幾種細胞實驗步驟EC原代的培養

實驗前準備器械消化酶M199培養基其他大號止血鉗10把，腎形盤2個，圓頭不銹鋼針頭若干，細胞培養瓶若干，50ml離心管若干，大號組織剪2把，彎鑷1把，彎頭組織剪1把，酒精棉球若干,巴氏吸管若干，膠頭若干

二型膠原酶（1mg/ml）胰酶Try(2.5mg/ml)M199培養原液85mlFBS15mlL-Glu1ml濃度為200mmol/LECGS1ml濃度為15-20ng/ml離心液細胞培養瓶NS.本文檔共36頁；當前第1頁；編輯于星期二\1點20分人臍帶縱剖面和直觀圖本文檔共36頁；當前第2頁；編輯于星期二\1點20分實驗操作步驟將滅菌后的實驗物品按操作順序擺放在超凈工作臺內（超凈工作臺內事先UV滅菌）

注意：紫外滅菌時應關閉日光燈，送風機，人員要離開生化間，20分鐘后返回關閉紫外燈，打開日光燈，風機。5分鐘后進行實驗

本文檔共36頁；當前第3頁；編輯于星期二\1點20分打開NS.，點燃酒精燈（不建議使用），將酒精棉鋪開在操作臺中央，方便將所有器械和瓶蓋的擺放。本文檔共36頁；當前第4頁；編輯于星期二\1點20分3將半月盤內倒入少許無菌NS.,取出新鮮臍帶輕輕放入半月盤內，用滅菌后的脫脂棉球將臍帶外周的血跡擦干，將臍帶兩端血跡擦干以便暴露靜脈血管。將圓頭不銹鋼針頭輕緩的插入兩端靜脈血管內，并順勢用止血鉗夾死固定。注意：本實驗操作時要戴好橡膠手套，操作前進行醫用酒精擦拭消毒，當臍帶過短時，只要一端插入圓頭針，另一端用止血鉗夾死。本文檔共36頁；當前第5頁；編輯于星期二\1點20分本文檔共36頁；當前第6頁；編輯于星期二\1點20分用無菌NS.,將臍帶靜脈血管內的淤血沖洗干凈，直到沖出的NS.無色為止，接著將血管內的空氣抽空，兩端固定。本文檔共36頁；當前第7頁；編輯于星期二\1點20分本文檔共36頁；當前第8頁；編輯于星期二\1點20分5將Ⅱ型膠原酶注入臍帶靜脈血管內，此步驟操作時，注意兩端的注射器要來回做活塞運動以便使血管內壁與Ⅱ型膠原酶充分接觸，注入的Ⅱ型膠原酶比例為8ml/15cm。注意：一般本步消化時間為10分鐘左右，Ⅱ型膠原酶的溫度保證在37℃左右消化能力最好。特別提醒的是在消化過程中要用手來回揉搓臍帶外壁，有助于內皮細胞的脫落，此細節至關重要，決定了實驗成敗本文檔共36頁；當前第9頁；編輯于星期二\1點20分本文檔共36頁；當前第10頁；編輯于星期二\1點20分此細節至關重要本文檔共36頁；當前第11頁；編輯于星期二\1點20分終止消化，將靜脈內含有EC細胞的消化液注入含有小牛血清的離心液里終止消化，兩者比例為1:1，并用離心液沖洗靜脈血管兩次，并將收集的細胞懸液裝入離心管，封口

離心，將離心管放入離心機，設定離心速度和時間。一般1200r/min,8分鐘。

待離心機完全停穩后，打開，取出離心管。小心取放，避免震動幅度過大，倒去上清液，將貼壁細胞用新鮮的培養基全液吹打垂懸，放入細胞培養瓶（一般5ml/瓶）本文檔共36頁；當前第12頁；編輯于星期二\1點20分937℃,5%，CO2孵箱培養，第二天換液，去除未貼壁細胞，繼續培養。待細胞幾乎鋪滿瓶底時傳代約為3/4。一傳二本文檔共36頁；當前第13頁；編輯于星期二\1點20分二SMC的原代培養實驗前準備器械消化酶FD-12培養基其他大號止血鉗：2把小號止血鉗：2把小號培養皿：2個眼科剪（直）：2把眼科剪（彎）：2把眼科鑷（直）：2把眼科鑷（彎）：2把

胰酶Try(2.5mg/ml)FD-12培養原液85mlFBS15mlL-Glu1ml濃度為200mmol/L細胞培養瓶NS.6孔板本文檔共36頁；當前第14頁；編輯于星期二\1點20分SMC細胞來源采用方法：組織貼壁法本文檔共36頁；當前第15頁；編輯于星期二\1點20分實驗操作步驟將滅菌后的實驗物品按操作順序擺放在超凈工作臺內（超凈工作臺內事先UV滅菌）

