第四章目的基因的分離與修飾Chapter4PreparationamdModificationsofTargetGene本文檔共187頁；當前第1頁；編輯于星期二\12點32分第一節基因的基本結構特征（CharacterofGeneBasicStructure）作為一個具有功能的結構基因應具備下列的元件：轉錄啟動區核糖體識別區編碼區（包括起始密碼子）開發閱讀框終止密碼子轉錄終止區本文檔共187頁；當前第2頁；編輯于星期二\12點32分一、原核生物基因的組成（CompositionofprokaryoticGene）1.1基因區：原核生物的基因多數以操縱子（Operon）形式存在，操縱子中的各個基因分別有各自的起始密碼子和終止密碼子。1.2啟動區：包括－35區和－10區1.3SD區：在起始密碼子ATG上游約10bp，富含嘌呤的保守區，與16SrRNA結合。1.4轉錄終止子和終止因子本文檔共187頁；當前第3頁；編輯于星期二\12點32分本文檔共187頁；當前第4頁；編輯于星期二\12點32分原核生物基因的組成基因區：多以操縱子形式存在，多順反子mRNA本文檔共187頁；當前第5頁；編輯于星期二\12點32分啟動區（promoter）：DNA分子可以與RNA聚合酶特異結合的部位，轉錄開始的部位。SD區：位于AUG上游4~13個NT處的富含嘌呤的序列，為AGGAGG。與16SrRNA的3’端(3’-UCCUCC-5’）,使AUG定位在P位。轉錄起點-35-10本文檔共187頁；當前第6頁；編輯于星期二\12點32分轉錄終止子(terminator)強終止子，也稱為內部終止子。弱終止子，又稱為ρ依賴終止子。本文檔共187頁；當前第7頁；編輯于星期二\12點32分二、真核生物基因的組成（CompositionofEukaryoticGene）2.1基因區：真核生物的基因含有內含子（Intron）和外顯子（Exon）。1.2轉錄啟動區：包括TATA框，CAAT框和GC框1.3Kozak區：

GCCACCATGG

1.4轉錄終止子本文檔共187頁；當前第8頁；編輯于星期二\12點32分真核生物基因的組成基因區：

割裂基因，外顯子，內含子本文檔共187頁；當前第9頁；編輯于星期二\12點32分轉錄啟動區單順反子mRNA轉錄終止子本文檔共187頁；當前第10頁；編輯于星期二\12點32分三、其他基因組基因的組成質粒的基因：不含內含子病毒的基因：以多順反子進行轉錄；有重疊基因；線粒體的基因：以多順反子進行轉錄；無SD序列；葉綠體的基因：以多順反子進行轉錄，含有類似于原核基因組的啟動子和SD序列本文檔共187頁；當前第11頁；編輯于星期二\12點32分四、基因的排列基因組中的基因一個接一個排列在DNA分子上，基因之間存在長度不等的間隔區，但某些生物基因組中的基因存在重疊、重復、加倍和重排等現象。重疊基因本文檔共187頁；當前第12頁；編輯于星期二\12點32分重復基因原核生物無重復序列低等真核生物10-20%高等植物80%高等動物50%重復基因本文檔共187頁；當前第13頁；編輯于星期二\12點32分加倍基因高等生物含倍性染色體，基因組為多倍。原核生物的單倍，質粒是多拷貝的本文檔共187頁；當前第14頁；編輯于星期二\12點32分1目的基因2目的基因的制備3目的基因的分離本文檔共187頁；當前第15頁；編輯于星期二\12點32分2目的基因的制備2.1直接分離法2.2基因文庫技術分離目的基因2.3基因組文庫分離法2.4cDNA基因文庫分離2.5PCR技術擴增目的基因2.6化學合成基因本文檔共187頁；當前第16頁；編輯于星期二\12點32分2.1直接分離法-限制性內切核酸酶酶切法該法適于從簡單基因組中分離目的基因，如質粒和病毒等DNA。BamHI和EcoRI酶切，可獲得目的基因。本文檔共187頁；當前第17頁；編輯于星期二\12點32分對于高等真核生物而言，基因組DNA十分龐大,基因可達數萬個，且基因組成結構復雜，除編碼序列，還有非編碼序列及調控序列，基因間還存在大量的間隔序列和重復序列，因此，單個目的基因在整個基因組中所占的比例極其微小，除少數例外，絕大多數基因難以直接分離得到。本文檔共187頁；當前第18頁；編輯于星期二\12點32分為了解決這個難題，一種可行的方法就是將這個基因擴增，增加成功分離目的基因的可能性。但是由于要分離的目的基因往往是未知基因，因此無法對它進行特異性擴增，只能對所有的基因進行擴增，也就是構建該生物材料的基因文庫，然后再根據不同的方法將所需的克隆篩選出來，最后分離得到目的基因。本文檔共187頁；當前第19頁；編輯于星期二\12點32分1）概念：基因文庫(genelibrary)：指某一生物類型全部基因的集合。以重組體形式出現。基因文庫由外源DNA片段、載體和宿主組成。一個理想的基因文庫應包括該生物染色體基因組全部遺傳信息(即全部DNA序列)。2.2基因文庫技術分離目的基因本文檔共187頁；當前第20頁；編輯于星期二\12點32分用途：

