地鱉蟲纖溶活性先導蛋白抑制腫瘤新生血管形成與作用機制研究

摘要

地鱉蟲纖溶活性先導蛋白（DAP）是一種進行輔酶A依賴性反應的核酸結合蛋白。本研究通過體內和體外實驗探討了DAP在腫瘤新生血管形成中的作用和機制。研究結果表明，DAP能夠抑制腫瘤細胞增殖和轉移，并顯著降低腫瘤新生血管形成。此外，DAP還能夠下調基質金屬蛋白酶-9（MMP-9）和血管內皮生長因子（VEGF）的表達，進一步說明了DAP的抗腫瘤作用。綜上所述，本研究結果為DAP在抗腫瘤治療中的應用提供了新的思路和理論依據。

關鍵詞：地鱉蟲纖溶活性先導蛋白；腫瘤新生血管；基質金屬蛋白酶-9；血管內皮生長因子

Abstract

Daphniamagnafibrinolyticprecursorprotein(DAP)isanucleicacidbindingproteininvolvedincoenzymeA-dependentreactions.Inthisstudy,weinvestigatedtheroleandmechanismofDAPintumorangiogenesisusinginvivoandinvitroexperiments.TheresultsshowedthatDAPwasabletoinhibittumorcellproliferationandmigration,andsignificantlyreducetumorangiogenesis.Inaddition,DAPdownregulatedtheexpressionofmatrixmetalloproteinase-9(MMP-9)andvascularendothelialgrowthfactor(VEGF),furtherdemonstratingitsanti-tumoreffect.Insummary,theresultsofthisstudyprovidenewideasandtheoreticalbasisfortheapplicationofDAPinanti-tumortherapy.

Keywords:Daphniamagnafibrinolyticprecursorprotein;tumorangiogenesis;matrixmetalloproteinase-9;vascularendothelialgrowthfactor

1.引言

腫瘤是人類健康的一大威脅，目前世界衛生組織（WHO）對于各種癌癥的預測顯示，未來的癌癥患者數量將持續上升。因此，探索腫瘤的病因、分子機制及治療手段是很有必要的。腫瘤的生長和轉移是需要依賴于新生血管的形成的，在腫瘤治療中抑制新生血管的形成是一種重要的治療手段。因此，研究新的具有抑制腫瘤新生血管形成的治療藥物具有重要意義。

地鱉蟲是一種廣泛存在于淡水環境中的浮游動物，其生長和繁殖會受到環境中的食物、光照、溫度等因素的影響。研究表明，地鱉蟲中含有一種具有纖溶活性的先導蛋白，即DAP（Daphniamagnafibrinolyticprecursorprotein）。DAP是一種進行輔酶A依賴性反應的核酸結合蛋白，其結構中含有氨基酸序列SSSVVG，具有類似于成纖維細胞增生因子（FGF）的活性[1]。然而，對于DAP在腫瘤新生血管形成中的作用和機制還不很清楚。因此，本研究旨在探討DAP在腫瘤新生血管形成中的作用和機制，以期為抗腫瘤治療提供新的思路和理論依據。

2.實驗方法

2.1動物模型

使用裸鼠作為實驗動物，將7500個SKOV3細胞接種于右腋窩皮下，接種后第七天開始給予DAP處理。

2.2細胞培養

使用人子宮內膜癌細胞系SKOV3和人人宮頸癌細胞系Hela進行實驗。細胞分別在DMEM培養基和RPMI-1640培養基中培養，用10%的胎牛血清將培養基調至適宜生長狀態。

2.3細胞增殖實驗

使用CCK8法進行細胞增殖實驗。將1×104個細胞接種于96孔板中，并將DAP添加進不同濃度組的細胞培養基中。24小時、48小時和72小時之后，使用CCK8試劑評估細胞增殖情況。

2.4細胞遷移實驗

使用Transwell小室進行細胞遷移實驗。將2×105個SKOV3細胞置于上室中，加入不同濃度組的DAP供下室進行對照測量。24小時后，使用甲醛固定、紫杉醇染色，評價遷移細胞數量。

2.5靶向腫瘤新生血管的實驗

使用Matrigel小管形成實驗評估DAP在腫瘤新生血管形成中的作用。在96孔板上加入Matrigel和誘導因子，接種不同濃度的細胞，24小時后進行評定。

2.6Westernblot

使用Westernblot法測定MMP-9和VEGF的表達。將細胞裂解后，獲得蛋白質，再通過SDS進行半定量分析。

2.7免疫熒光

使用免疫熒光法正確認定VEGF的表達。將細胞涂布于玻片上，經過冷凍切片后進行熒光染色然后進行拍照分析。

3.結果

3.1DAP對腫瘤細胞增殖和遷移的影響

使用CCK8法檢測不同濃度的DAP對于SKOV3和Hela細胞的增殖情況。結果顯示，DAP能夠抑制細胞的增殖，且濃度越高作用越強（圖1）。使用Transwell小室進行遷移實驗，得到SKOV3細胞遷移能力受到DAP的抑制（圖2）。

圖1DAP對細胞增殖的影響

圖2DAP對細胞遷移的影響

3.2DAP對腫瘤新生血管形成的影響

使用Matrigel小管形成實驗評估不同濃度的DAP對于血管生成的影響。結果顯示，DAP能夠明顯抑制新生血管的形成（圖3）。

圖3DAP對腫瘤新生血管形成的影響

3.3DAP對MMP-9和VEGF表達的調節作用

使用Westernblot法檢測DAP對于MMP-9和VEGF的表達調節作用。結果顯示，DAP能夠下調MMP-9和VEGF的表達（圖4），并由免疫熒光法證實VEGF的表達被下調（圖5）。

圖4DAP對MMP-9和VEGF表達的影響

圖5DAP對VEGF表達的影響

4.討論

本研究結果表明，DAP在抑制腫瘤增殖、遷移和新生血管形成中發揮了重要作用。此外，DAP還通過下調MMP-9和VEGF的表達來進一步增強了其抗腫瘤效果。在腫瘤治療中抑制新生血管的形成是一種重要的治療手段，然而，目前常用的抗腫瘤治療藥物具有毒副作用較大的缺點，因此，開發抗腫瘤藥物的同時，也需要考慮其毒副作用。DAP作為新的抗腫瘤藥物，研究顯示其在治療腫瘤中具有高效、低毒副作用的特點，因此具有較大的應用前景。

5.結論

本研究通過體內和體外實驗探討了DAP在腫瘤新生血管形成中的作用和機制。研究結果表明，DAP能夠抑制腫瘤細胞增殖和轉移，并顯著降低腫瘤新生血