注意：紫外滅菌時應關閉日光燈，送風機，人員要離開生化間，30分鐘后返回關閉紫外燈，打開日光燈，風機。5分鐘后進行實驗

將實驗過程中需要的用到的器械依次擺放在酒精燈周圍取出臍帶（5CM即可），放入半月盤內，用滅菌后脫脂棉擦去臍帶周圍血跡

注意：個體差異性大，選取臍帶時無明顯水腫，淤血，無結節現象本文檔共36頁；當前第16頁；編輯于星期二\1點20分觀察臍帶縱面，找到臍帶內兩根動脈，從中間小心剪一豁口。用組織剪牽拉兩部分，直至分離出動脈血管。

將剖離的動脈轉移到一干凈的6孔板內,孔內加入少許NS.本文檔共36頁；當前第17頁；編輯于星期二\1點20分剝離血管外膜，小心用一眼科直鑷夾住血管一端，用另一把彎鑷輕輕向下牽拉血管外壁，直到明顯可見一層狀組織與內層組織分離。此時應夾緊該層組織，迅速向下剝離。

注意：此步驟最為關鍵，直接決定細胞組織的增殖活力7將剩下的血管組織再次轉移到另一孔內，孔內加入少許NS.,用彎鑷夾住血管一端輕輕地套在眼科剪前端，漸次將組織依次剪開，用一滅菌脫脂棉輕輕擦拭血管內壁，除去血管內皮細胞本文檔共36頁；當前第18頁；編輯于星期二\1點20分8將血管中層再次轉移到一孔內,孔內加入少許培養基，用眼科剪（直）將組織盡數剪成1mm×1mm的小組織塊本文檔共36頁；當前第19頁；編輯于星期二\1點20分將剪好的組織塊用一彎頭吸管吸出來放進細胞培養瓶內，小心將培養基吸出來，將組織塊輕輕地均勻的貼在細胞瓶底。

加入新鮮的培養基，小心不要將瓶底的組織塊沖刷掉。

將細胞培養瓶放入37℃,5%，CO2孵箱培養

注意：此時的細胞培養瓶是倒置的，第二天翻轉培養瓶時才使得組織塊浸入培養基里12培養到第六天時可見組織塊周圍有細胞攀爬出來，此后兩天便可進行初次傳代本文檔共36頁；當前第20頁；編輯于星期二\1點20分三MSC的原代培養實驗前準備器械消化酶FD-12培養基其他大號止血鉗：2把小號止血鉗：2把小號培養皿：2個大號組織剪：2把眼科剪（直）：1把眼科鑷（直）：2把

胰酶Try(2.5mg/ml)α-MEM培養原液85mlFBS15mlL-Glu1ml濃度為200mmol/LSD大鼠一只細胞培養瓶NS.5ml注射器本文檔共36頁；當前第21頁；編輯于星期二\1點20分培養方法全骨髓培養法和密度梯度離心法實驗步驟1將滅菌后的實驗物品按操作順序擺放在超凈工作臺內（超凈工作臺內事先UV滅菌）

注意：紫外滅菌時應關閉日光燈，送風機，人員要離開生化間，30分鐘后返回關閉紫外燈，打開日光燈，風機。5分鐘后進行實驗

將實驗過程中需要的用到的器械依次擺放在酒精燈周圍本文檔共36頁；當前第22頁；編輯于星期二\1點20分將老鼠引頸處死，放入事先配好的醫用酒精內浸泡15分鐘后，轉移到超凈室內。用大號止血鉗夾住鼠尾，用無菌NS.將大鼠身上的酒精沖洗干凈后，放入無菌半月盤內，轉移至超凈臺內。剪去鼠尾。用第一套器械，小心剝離老鼠四肢表皮，露出肌肉層。

用第二套器械，小心剝離老鼠四肢上的肌肉層，露出股骨和脛骨本文檔共36頁；當前第23頁；編輯于星期二\1點20分用第三套器械，小心剝離老鼠的脛骨和股骨注意：此步驟很關鍵，在分離四肢股骨、脛骨時要格外小心，最好用眼科剪，不可暴露骨髓腔將股骨和脛骨轉移到小培養皿內，里面倒入少許NS.，用眼科剪和眼科鑷將骨頭周圍的肌肉組織剝離