a）分離有用的目的基因

b）保存某種生物的全部基因本文檔共187頁；當前第21頁；編輯于星期二\12點32分2)基因文庫構建的基本程序：①DNA提取及片段化，或是cDNA的合成。②載體的選擇及制備。③DNA片段或cDNA與載體連接。④重組體轉化宿主細胞。⑤轉化細胞的篩選。本文檔共187頁；當前第22頁；編輯于星期二\12點32分限制性內切酶……克隆、轉化、培養、鑒定基因組DNA基因文庫本文檔共187頁；當前第23頁；編輯于星期二\12點32分基因文庫技術分離目的基因----未知基因

基因的克隆：獲得含重組DNA的宿主細胞克隆基因的分離:從文庫中分離出目的基因分離基因的鑒定:確定基因的結構及功能

本文檔共187頁；當前第24頁；編輯于星期二\12點32分3）基因文庫的類別基因組文庫與cDNA文庫基因組文庫：指將某生物的全部基因組DNA切割成一定長度的DNA片段克隆到某種載體上而形成的集合。基因組文庫分為：核基因組文庫、葉綠體基因組文庫及線粒體基因組文庫。本文檔共187頁；當前第25頁；編輯于星期二\12點32分cDNA文庫：是指某生物基因組轉錄的mRNA經反轉錄形成的cDNA片段與某種載體連接而形成的克隆的集合。cDNA(complementaryDNA，互補DNA)：是由生物的某一特定器官或特定發育時期細胞內的mRNA經體外反轉錄后形成的互補DNA。本文檔共187頁；當前第26頁；編輯于星期二\12點32分結構基因外顯子內含子轉錄、加工修飾mRNA本文檔共187頁；當前第27頁；編輯于星期二\12點32分2目的基因的制備2.1直接分離法2.2基因文庫技術分離目的基因2.3基因組文庫分離法2.4cDNA基因文庫分離2.5PCR技術擴增目的基因2.6化學合成基因本文檔共187頁；當前第28頁；編輯于星期二\12點32分2.3.1基因組文庫的概念和大小2.3.2λ噬菌體基因組文庫的構建2.3.3考斯質粒基因組文庫的構建2.3.4YAC基因組文庫的構建2.3基因組文庫的構建本文檔共187頁；當前第29頁；編輯于星期二\12點32分2.3.1基因組文庫(Genomiclibrary)的概念和大小概念：基因組文庫：某種生物基因組的全部遺傳信息通過克隆載體儲存于某一受體菌的群體中。本文檔共187頁；當前第30頁；編輯于星期二\12點32分基因組DNA文庫的類型根據所選用的載體可以分為：質粒文庫、噬菌體文庫、粘粒文庫、人工染色體文庫（細菌人工染色體文庫、酵母人工染色體文庫）。本文檔共187頁；當前第31頁；編輯于星期二\12點32分一個理想的基因組文庫要有足夠多的克隆子數，保證所有的基因都在克隆子群體中。以某生物基因組約3106kb，酶切片段平均長度15kb。理論克隆數：

