厭氧菌的藥敏方法介紹（瓊脂稀釋法）熊德鑫北京100037一、受試菌的準備二、抗生素的稀釋和準備三、培養基的準備四、抗生素的MIC試驗五、結果觀察厭氧菌的藥敏方法介紹一、受試菌的準備1.將受試菌純菌接種在厭氧菌血平皿上（一般使用GAM、BHI等），厭氧培養48h（厭氧手套箱中）,厭氧罐中72h。2.取一定量(3-5個菌落)混懸在不抑制厭氧菌生長的透明肉湯中如硫乙醇酸納肉湯或布氏菌肉湯等。3.調節濃度到0.5號McFaland管中(相當于1.5×108CFu/ml),若用試管稀釋法測MIC,則上述管應10倍稀釋2次,終濃度為106CFu/ml即可使用,若為瓊脂稀釋法則不宜稀釋,因為點種菌一般為1-3l,其濃度仍為1.5×105CFu/ml左右。4.也可將菌的混懸液經厭氧培養4-6h（生長緩慢菌應培養12h），這時應注意菌的濃度，如仍在0.5號MF管內就不作處理,超過此濃度宜作稀釋后再使用。5.每次藥敏試驗受試菌中應注意加入標準菌株作為質控.①B.fragilis脆弱類桿菌(ATCC25285或NCTC9343)②B.thetaiotaomicron多形類桿菌(ATCC29741)③C.perfringens產氣莢膜梭菌(AATCC13124)④E.lentum遲緩真桿菌(ATCC43055)6.瓊脂稀釋法中質控菌株MIC值(g/ml)允許范圍（表1）表1質控菌株MIC允許范圍(ug/ml青霉素u/ml) 抗生素*脆弱類桿菌*ATCC25285多形類桿菌*ATCC29741遲緩真桿菌*ATCC43055產氣莢膜梭菌**ATCC13124羧芐青霉素（carbinicillin）

16-64

16-64

8-16

0.25-1頭孢哌硐（cefoperazone）

32-64(128)32-128

32-128

0.125-0.5頭孢氨噻肟（cefotaxime）

8-3216-64

64-256

0.6363-0.25氯霉素(chlorampheninol)2-8

4-16

NO

2-8

氯林可霉素（clindamycin）0.5-0.2

2-8

0.06-0.25

0.031-0.125甲哨唑（metronidazole）

0.25-10.5-2

0.5-2

0.125-0.5青霉素G（penicilling）

16-64(8-32)

16-64(8-32)

NO

0.063-0.25阿莫西林/棒酸（Amoxicillin/Clavulanicacid)

0.25-1

0.5-2

NO

0.25-1 抗生素脆弱類桿菌ATCC25285多形類桿菌ATCC29741遲緩真桿菌ATCC43055產氣莢膜梭菌ATCC13124氨芐青霉素(Aminopenicillins)

16-64

16-64NO

NO氨芐西林/青霉烷砜(Aminopenicillih/sulbactam)(2:1)

0.5-2.0

5-2.0

2-4

0.25-2吡哌西林（piperacillin）

2-8

8-328-32

2-16吡哌西林/他唑巴坦（piperacillin/Tazobactan）

0.12-4

1.25-41-4

1.25-2替卡西林（Ticarcillin）16-64

16-64

16-64

0.5-1.0替卡西林/棒酸(Ticarcillin/Clavulanicacid)

NO0.5-2

16-64

1-4頭孢美唑（cefmetazole）

16-64

8-32

8-32

2-16頭孢西叮（cefoxitin）

4-16

8-32

4-16

2-8續表1質控菌株MIC充許范圍(μg/ml青霉素u/ml) 抗生素脆弱類桿菌ATCC25285多形類桿菌ATCC29741遲緩真桿菌ATCC43055產氣莢膜梭菌ATCC13124頭孢替坦（cefotetan）

4-1632-128

32-128

2-4頭孢唑肟（ceftizoxime）NO

4-1616-64

1.0-2.5頭孢曲松（ceftriaxone）

32-128

64-256

NO2-4

頭孢孟多（cefamandole）

32-12832-128

NO

0.025-1亞胺培南(Imipenen)

0.003-0.120.06-0.25

0.25-1.0

0.25-0.5拉氧頭孢(latamoxef)

0.25-1

4-16

64-26560.5-8

美羅培南(melopenen)0.06-0.25

0.125-0.5

0.125-0.5

0.5-1.0續表1質控菌株MIC充許范圍(μg/ml青霉素u/ml)*此表引自美國實驗室標準化委員會(NCCLS)對厭氧菌藥敏規定介紹1996.12**實用抗菌藥物學第二版戴自英等主編上海科學出版社，1997二、抗生素的稀釋和準備1.準確稱取抗生素(我們一般稱取2.56g,加DW或其它液體4ml)，以對倍稀釋法稀釋成系列濃度2560、1280、640、320、160、80、40、20、10、5、2.5。抗生素量的選擇可據上表敏感范圍作中點向上、向下各稀釋5個濃度。2.用于稀釋抗生素的常用液體的選擇列于表2(其它未標明的抗生素均可用無菌水溶解)抗生素名稀釋液配制保存氯霉素用少量無水乙醇溶解后加PH6.0磷酸鹽緩沖液4℃長期保存紅霉素用少量無水乙醇溶解后加PH6.0磷酸鹽緩沖液-20℃3m,4℃2周林可霉素pH7.8磷酸鹽緩沖液儲存于-70℃冰箱中氯林可霉素pH7.8磷酸鹽緩沖液溶化后立即使用青霉素GpH6.0磷酸鹽緩沖液不再凍存四環素pH4.5磷酸鹽緩沖液同上甲哨唑無菌蒸餾水微熱或加0.1%吐溫-80同上利福平先用少量甲醇溶解再加pH7.8磷酸鹽緩沖液同上萬古霉素無菌蒸餾水同上阿莫西林、替卡西林、棒酸磷酸鹽緩沖液pH6.00.1mol/L同上氨芐青霉素、青霉烷磷酸鹽緩沖液pH8.00.1mol/L同上頭孢他坦無菌蒸餾水同上亞胺培南磷酸鹽緩沖液pH6.00.1mol/L同上拉氧頭孢2胺鹽先用0.04mol/LHCL,再加pH6.10.1mol/L磷酸鹽緩沖液靜置1.5-2h使R.S異聚體各半其它頭孢霉素磷酸鹽緩沖液pH6.00.1mol/L