將剝離后的股骨和脛骨轉移到一新的培養皿內，小心并迅速用大號組織剪剪斷骨頭兩端，暴露骨髓腔。不建議使用酒精，此步驟以前各步在保證無菌操作情況下可避免染菌本文檔共36頁；當前第24頁；編輯于星期二\1點20分將剪斷的骨髓，用5ml的注射器吸取無血清培養基反復沖洗骨髓腔。收集骨髓懸液的培養基。

在50ml離心管內加入Ficoll人淋巴細胞分離液，將細胞懸液小心的鋪在分離液上層注意：在操作此步驟時，要戴好手套，口罩，在Ficoll液面上鋪細胞時眼睛要與頁面平齊小心封口離心管，離心機內離心，設定為2000r/min,30分鐘

離心后取出離心管，小心吸取離心管內中間白色云霧層，用無血清培養基混勻后再次離心，設定為1500r/min,10分鐘本文檔共36頁；當前第25頁；編輯于星期二\1點20分將離心后的上清液棄除，用新鮮的全培養基垂懸細胞，裝入細胞培養瓶15將細胞培養瓶放入37℃,5%，CO2孵箱培養24小時后將細胞瓶內的培養基吸出放入新的培養瓶內，讓尚未貼壁的細胞繼續貼壁

一般在24h后細胞便可見梭型形，一周后傳代本文檔共36頁；當前第26頁；編輯于星期二\1點20分EPC的原代培養方法同MSC，培養基內加入VEGF誘導因子即可SPC的原代培養方法同上，培養基內加入PDGF-BB誘導因子即可

外周血來源的EPC的培養同MSC的操作步驟（11—17）

人臍帶間充質干細胞的培養同SMC組織貼壁法。去除動脈血管和靜脈血管后組織貼壁即可本文檔共36頁；當前第27頁；編輯于星期二\1點20分八細胞試驗中注意的要點關于傳代問題atry配置時PH=7.4時效果較好btry使用時的溫度37度時效果較好，過低不易消化，導致細胞死亡ctry消化后離心重新垂懸細胞活性高本文檔共36頁；當前第28頁；編輯于星期二\1點20分d細胞傳代時要充分混勻上圖為傳代時沒有充分混勻導致細胞團聚嚴重本文檔共36頁；當前第29頁；編輯于星期二\1點20分關于血清問題aEC培養時血清含量不要高于20%。否則老化速度過快bsmc培養時原代血清含量控制在15%，傳代后控制10%左右，可有效控制其老化速度c干細胞培養時同SMC，在細胞旺盛期血清含量可進一步下調至5%本文檔共36頁；當前第30頁；編輯于星期二\1點20分關于染菌問題a常見的多為真菌感染，細胞瓶內可見白色菌絲。一旦出現此種情況，需要立刻丟棄細胞瓶。孵箱內重新進行滅菌處理b常見細菌感染如桿菌球菌支原體等c最近實驗室出現黑膠蟲染菌現象本文檔共36頁；當前第31頁；編輯于星期二\1點20分對于“黑膠蟲”的處理方法：

首先，血清買回來滅活前凍融應逐級凍融，即按照-20℃——4℃完全融化后，再置入水浴中，與室溫一起升高到56度，這樣的目的是避免溫度驟變，導致血清中的營養物質喪失活性。

第二，血清滅活后分裝保存。按照每次用血清的量分裝，盡量減少血清凍融的次數。分裝時注意無_第三，細胞培養時血清濃度稍大一些。通常細胞培養血清濃度為10%-15%，但如果血清凍融次數過多，那營養物質喪失活性，按15%的濃度配制事實上達不到15%的營養成分，故培養基配置時一般用18%-20%的血清。本文檔共36頁；當前第32頁；編輯于星期二\1點20分4關于細胞凍存a10%的DMSO、40%胎牛血清、50%培養基b4℃,40分鐘;-20℃,30分鐘;-80℃,24h后液氮罐保存

c如果凍存細胞多要先把凍存液配好放四度冰箱(因為DMSO放熱，剛加進去和容易損傷細胞，常溫DMSO對細胞毒性也大。)

d凍存的原則是慢凍快蘇

本文檔共36頁；當前第33頁；編輯于星期二\1點20分關于熒光染色實驗步驟

1細胞取出固定2h后，也可4℃保存多日后一起染色2將孔板內固定液（2.5%戊二醛或者4%多聚甲醛）吸出，用PBS清洗3次，每次5分鐘3用triton脫細胞液（0.1%濃度）包被樣品5分鐘，目的是增加細胞通透性，后用PBS清洗3次本文檔共36頁；當前第34頁；編輯于星期二\1點20分BSA封閉液封閉（具體看抗體的種屬來選擇包被液)37℃4h,也可以4℃過夜

Ⅰ抗30um/well即