基因組DNA總長

DNA片段平均長度

3106/15=2105基因組文庫的大小實際克隆數：DNA片段是隨機克隆的，因此理論值只是基因組文庫所需要的最小數值。一個完全的基因文庫就必須含有更多的重組體克隆數。

文庫理論克隆子數＝本文檔共187頁；當前第32頁；編輯于星期二\12點32分以上的例子，N值應是：ｌｎ（１－0.99）ｌｎ[1-（15/3106

）]

1975年，L.Clark和J.Carbon的經驗公式：文庫實際克隆子數N＝ｌｎ（１－ｐ）ｌｎ（１－ｆ）N:基因組文庫必需的克隆子數；P:文庫中目的基因出現的機率，一般情況下期望值99％，即0.99?:分離的DNA片段平均大小與基因組大小的比值。一個完全的基因文庫必須含有3-10倍于最低重組體克隆數的克隆。

N==91053106/15=2105本文檔共187頁；當前第33頁；編輯于星期二\12點32分基因組文庫應具有的克隆子數本文檔共187頁；當前第34頁；編輯于星期二\12點32分基因組DNA文庫的質量標準一個理想的基因組DNA文庫應具備下列條件：重組克隆的總數不宜過大，以減輕篩選工作的壓力載體的裝載量最好大于基因的長度，避免基因被分隔克隆克隆與克隆之間必須存在足夠長度的重疊區域，以利克隆排序克隆片段易于從載體分子上完整卸下重組克隆能穩定保存、擴增、篩選本文檔共187頁；當前第35頁；編輯于星期二\12點32分2.2.1基因組文庫的概念和大小2.2.2λ噬菌體基因組文庫的構建2.2.3考斯質粒基因組文庫的構建2.2.4YAC基因組文庫的構建2.2基因組文庫構建本文檔共187頁；當前第36頁；編輯于星期二\12點32分連接克隆載體的選擇質粒載體可承載15kbDNA片段

載體可承載23kbDNA片段

Cosmid載體可承載45kbDNA片段

YAC文庫4000kbBAC文庫300kb本文檔共187頁；當前第37頁；編輯于星期二\12點32分利用質粒載體構建基因組文庫該法簡單、快速、易于操作，但僅適合一些低等真核生物和原核生物。本文檔共187頁；當前第38頁；編輯于星期二\12點32分1）載體的特點：λ噬菌體是一種溫和噬菌體，可保存在大腸桿菌中。承載較大外源DNA，約23kb。有多種限制酶識別位點。

2.2.2構建λ噬菌體基因組文庫本文檔共187頁；當前第39頁；編輯于星期二\12點32分獲得含目的基因的DNA片段與λ噬菌體載體重組重組DNA的包裝轉化受體菌2）構建λ噬菌體基因組文庫的步驟重組克隆的挑選和保存本文檔共187頁；當前第40頁；編輯于星期二\12點32分目的基因DNA片段化方法：超聲波處理限制性內切酶部分酶切本文檔共187頁；當前第41頁；編輯于星期二\12點32分A機械切割法（超聲波處理）：優點：可獲得較均一的隨機片段，缺點：DNA片段呈平末端，片段不能直接用于克隆，需經末端修飾，連上接頭后再用限制性內切酶消化產生黏性末端。B限制酶消化：選用四或六核苷酸的限制性內切酶，如：（GATC）Sau3AI或MboI、BamHI(GGATCC)等。優點：直接產生黏性末端，缺點：片段的隨機性較差。本文檔共187頁；當前第42頁；編輯于星期二\12點32分基因組DNA的不完全酶切確定限制酶用量，改變酶切時間固定酶切時間，改變限制酶的用量本文檔共187頁；當前第43頁；編輯于星期二\12點32分載體的結構左臂：編碼噬菌體頭部和尾部蛋白的基因右臂：復制起始點、轉錄啟動區和其它必須基因左臂和右臂末端的Cos位點中央片段：不含必須基因本文檔共187頁；當前第44頁；編輯于星期二\12點32分基因文庫