表2稀釋抗生素常用液體3.一般宜選擇表1中1-2種抗生素作為質控抗生素使用。4.抗生素稀釋前最好換算成標準濃度單位,按化學純品的活性度進行,并要除去非抗生素成份.三、培養基的準備1.使用布氏瓊脂或GAM培養基

布氏瓊脂(胰酪胨10g、動物組織蛋白酶消化物10g、酵母粉2g、葡萄糖1g、氯化納5g、亞硫酸納（NaHSO3)0.1g、0.5%氯化血紅素1ml、1%vitk10.1ml、DW1000ml.pH7.0-7.2121℃15min高壓滅菌。2.取上述稀釋各濃度抗生素2ml至平皿中,再加入約50℃上述培養基18ml,倒平板時宜搖勻,這樣抗生素濃度被稀釋10倍,分別為:256、128、64、32、16、8、4、2、1、0.5、0.253.試驗時必需加入2塊不加抗生素的平板,一塊厭氧培養,一塊做需氧對照。四、抗生素的MIC試驗1.取上述準備好的受試菌液0.5ml，加入滅菌瓷板槽孔中,按順序并作標記。2.用30-50點種針在上述各孔中沾取菌液,用手工或機械手點種到已準備好的抗生素平板面上(每點1l-3l)3.被點種平板做好標記并記錄好順序,同時點種兩塊不含抗生素平板，留一塊作需氧對照,其余全部進入厭氧手套箱中,一般37℃厭氧培養48h。五、結果觀察1.兩塊無抗生素平板，需氧平板無菌生長,而厭氧平板受試菌株全部生長。2.標準菌株及已知抗生素平板上生長在表1范圍內說明本次試驗符合要求。3.從抗生素高濃度平板向低濃度觀察生長情況,未生長濃度(一般連續3個濃度)為此受試菌株的MIC,現在一般以mg/L(或μg/ml)表示。4.從上述未生長MIC處向上和向下各取一個濃度(包括未生長MIC點)，用接種環在菌原接種點上涂抹后再接種至布氏或GAM血平板上,無菌生長點為MBC。5.同一種受試菌10株以上MIC值統計學處理求MIC50、MIC90。6.藥物敏感的判斷列于表3中。表3MIC法解釋標準（瓊脂稀釋法）抗生素MIC(μg/ml或mg/L)敏感中介耐藥阿莫西林/克拉維酸≤2～44～8≥8～16氨芐青霉素≤2(b)4(b)≥8(b)氨芐西林/青霉烷砜≤4～88～16≥16～32羧芐青霉素≤64128≥256青霉素G≤2(b)4(b)≥8(b)吡哌西林≤3264128吡哌西林/他唑巴坦≤4～324～64≥4～128替卡西林≤

3264≥128替卡西林/克拉維酸≤2～324～64≥2～128續表3MIC法解釋標準（瓊脂稀釋法）抗生素MIC(μg/ml或mg/L)敏感中介耐藥頭孢美唑≤

1632≥64頭孢西叮≤1632≥64頭孢哌酮≤1632≥64頭孢噻肟≤1632≥64頭孢替坦≤1632≥64頭孢唑肟≤32（c）64（c）≥128（c）頭孢曲松≤1632≥64頭孢孟多≤816≥32亞胺培南≤48≥16續表3MIC法解釋標準（瓊脂稀釋法）抗生素MIC(μg/ml或mg/L)敏感中介耐藥抗氧頭孢≤16（d）32（d）≥64（d）氯霉素≤816≥32氯林可霉素≤24≥8四環素≤48≥16甲哨唑≤816≥32注:A.血液中藥物水平可以相當高，所以，不產生β-內酰胺酶菌株感染，MIC值低時療效好。B.只適用于瓊脂稀釋法，若為肉湯稀釋法，判定值要低一級（≤16，32，≥64）。C.若每日藥量為4g時，判定值可低一級。關檢厭氧菌藥敏的K-B（紙片法）說明：厭氧菌的藥敏試驗一般不宜使用K-B法做敏感試驗，提倡使用試管或瓊脂稀釋法做藥敏，有時為了臨床需要也做K-B法,提供臨床參考。方法1.紙片的制備：選用國產新華Ⅰ號濾紙，使用打孔機制備成為6mm紙片。2.紙片干熱滅菌（120℃）2h滅菌。3.按表4配好各種抗生素濃度。表4紙片法各種抗生素配制及判定標準（引自國內1993發表資料綜合）抗生素抑菌環直徑（mm）每片含藥量（mg）耐藥中介敏感氯霉素3017～2723～29>29氯林可霉素2<1010～14>14紅霉素10<1516～21≥22林可霉素15210<18<15<919～266～1510～24≥27≥16≥25青霉素G10u≤1213～26≥2-7四環素30≤1718～29≥30萬古霉素30≤1415～20≥20羧芐青霉素100≤1213～22≥23頭孢菌素30≤1011～22≥23強力霉素30≤1213～24≥25甲硝唑5≤88～21≥