogenphosphate)和CaCl2(calcium

chloride)形成沉淀，DNA包裹在沉淀中，形成DNA-磷酸鈣共沉淀物，當沉淀物與細胞表面接觸時，通過吞噬作用將DNA導入胞內。優點：方法簡單，可進行共轉化2.基因載體的導入和高效表達工程細胞株的篩選電穿孔法：借助電穿孔儀產生的高壓脈沖電場，使細胞膜出現瞬時可逆性的小孔，外源DNA沿小孔進入細胞。特點：轉化效率較高，但進入的DNA拷貝數較低2.基因載體的導入和高效表達工程細胞株的篩選如何篩選工程細胞？依靠構建載體內的選擇標記采用相應的篩選系統：如用HAT（次黃嘌呤、氨基喋呤、胸腺嘧啶）選擇系統，篩選tk+、hgprt+的轉化細胞；用G418（Geneticin）選擇系統，篩選neor的轉化細胞。對選出的細胞進行克隆和亞克隆使其純化。利用擴增系統，不斷增加其基因拷貝數，獲得高效表達而穩定的工程細胞株。四、常用生產用細胞的特性（1）WI-38：1961年來源于女性高加索人正常胚肺組織的二倍體細胞系。

該細胞是成纖維細胞，能產生膠原，培養基用BME（Eagle’sbasalmedium）加小牛血清，pH控制在7.2。細胞的倍增時間為24h，有限壽命為50代，上世紀60年代被廣泛用于制備疫苗。（2）BHK-21：

1961年從5只生長1天的地鼠幼鼠的腎臟中分離的。現在廣泛采用的是1963年用單細胞分離的方法經13次的克隆的細胞。

成纖維細胞,通常用的培養基為DMEM培養基，添加7%胎牛血清。過去多用于增殖病毒，包括多瘤病毒、口蹄疫病毒和狂犬病疫苗，現在已被用于構建工程細胞。（3）Vero：

1962年來源于正常的成年非洲綠猴腎。

是貼壁依賴的成纖維細胞，2n=60，高倍體率為1.7%，可持續地進行培養。通常用的培養基為199培養基，添加5%胎牛血清。該細胞可支持多種病毒的增殖，包括脊髓灰質炎、狂犬病病毒，已被批準用于人體。（4）Namalwa：

1972年來源于肯尼亞患有Burkitt淋巴瘤(lymphoma)的病人體中，后在瑞典構建的一株人的類淋巴母細胞Lymphoblastoidcell。該細胞有2.8%的高倍體率，多數細胞有12-14條標記染色體，單條X染色體，無Y染色體。通常用的培養基為RPMI1640，添加7%胎牛血清。用于大規模生產-干擾素。五、細胞庫的建立用于生產的工程細胞必須建立兩個細胞庫：1.原始細胞庫（mastercellbank，MCB）2.生產用細胞庫（manugacture’sworkingcellbank，MWCB），或稱工作細胞庫（workingcellbank，WCB）。

原始細胞庫是單一來源的均質的細胞，對于二倍體細胞應該是群體倍增水平盡可能低的細胞。貯存時須有該細胞的詳細檔案，包括：該細胞系的歷史：來源、年齡和性別、細胞分離的方法、所用的培養材料等；該細胞系的特性：形態、生長的特性、種源的特性等；對各種有害因子檢查的結果。生產用細胞庫：從原始細胞庫來，或從單一安瓿來，或從多個安瓿在融化即刻混合在一起的，然后經培養擴增到一定數量后，再分裝儲存形成的細胞庫。生產用細胞庫也必須建立檔案，而且需要進行無菌性和無細胞交叉污染的檢查，生產時需確定其最高使用的傳代數。Questions?Instructor:HezhongWangContact:Office:Bldg#35,Room409Biopharmaceutical(Biopesticide)EngineeringReview:HistoryofeukaryoticcellengineeringPhysiologicalcharacteristicsofanimalcellsConstructionandscreeningofgeneticallyengineeredcellsCharacteristicsofcommonlyusedcellsforproductionBiopharmaceutical(Biopesticide)Engineering第四節動物細胞的培養條件和培養基培養成功必備條件：所有與細胞接觸的設備、器材和溶液，都必須保持絕對無菌，避免細胞外微生物的污染；必須有足夠的營養供應，絕對不可有有害的物質，避免即使是極微量的有害離子的摻入；保證有適量的氧氣供應；需要隨時清除細胞代謝中產生的有害產物；有良好的適于生存的外界環境；及時分種，保持合適的細胞密度；一、動物細胞的培養條件器材的清洗和消毒Sterilization,disinfection:SprayingAlcoholUVlightAutoclaveIrradiationDryheatingBleaching?1.器材的清洗和消毒（1）器材的清洗：浸泡（3%磷酸三鈉,tertiarysodiumphosphate）刷洗泡酸:重鉻酸鉀potassiumdichromate、H2SO4,H2O沖洗（自來水、蒸餾水、去離子水）（2）器材的消毒滅菌：物理方法：如紫外線、干熱、濕熱、過濾化學方法：如化學消毒劑、抗生素一、動物細胞的培養條件器材的清洗和消毒水質Qualityofwater:PurityContaminantsAutoclavedFiltrationDistilledWater?2.水質細胞培養的水必須進行特殊的處理，才能使用。去除微生物、有毒元素、金屬離子、熱原質當前處理水質的方法有：蒸餾、離子交換、電滲透(Electroosmosis)、反滲透(Reverseosmosis)、中空纖維過濾等。一、動物細胞的培養條件器材的清洗和消毒水質pH滲透壓(osmoticpressure)溫度空氣3.pH動物細胞培養的最適pH為7.2-7.4，低于6.8或高于7.6會對細胞產生不利影響，嚴重時可引起細胞退變甚至死亡。培養基應具有一定的緩沖能力，必須加入緩沖系統：如HEPES、Na2HPO4/