Sau3AI或MboI密度梯度離心或電泳本文檔共187頁；當前第45頁；編輯于星期二\12點32分重組DNA分子的包裝:

a.λDNA的包裝物的制備:

使用的大腸桿菌菌株：

E.coliBHB2688-包裝蛋白

E.coliBHB2690-頭部蛋白本文檔共187頁；當前第46頁；編輯于星期二\12點32分

b.重組λDNA分子的包裝過程包裝制備物（-70℃）于冰上緩慢融化加入重組λDNA分子邊融化邊混合邊包裝離心除去細胞碎片λ顆粒于-70℃保存待用5)基因組文庫的保存

包裝的λ顆粒感染E.coli

培養分離λ顆粒-70℃保存本文檔共187頁；當前第47頁；編輯于星期二\12點32分DNA片段之間的連接具互補黏性末端片段之間的連接具平末端DNA片段之間的連接

DNA片段末端修飾后進行連接

DNA片段加連桿或銜接物后連接回顧本文檔共187頁；當前第48頁；編輯于星期二\12點32分（1）具互補黏性末端片段之間的連接基本原理：

DNA連接酶連接具有互補粘性末端DNA片段。回顧本文檔共187頁；當前第49頁；編輯于星期二\12點32分（2）具平末端DNA片段之間的連接基本原理：直接用T4DNA連接酶連接.回顧本文檔共187頁；當前第50頁；編輯于星期二\12點32分（3）DNA片段末端修飾后進行連接1)DNA末端同聚物加尾后進行連接回顧本文檔共187頁；當前第51頁；編輯于星期二\12點32分2)黏性末端修飾成互補粘端或平末端后進行連接①修平：用核酸酶切除雙鏈DNA分子的突出核苷酸，修平后用T4連接酶作平末端連接。②補平：用Klenow酶將粘端補平，產生平末端或匹配粘端，再用T4連接酶進行連接。回顧本文檔共187頁；當前第52頁；編輯于星期二\12點32分3)DNA片段5’端脫磷酸化后連接基本原理：堿性磷酸酶催化去除DNA的5’磷酸根，防止DNA的自身環化或連接形成多聚體。回顧本文檔共187頁；當前第53頁；編輯于星期二\12點32分（4）DNA片段加連桿或銜接物后連接

連桿(linker)：指用化學方法合成的一段由10-12個核苷酸組成的、具有一個或數個限制酶識別位點的寡核苷酸片段。回顧本文檔共187頁；當前第54頁；編輯于星期二\12點32分DNA銜接物（adaptor）：由化學合成的一端具有某種限制酶的粘性末端而另一端為平末端的雙鏈寡聚核苷酸短片段。回顧本文檔共187頁；當前第55頁；編輯于星期二\12點32分2.3.1基因組文庫的概念和大小2.3.2λ噬菌體基因組文庫的構建2.3.3考斯質粒基因組文庫的構建2.3.4YAC基因組文庫的構建

2.3基因組文庫構建本文檔共187頁；當前第56頁；編輯于星期二\12點32分基因文庫

Sau3AI或MboI本文檔共187頁；當前第57頁；編輯于星期二\12點32分2.3.3構建考斯質粒基因組文庫1）特點：優點：具有質粒的性質，可在細菌中保存和大量復制。含有Cosmid位點，可進行體外包裝；克隆容量很高，45kb，載體的分子較小，在10kb以下。本文檔共187頁；當前第58頁；編輯于星期二\12點32分2）基因組文庫的構建過程本文檔共187頁；當前第59頁；編輯于星期二\12點32分缺點：篩選困難；重組效率低；文庫不易保存。本文檔共187頁；當前第60頁；編輯于星期二\12點32分2.3.1基因組文庫的概念和大小2.3.2λ噬菌體基因組文庫的構建2.3.3考斯質粒基因組文庫的構建2.3.4YAC基因組文庫的構建