NaH2PO4緩沖系統、NaHCO3/CO2緩沖系統等HEPES:2-[4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazinyl]ethanesulfonicacid,azwitterionicorganicchemicalbufferingagent,是一種非離子兩性緩沖液,其在pH7.2-7.4范圍內具有較好的緩沖能力4.滲透壓細胞必須生活在等滲環境中，大多數培養細胞對滲透壓有一定耐受性。最理想的滲透壓為290-300mOsm/kg為調整培養液的滲透壓，一般采用加減NaCl的方法：

1mg/mlNaCl32mOsm/kg在細胞培養操作中，為保持合適的滲透壓和pH，一般都使用平衡鹽溶液（BSS），由無機鹽和葡萄糖組成。5.溫度動物細胞最佳培養溫度：37±0.5℃昆蟲細胞最佳培養溫度：27℃溫度過高：細胞退變甚至死亡溫度過低：降低代謝和生長速度，影響產量6.空氣方瓶和轉瓶培養時，保持瓶內有足夠的空間，即培養的液體量不超過總體積的30%。采用生物反應器需通氣，采用不同比例的O2、N2、CO2和空氣。無毒、無污染體外生長的細胞對微生物及一些有害有毒物質沒有任何抵抗能力，因此培養基應達到：無化學物質污染無微生物污染（如細菌、真菌、支原體、病毒等）無對細胞產生損傷作用的生物活性物質污染（如抗體、補體）對于天然培養基，污染主要來源于取材過程及生物材料本身，應當嚴格選材，嚴格操作對于合成培養基，污染主要來源于配置過程，配制所用的水、器皿應十分潔凈，配置后應嚴格過濾除菌。二、動物細胞培養基的種類和組成1.天然培養基指來自動物體液或利用組織分離提取的一類培養基，如:血漿凝塊:plasmaclot血清:serum淋巴液:Lymph胚胎浸液:Embryoextract羊水、腹水等:Amnioticfluidandascites二、動物細胞培養基的種類和組成1.天然培養基缺點：成分復雜，制作過程復雜，組分不穩定，批間差異大，來源有限，不適于大量培養和生產的需要，逐漸為合成培養基所替代。2.合成培養基Syntheticmedium優點：成分明確，組分穩定，可大量生產供應其組成大致如下：氨基酸：是細胞合成蛋白質的原料。所有細胞都需要12種必需氨基酸：纈、亮、異亮、蘇、賴、色、苯丙、蛋、組、酪、精、胱。此外還需要谷氨酰胺(glutamine)，它在細胞代謝過程中有重要作用，所含的氮是核酸中嘌呤(purine)和嘧啶（pyrimidine）合成的來源，同樣也是合成三、二、一磷酸酰苷（Phosphorylglycoside）所需要的基本物質。維生素：主要是形成酶的輔酶、輔基，維持細胞生命活動的低分子活性物質。脂溶性（A、D、E、K），水溶性維生素（C、B1、B2、B12、生物素（Biotin）、葉酸、膽堿）等都是常用的成分。糖類:培養中的細胞可以進行有氧與無氧酵解，六碳糖是主要能源。此外六碳糖也是也是合成某些氨基酸、脂肪、核酸的原料。細胞對葡萄糖的吸收能力最高，半乳糖最低。無機鹽：保持細胞的滲透壓，緩沖pH的變化，并積極參與細胞的代謝。細胞生長除需Na、K、Ca、Mg、N、P等基本元素，還需要Fe、Cu、Zn、Mn等微量元素。其它成分：有些合成培養基中還加有核酸的前體、氧化還原劑等。一般都需要加入5-10%的小牛血清Bovineserum。 除了以上與細胞生長有關的物質以外，培養基中一般還要加入一種pH指示劑酚紅Phenolred。當溶液酸性時pH＜6.8呈黃色，溶液堿性時pH＞8.4呈紅色。血清的主要成分serum血清是由血漿去除纖維蛋白而形成的，血清中含有各種血漿蛋白、多肽、脂肪、碳水化合物、生長因子、激素、無機物等。血清的種類小牛血清：取自出生10-30天的小牛新牛血清：取自出生24h之內的新生牛胎牛血清fetalbovineserum：取自剖腹產的胎牛，血清中所含的抗體、補體等對細胞有害的成分最少。血清的外觀好的血清應該是透明清亮，土黃色或棕黃色，無沉淀或極少沉淀，比較粘稠。如血清渾濁、不透明、含許多沉淀物，說明血清污染或血清中的蛋白質變性。若血清呈棕紅色，說明血清中的血紅蛋白含量太高，取材時有溶血現象。搖晃時感覺液體稀薄，說明血清中摻入的生理鹽水太多。血清的作用機制提供有利于細胞生長增殖所需的各種生長因子和激素提供有利于細胞貼壁所需的貼附因子和伸展因子提供可識別金屬、激素、維生素和脂質的結合蛋白提供細胞生長所必需的脂肪酸和微量元素提供良好的pH緩沖系統3.無血清培養基優點：提高了細胞培養的可重復性，避免了由于血清批次之間差異的影響；減少了由血清帶來病毒、真菌和支原體等微生物污染的危險；供應充足、穩定；細胞產品容易純化；避免了血清中某些因素對有些細胞的毒性；減少了血清中蛋白對某些生物測定的干擾，便于實驗結果的分析。無血清培養基：合成培養基+不同種類的添加劑添加劑大致有以下幾類：激素和生長因子：

各種激素、生長因子的功能維持細胞的功能，保持細胞的狀態（分化或未分化）使用最多的是胰島素，促進糖原和脂肪酸的合成，對細胞生長有刺激作用。生長因子:按化學性質分多肽類和甾類生長因子。

無血清培養基serumfreemedium無血清培養基：合成培養基+不同種類的添加劑添加劑大致有以下幾類：激素和生長因子：

無血清培養基serumfreemedium常見生長因子陳鋒海峽藥學200618（4）：10-12常用激素及濃度陳鋒海峽藥學200618（4）：10-12結合蛋白：最經常被補充的是鐵傳遞蛋白和白蛋白。為了便于純化，有時可用硫酸亞鐵、檸檬酸鐵、葡萄糖酸鐵代替鐵傳遞蛋白。貼附和伸展因子：目前多數無血清培養基只適用于懸浮細胞，真正能用以培養貼壁細胞的很少，也很貴，原因在于它們均缺少必需的貼附和伸展因子。除貼附因子（纖維結合蛋白、膠原）、多肽生長因子，有的還添加維生素A酸和重組的小肽，它可與細胞的受體結合。其它有利于細胞生長的因子和元素：它們包括有消除氧自由基損害的谷胱甘肽，某些微量元素，如硒等。無血清培養基serumfreemedium常見的貼壁因子如何選擇培養基選擇培養基沒有一定的標準，有幾點建議可供參考：建立某種細胞株所用的培養基應該是培養這種細胞首選的培養基。可以查閱參考文獻，或在購買細胞株時咨詢。根據細胞株的特點、實驗的需要來選擇培養基。用多種培養基培養目的細胞，觀察其生長狀態，可以用生長曲線、集落形成率等指標判斷，根據實驗結果選擇最佳培養基，這是最客觀的方法。培養細胞的種類：