2.3基因組文庫構建本文檔共187頁；當前第61頁；編輯于星期二\12點32分2.3.4構建YAC基因組文庫1）載體的特點：YAC載體的基本組成部分：*自主復制序列(ARS)*著絲粒序列（CEN）*端粒序列（TEL）*選擇標記基因*多克隆位點（MCS）優點：承載長達1000kb甚至3000kb的外源DNA片段，本文檔共187頁；當前第62頁；編輯于星期二\12點32分2）基因組文庫的構建過程本文檔共187頁；當前第63頁；編輯于星期二\12點32分2目的基因的制備2.1直接分離法2.2基因文庫技術分離目的基因

2.3基因組文庫分離法2.4cDNA基因文庫分離2.5PCR技術擴增目的基因2.6化學合成基因本文檔共187頁；當前第64頁；編輯于星期二\12點32分2.4cDNA基因文庫的構建及目的基因分離2.4.1cDNA基因文庫的概念cDNA文庫：是指某生物基因組轉錄的mRNA經反轉錄形成的cDNA片段與某種載體連接而形成的克隆的集合。2.4.2cDNA基因文庫的構建2.4.3mRNA豐度與cDNA基因文庫大小的關系2.4.4cDNA克隆的優越性本文檔共187頁；當前第65頁；編輯于星期二\12點32分2.4.2cDNA基因文庫的構建主要步驟：①從生物體或細胞中提取mRNA；②利用逆轉錄酶合成cDNA的第一條鏈；③利用DNA聚合酶，以cDNA第一條鏈作為模板，用適當引物合成cDNA第二條鏈，④cDNA與載體的重組后導入大腸桿菌宿主細胞增值。本文檔共187頁；當前第66頁；編輯于星期二\12點32分mRNA的提取全長mRNA具有一個polyA的3’末端，可以被用于mRNA的分離；用寡聚纖維素柱，選擇性地吸附mRNA純化本文檔共187頁；當前第67頁；編輯于星期二\12點32分①分離細胞總RNA，從中分離純化mRNA；②合成cDNA的第一條鏈：

a.oligo(dT)引導的DNA合成法：原理：真核mRNA分子具有poly(A)尾巴，加入oligo(dT)短片段，由反轉錄酶合成cDNA的第一鏈。缺陷：逆轉錄酶通常無法到達mRNA分子的5’-末端，必須從3’-末端開始合成cDNA。本文檔共187頁；當前第68頁；編輯于星期二\12點32分b.隨機引物引導的cDNA合成法：原理：隨機引物：人工合成的含有各種可能的排列順序的六核苷酸片段的混合物，可以與任何核酸片段雜交，并作為聚合酶反應的引物。應用這種混合引物，cDNA的合成從mRNA模板的許多位點同時發生，從而保證得到mRNA的編碼區和5’端旁側。多用于mRNA分子較大且3’端非編碼區序列較長；AAAAAAAAAAAA3’

5’3’本文檔共187頁；當前第69頁；編輯于星期二\12點32分2.4.2cDNA基因文庫的構建主要步驟：①從生物體或細胞中提取mRNA；②利用逆轉錄酶合成cDNA的第一條鏈；③利用DNA聚合酶，以cDNA第一條鏈作為模板，用適當引物合成cDNA第二條鏈，④cDNA與載體的重組后導入大腸桿菌宿主細胞增值。本文檔共187頁；當前第70頁；編輯于星期二\12點32分③合成cDNA第二條鏈a.自身引導合成法b.大腸桿菌RNaseH酶降解取代法c.oligo(dG)寡聚引物引導法d.PCR法

本文檔共187頁；當前第71頁；編輯于星期二\12點32分a.自身引導合成法：原理：單鏈cDNA的3’端能夠形成發夾狀的結構作為引物，在大腸桿菌聚合酶I、Klenow或反轉錄酶的作用下，合成cDNA的第二鏈。缺點：S1核酸酶切割發夾狀結構會丟失對應于mRNA5’端的序列。