原代細胞培養

傳代細胞培養培養基不同：

液體培養

固體培養培養容器和方式不同：

靜止培養

旋轉培養

微載體培養

中空纖維培養

固定化培養第五節動物細胞培養的基本方法一、細胞分離離心分離法：主要用于從含有細胞的體液，如血液、羊水、胸腹水中分離細胞，800~1000r/min離心5~10min消化分離法：將生物體的組織塊剪碎---用消化液消化，使組織松散成細胞懸液---用緩沖液洗滌、離心、去除殘留的消化液---獲得所需細胞消化液的用途：取材進行原代培養時需要將組織塊消化解離形成細胞懸液；傳代培養時將貼壁細胞從瓶壁上消化下來。常用的消化液:胰蛋白酶、乙二胺四乙酸（EDTA）、胰酶-檸檬酸鹽、胰酶-EDTA、膠原酶、鏈酶蛋白酶、木瓜蛋白酶等一、細胞分離二、細胞計數自動細胞計數器計數原理：讓一定體積的細胞懸液流經一個小孔，并在兩個電極間通過，此時通過的細胞就會對電極間的電流產生干擾而使電壓發生改變，這樣就會在電子計數器上形成一個信號被記錄下來。優點：計數速度快缺點：無法分辨活細胞和死細胞，誤將細胞結團記錄為單個細胞，使計數值偏低血球計數板計數2.血球計數板計數臺酚藍染色：死細胞呈藍色苯胺黑染色：負染色法，細胞本身不染色結晶紫染色細胞核計數法原理：結晶紫染液屬堿性染料，低滲，有螯合鈣離子的作用，可使細胞分散解離和破碎，將細胞核染成藍色。染色后取樣在血球計數板上鏡檢，計數細胞核即細胞數。MTT染色計數法MTT:3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴鹽，商品名：噻唑藍。是一種黃顏色的染料。原理：活細胞內的線粒體脫氫酶能將MTT轉變為不可溶性的紫色的甲臜（za）結晶，可溶于二甲亞砜（DMSO）。MTT結晶形成的量與細胞數成正比。用酶標儀在490nm處測定其吸光值，可間接反映活細胞數量。靈敏度高；MTT有致癌性，DMSO極易滲透皮膚三、細胞傳代subculture懸浮細胞的傳代：加入一倍或幾倍的生長液，然后分種,兩只或多只培養瓶貼壁細胞的傳代：先消化再分種貼壁細胞傳代的注意事項消化前確定細胞有無污染加入消化液量要適當，搖動時能蓋滿單層細胞即可消化時間不宜過長，室溫靜置2-5min終止消化要先去掉消化液，然后加入有血清的培養基分種數量取決于細胞數和細胞特性，多數以20-30萬個/ml，每次1傳2或1傳3為宜；已培養過的瓶子可再次使用，但不要超過2-3次二倍體細胞每次傳代時應寫上傳代次數傳代后每天或隔一天換液，3-5d傳代一次四、細胞的凍存和復蘇1.細胞的凍存采用液氮低溫（-196℃）凍存：加保護劑如甘油和二甲亞砜；冷凍速度以1℃/min的速度下降為宜注意事項：凍存前一天換液培養；細胞密度以1-2×106個/ml為宜；凍存用培養基應與實際使用的一致，DMSO過濾除菌；檢查安踣的密封性；標簽要寫上細胞名稱，編號和凍存日期。2.細胞的復蘇（總的要求是快融）注意事項：操作中注意防護，戴面罩和手套；從液氮中取出后，立即丟入37-40℃溫水的搪瓷杯中，并攪動加速融化；用乙醇消毒安踣外表；盡早除去二甲亞砜，離心，換新鮮培養液；隔天觀察細胞生長情況，再換液一次。四、細胞的凍存和復蘇一、動物細胞大規模培養的方法二、動物細胞培養的操作方式第六節動物細胞大量培養的方法和操作方式一、動物細胞大規模培養的方法依細胞種類：原代培養傳代培養依培養基：液體培養固體培養依培養容器和方式：

靜止培養、旋轉培養、

攪拌培養、微載體培養

中空纖維培養、

固定床或流化床培養一、動物細胞大規模培養的方法從生產實際分為：懸浮培養貼壁培養貼壁-懸浮培養一、動物細胞大規模培養的方法1.懸浮培養懸浮培養：即讓細胞自由地懸浮于培養基內生長繁殖。適用于一切種類的非貼壁依賴性細胞（懸浮細胞），也適用于兼性貼壁細胞。優點：操作簡便，培養條件比較單一，傳質和傳氧較好，容易擴大培養規模，在培養設備的設計和實際操作中可借鑒細菌發酵的經驗；可連續收集部分細胞進行移植繼代培養，傳代時無需消化分散，免遭酶類、EDTA及機械損害；細胞收率高，并可連續測定細胞濃度，還有可能實現大規模直接克隆培養。缺點：細胞體積較小，較難采用灌流培養，細胞密度較低培養過程中，為確保細胞呈單顆粒均勻懸浮狀態，需采用攪拌或氣升式反應器，以較低攪拌速度及一定速度通入含5%CO2的無菌空氣，保持細胞懸浮狀態并維持培養液溶解氧和pH。不同細胞懸浮條件不同。為使細胞不致凝集、成團或沉淀，在配制培養基的基礎鹽溶液中不加鈣和鎂離子。間歇或連續更換部分培養液，可維持pH值，若使用HEPES緩沖鹽溶液可不必連續通入含5%CO2的空氣。1.懸浮培養2.貼壁培養貼壁培養：是必須讓細胞貼附在某種基質上生長繁殖的培養方法。適用于一切貼壁依賴性細胞，也適用于兼性貼壁細胞。優點：適用的細胞種類廣，較容易采用灌流培養缺點：操作麻煩，需要合適的貼附材料和足夠的面積，傳代或擴大培養時需先消化，培養條件不易均一，傳質和傳氧較差。3.貼壁-懸浮培養（假懸浮培養）微載體培養包埋和微囊培養結團培養（1）微載體培養微載體培養法：將動物細胞吸附于微載體表面，在培養液中進行懸浮培養，使細胞在微載體表面長成單層的培養方法，或稱微珠培養法。制備微載體的材料主要有：

葡聚糖明膠玻璃纖維素等微載體培養的優點：既可創造相當大的貼附面積供細胞貼附生長增殖，滿足絕大多數細胞的基本要求，又由于載體體積很小，比重較輕，在輕度攪拌下即可攜帶細胞自由懸浮在培養基內，充分發揮了懸浮培養的一切優點。（1）微載體培養理想微載體需具備的條件微載體表面性質與細胞有良好的相容性；微載體的材料無毒性；微載體的材料是惰性材料；材料比重為1.030-1.045g/ml；粒徑60-250μm（溶脹后），大小均一；具有好的光學透明性；基質的性質是軟性的；可耐120℃高溫，便于采用高壓蒸汽滅菌原料充分，制作簡便，價格低廉，可反復使用從固體微載體發展到多孔微載體（porousmicrocarrier）或多孔微球：極大增大了供細胞貼附的比表面積，同時適用于懸浮細胞的培養。（1）微載體培養（2）包埋和微囊培養包埋法：將細胞包埋于瓊脂、瓊脂糖、膠原及血纖維等海綿狀基質中微囊法：由包埋法衍生而來，將包埋的顆粒經液化處理而成為微囊可用于包埋細胞的載體材料：人工合成的高分子聚合物（聚丙烯酰胺、環氧樹脂、聚氨基甲酸酯、聚乙烯醇等）、糖類（如纖維素、瓊脂、瓊脂糖、K-卡拉膠、海藻酸鈣、殼聚糖等）、蛋白質（如膠原、明膠、纖維蛋白等）包埋或微囊培養法的優點包埋或包裹在載體或微囊內的細胞可獲得保護，避免了剪切力的損害。可以獲得較高的細胞密度，一般都在107-108個/ml以上。當控制微囊膜的孔徑后，可使產品濃縮在微囊內，從而有利于下游產物的純化。可采用多種生物反應器進行大規模培養。（3）結團培養利用細胞本身作為基質，相互貼附后，再用懸浮的方法培養，可獲得高密度的細胞。優點：操作簡便，節省了用于微載體的成本二、動物細胞培養的操作方式分批式操作補料-分批（或流加式）操作（細菌生產中常用）半連續式操作連續式操作（個別情況下用于懸浮細胞的培養）灌流式操作1.分批式操作將細胞和培養基一次性加入反應器內進行培養，此后細胞不斷增長，產物不斷形成和積累，最后將條件培養基，即經培養已含有細胞產物的培養基，或連同細胞一并取出，培養結束。先將細胞和培養基加入反應器，待細胞生長至一定密度后，向反應器內加入誘導劑或病毒等，經一段時間作用后，將反應物取出。2.半連續式操作定義：當細胞和培養基一起加入反應器后，在細胞增長和產物形成過程中，每間隔一段時間，取出部分培養物，或單純是條件培養基，或連同細胞、載體一起，然后補充同樣數量的新鮮培養基，或另加新鮮載體，繼續培養。優點：操作簡便，生產效率高，可長期進行生產，反復收獲產品，而且可使細胞密度和產品產量一直保持在較高的水平。3.灌流式操作定義：當細胞和培養基一起加入反應器后，在細胞增長和產物形成過程中，不斷地將部分條件培養基取出，同時不斷地補充新鮮培養基。但細胞留在反應器內，使細胞處于一種不斷的營養狀態。細胞可處在較穩定的良好的環境中，營養條件好，有害代謝廢物濃度低；可極大地提高細胞密度，從而極大地提高了產品產量；產品在罐內停留時間縮短，可及時收留在低溫下保存，有利于產品質量的提高；培養基的比消耗率較低，加之產量質量的提高，生產成本明顯降低。灌流式操作的優點一、動物細胞生物反應器的類型二、動物細胞生物反應器的檢測控制系統第七節動物細胞生物反應器生物反應器必備條件制造生物反應器所采用的一切材料，尤其是與培養基、細胞直接接觸的材料，對細胞必須是無毒性的生物反應器的結構必須使之具有良好的傳質、傳熱和混合的性能密封性能良好，可避免一切外來的不需要的微生物的污染對培養環境中多種物理化學參數能自動檢測和調節控制，控制的精確度高，能保持環境質量的均一可長期連續運轉容器加工制造時要求內面光滑，無死角，以減少細胞或微生物的沉積拆裝、連接和清潔方便，耐高壓蒸汽消毒，便于操作維修設備成本盡可能低生物反應器必備條件按規模大小可分為：實驗室規模：＜20L，用于培養工藝的研究;中試規模：20-100L，提供一定量的產品，供純化、臨床前的各種檢測和臨床觀察，也包括進一步的工藝優化實驗;生產規模：＞100L，用于生產，提供產品。動物生物反應器一、動物細胞生物反應器的類型攪拌罐式生物反應器氣升式生物反應器透析袋或膜式生物反應器中空纖維生物反應器固定床或流化床式生物反應器

通過借鑒細菌發酵罐得到的動物細胞反應器，有如下特點：（1）罐體的高徑比一般采用1-1.5：1，利于增大與空氣的接觸面；培養動物細胞的罐底為圓形，以避免細胞和載體沉積在周邊（2）為防止攪拌產生的切力損傷細胞，攪拌速度慢，一般在20-100r/min，故多數傾向于采用較大的傾斜式槳葉攪拌器或船舶推進式槳葉攪拌器1、攪拌罐式生物反應器（3）一般采用無氣泡通氣系統，以解決由于氣泡破裂時產生的應力對細胞的損傷；（4）高密度、長時間培養以及提高反應器的生產效率考慮，反應器常常需要配備有進出液體系統，以便進行灌流培養，并有使細胞與培養基分離使細胞保留在反應器內的裝置；攪拌罐式生物反應器在目前仍然是大規模動物細胞培養的主要生產設備1、攪拌罐式生物反應器該反應器的特點見圖5-4，與攪拌式生物反應器相比，具有剪切力小，混合均一，氧和營養的傳遞好，由于沒有了機械攪拌的結構，有利于設備的密封，降低了造價。高徑比一般在10：1左右。2、氣升式生物反應器氣升式細胞培養生物反應器原理

氣升式反應器的基本原理如圖所示。氣體混合物從底部的噴射管進入反應器的中央導流管使得中央導流管側的液體密度低于外部區域從而形成循環。氣升式生物反應器主要采用內循環式，但也有采用外循環式。

在氣升式生物反應器中，溶氧的控制可以通過自動調節進入空氣的速率來實現；PH值可通過在進氣中加入二氧化碳或加入氫氧化鈉來控制。細胞系抗體類型抗體產量，mm/l氣升式/傳統培養瓶滾瓶氣升式1IgG1420865.12IgM701272953.03IgG910737.74IgG28301003.45IgG60762603.86IgM20251125.07IgG30382005.98IgG1201003503.2表列出了八種細胞的有關培養數據，可以看出同傳統的方法（培養瓶和滾瓶）相比，氣升反應器的抗體產量平均提高4.6倍。中空纖維反應器示意圖細胞培養基入口培養基出口

中空纖維式生物反應器如圖所示，它的用途較廣，既可培養懸浮生長的細胞，又可培養貼壁依賴性細胞，細胞的密度最高可達109/ml數量級。如果控制系統不受污染，能長期運轉。已用這種反應器培養過的細胞型和生產的分泌產物如表1所示。生長的細胞型雜交瘤細胞、淋巴細胞、肝癌細胞、結腸癌細胞、胚胎細胞、乳腺組織細胞、小鼠細胞、大鼠細胞、成纖維細胞、垂體腫瘤細胞、CHO細胞、BHK-2細胞、肺細胞等分泌的產物IgG、IgM、IgA、干擾素、激素、尿激酶、蛋白質C、病毒蛋白、乙型肝炎表面抗原、T抑制因子、促細胞生長素、白細胞介素等空氣與CO2出口空氣與CO2入口3、中空纖維式生物反應器3、中空纖維式生物反應器該反應器占地空間小，產品產量、質量高，生產成本低不足之處在于：①不能重復使用；②不能耐受高壓滅菌，需用環氧乙烷或其它消毒劑滅菌；③難以取樣檢測在動物細胞培養過程中，會產生一些代謝產物，如乳酸和氨等，對細胞的生長和產物的產生會產生抑制作用，因此有些學者設計了透析袋或膜式反應器，它們可將這些有害代謝產物透析或過濾掉，從而使細胞生長至更高密度，同時可根據需要選用不同相對分子質量的膜，使產物保留在膜內或與細胞分離開；4、透析袋或膜式生物反應器氣體交換氧氣回流收獲營養液泵反應塔加熱器PH傳感器TDOCO2生產用CF-IMMOTM流化床生物反應器示意圖5、流化床式生物反應器流化床生物反應器的基本原理類似于流態床化學反應器，不同的是，流態化的固體是帶有細胞的微粒。培養液通過反應器垂直向上循環流動不斷提供給細胞必要的營養成分，使細胞得以在微粒中生長；同時，不斷地加入新鮮的培養液，并不斷地排除培養產物或代謝產物。右圖為生產用CF-IMMO流化床生物反應器的示意圖，這種反應器的傳質性能很好，并在循環系統中采用膜氣體交換器，能快速提供給高密度細胞所需的氧，同時排除代謝產物；反應器中的液體流速足以使細胞微粒懸浮卻不會損壞脆弱的細胞。由于流化床生物反應器滿足了高密度細胞培養、使高產量細胞長時間停留在反應器中、優化細胞生長與產物合成的環境等細胞培養的要求，流化床生物反應器既可用于貼壁依賴性細胞的培養，又可用于非貼壁依賴性細胞的培養。下表為流化床生物反應器達到的細胞密度。流化床生物反應器與其它方法培養達到的細胞比較培養類型細胞類型細胞密度（個/ml）流化床雜交瘤0.3*108貼壁依賴性細胞1.3*108恒化器雜交瘤2*106微載體攪拌釜貼壁依賴性細胞0.2*107-2*107二、動物細胞生物反應器的檢測控制系統培養過程中需檢測的物化參數：有些需要在線檢測，如溫度、pH、攪拌速度、溶氧等；有些則需要取樣離線檢測，如活細胞數、氨基酸濃度分析、葡萄糖乳酸和銨離子的檢測等，有些則需在檢測后計算后才能獲得，如細胞的群體倍增時間、細胞的比增長率、葡萄糖消耗率、乳酸產率、生物反應器生產率等。動物細胞對攪拌引起的剪切力和氣泡很敏感，要保持所需的溶氧很困難，常采用的措施有：改變進氣的組成：不同比例的O2、N2、CO2和空氣加大通氣流量適當提高轉速在反應器外通氣加入血紅蛋白適當提高罐壓二、動物細胞生物反應器的檢測控制系統一、動物細胞產品常用的純化方法二、動物細胞產品的質量要求第八節動物細胞產品的純化方法和質量要求下游純化工作費錢、難度大成分復雜：工程細胞表達的產品，常常和細胞內容物、培養基成分，特別當采用有血清培養基時小牛血清中的各種蛋白成分都將與產物混雜在一起，這些成分的物化性質常常和目的產物非常相似，因此很難將他們分離開作用于人體的藥物純度要求高：由于產品多數用于人體，為防雜質對人體的有害作用，對產品的純度要求很高大多數動物細胞表達的產物產量低，生物活性不穩定，因此要求純化過程中所有的操作都應該非常溫和、精細，包括溶液的溫度、pH和鹽離子強度等都需要嚴格控制，要有相當精密的設備和檢測儀器。由于細胞產品多種多樣，它們的氨基酸組成、結構、相對分子質量大小和等電點等都不盡相同，因此分離純化技術的通用性差，必須根據每一種產品的特點研究開發出適合于該產品的專用的分離純化技術。一、動物細胞產品常用的純化方法離心（低溫離心）離子交換層析凝膠層析親和層析鹽析和有機溶劑沉淀透析高壓液相層析鹽析和有機溶劑沉淀鹽析：溶液中加入無機鹽類，破壞蛋白質分子周圍的水化膜，使蛋白質溶解度降低而析出。最常用的中性鹽有硫酸銨、硫酸鈉和氯化鈉等。調節鹽濃度和pH常同時使用。鹽析時蛋白不易變性，結束后需要進行透析、超濾脫鹽。有機溶劑沉淀：加入與水可混溶的有機溶劑，如乙醇、甲醇、丙酮等，也可使蛋白質沉淀。為了避免蛋白質變性必須在低溫下操作。透析原理：蛋白質分子較大，不能通過半透膜，可以據此將蛋白質與相對分子質量較小的雜質分開。高壓液相層析

（HPLC，high-pressureliquidchromatography）

使用顆粒極細的介質，在高壓下分離蛋白質或其他分子混合物的層析技術。柱效比經典柱色譜柱高。在色譜柱出口處常常配以高靈敏度的監測器，以及自動描記、分布收集的裝置，并用計算機進行色譜條件的設定及數據處理。二、動物細胞產品的質量要求對工程細胞的要求：有細胞系的歷史資料有細胞特性的資料無細菌、真菌、支原體和各種病毒，包括反轉錄病毒等外來有害因子的污染生產工藝（細胞培養和純化工藝）的要求：對生產廠房、原材料和試劑的要求對細胞培養的要求對純化過程的要求對產品的質量要求：產品純度產品生物活性產品比活性：每毫克蛋白質中含有多少單位生物學活性（U/mg）產品蛋白質性質的鑒定產品中雜質的檢測產品的穩定性產品臨床前的安全性和有效性評價產品臨床試驗的安全性和有效性評價一、改進表達載體，提高表達水平和產量二、利用代謝工程，改進培養工藝，降低生產成本三、抑制細胞凋亡，延長培養周期四、采用糖基化工程，提高產品質量五、轉基因動物的研究六、組織工程的研究第九節動物細胞制藥的前景與展望一、改進表達載體，提高表達水平和產量采用更強的啟動子和增強子更好的利用擴增系統或尋找高表達位點采用和改造更好的宿主細胞二、利用代謝工程，改進培養工藝，降低生產成本采用代謝工程改造工程細胞

代謝工程，即采用基因工程的手段，使工程細胞增加或減少某種酶，改造它的代謝能力和途徑，使其降低對某些營養物質的需要，減少某些代謝產物的產生和危害，以及控制工程細胞的增殖速度和制造產品的能力。改進培養工藝，降低生產成本優化培養工藝三、抑制細胞凋亡，延長培養周期細胞凋亡：一種由遺傳基因決定的程序性細胞主動死亡防止細胞培養過程中細胞凋亡的三種措施：①通過培養基和氧的優化供應防止營養和氧的缺乏；②用化學添加劑如抗氧化劑等阻斷細胞凋亡過程；③采用抗細胞凋亡基因改造工程細胞四、采用糖基化工程，提高產品質量蛋白質有兩種糖基化方式：N-糖基化和O-糖基化。O-糖鏈對蛋白質特性影響不大，N-糖鏈的不同對產品可產生較大的影響。糖基化工程：用基因工程的手段，人為的改變肽鏈結構、增加某些酶基因以及改進和控制某些培養條件等，以達到正確糖基化的目的。五、轉基因動物的研究1982年Palimiter等首次提出用轉基因動物來生產藥用蛋白。現有α1-抗胰蛋白酶、抗凝血酶Ⅲ和蛋白C等多種產品。優點：質量高、成本低、產品質量基本上與天然的一樣六、組織工程的研究組織工程：通過對細胞的大量培養，并用細胞直接作為一種治療手段用于臨床，或用培養的細胞進一步加工構成一種組織，如人造皮膚、人造肝臟、人造胰腺、人造血管和人造骨等，并用于臨床治療。第三章習題離體培養的細胞分為哪些類型？什么是接觸抑制現象?動物細胞的生理特點生產用動物細胞的種類及其特點動物細胞的培養條件培養動物細胞的培養基的種類和組成動物細胞大規模培養的方法微載體需具備哪些條件？動物細胞培養的操作方式灌流式操作的優點動物細胞生物反應器必須具備的基本要求第十節重組人紅細胞生成素生產工藝1概述2細胞培養工藝3分離純化工藝一、概述天然紅細胞生成素的發現與種類理化性質重組人紅細胞生成素及其臨床應用重組人紅細胞生成素表達研究1、天然紅細胞生成1890：現象，低氧壓下紅細胞增多1948：Bonsdorff和Jalavisto，提出紅細胞生成素（erythropoietin，EPO）。形式：hEPO-α及hEPO-β，二者氨基酸組成及順序相同，166aa，活性類似。糖基化及其含量不同：EPO-α含有較多的N-乙酰葡糖胺，總含糖量比EPO-β高。Erythropoietin:hormoneproducedlargelyinthekidneysthatinfluencestherateofproductionofredbloodcells(erythrocytes).2、EPO的理化性質大小：166aa糖鏈占分子量的39%。糖基化程度與準確性對活性影響很大。pI4.2～4.6，對熱和pH變化相對穩定。第一代：兩種，rhEPO-α和rhEPO-β。1989:Amgen,

Epogen；1990,OrthoBiotech