S1核酸酶偶爾破壞合成的雙鏈cDNA分子。本文檔共187頁；當前第72頁；編輯于星期二\12點32分b.大腸桿菌RNaseH酶降解取代法-置換合成法原理：以第一鏈合成產物cDNA-mRNA作為切口平移的模板，

RNA酶H對mRNA造成切口和缺口，產生一系列RNA引物，大腸桿菌DNA聚合酶I

的作用下合成cDNA的第二鏈。本文檔共187頁；當前第73頁；編輯于星期二\12點32分優點：a）合成cDNA的效率高

b）直接利用第一鏈的反應產物，不需純化

c）避免使用S1核酸酶來切割雙鏈cDNA本文檔共187頁；當前第74頁；編輯于星期二\12點32分c.oligo(dG)寡聚引物引導法oligo(dG)作為引物可與cDNA第一鏈3’末端的poly(T)序列相結合，有效的引發cDNA第二鏈的合成。本文檔共187頁；當前第75頁；編輯于星期二\12點32分d.RCR法

以cDNA的第一條鏈為模板設計引物。優點：可獲得多拷貝的雙鏈cDNA;不用純化mRNA;同聚物尾巴保護末端.

本文檔共187頁；當前第76頁；編輯于星期二\12點32分2.4.2cDNA基因文庫的構建主要步驟：①從生物體或細胞中提取mRNA；②利用逆轉錄酶合成cDNA的第一條鏈；③利用DNA聚合酶，以cDNA第一條鏈作為模板，用適當引物合成cDNA第二條鏈，④cDNA與載體的重組后導入大腸桿菌宿主細胞增值。本文檔共187頁；當前第77頁；編輯于星期二\12點32分④cDNA與載體的重組后導入大腸桿菌宿主細胞增值。

cDNA末端的處理由于大片段的平末端連接效率非常低，因此為了避免用平末端與載體連接，對雙鏈cDNA的末端進行加工.方法：添加特異性核酸接頭以形成適合于克隆的黏性末端末端轉移酶—可以向cDNA末端加上與克隆載體末端互補的尾部本文檔共187頁；當前第78頁；編輯于星期二\12點32分本文檔共187頁；當前第79頁；編輯于星期二\12點32分本文檔共187頁；當前第80頁；編輯于星期二\12點32分2.4cDNA基因文庫的構建及目的基因分離2.4.1cDNA基因文庫的概念2.4.2cDNA基因文庫的構建2.4.3mRNA豐度與cDNA基因文庫大小的關系2.4.4cDNA克隆的優越性本文檔共187頁；當前第81頁；編輯于星期二\12點32分2.4.3mRNA豐度和cDNA基因文庫大小的關系cDNA文庫中儲存某種基因的概率與總mRNA中這種基因的mRNA的拷貝數有關。某種mRNA的拷貝數越多，意味著cDNA文庫中儲存該基因的概率越大，越容易分離出來。

某種mRNA在不同組織不同發育時期的豐度不同。本文檔共187頁；當前第82頁；編輯于星期二\12點32分

mRNA的豐度與文庫克隆子數的關系

N=ln(1-P)/ln(1-f)N:所需克隆數;P:要求的概率;f:一種mRNA的豐度與總mRNA的比值本文檔共187頁；當前第83頁；編輯于星期二\12點32分哺乳動物細胞含有10,000-30,000種不同的mRNA分子，某些mRNA分子的拷貝數很低甚至只有一個拷貝。要富集或增大克隆數目來保證構建的文庫中能夠含有它們的克隆。本文檔共187頁；當前第84頁；編輯于星期二\12點32分1)按大小對mRNA進行分級分離通過瓊脂糖凝膠電泳分離大小不同的mRNA分子,該方法的分離效果最好，但從凝膠中回收的得率較低.蔗糖梯度離心：分離不同分子量的mRNA.本文檔共187頁；當前第85頁；編輯于星期二\12點32分2)cDNA的分級分離*mRNA通過反轉錄形成cDNA，在插入到克隆載體前，通過瓊脂糖凝膠電泳，將不同大小的cDNA分子分離開來。*優點：

a）避免了分離過程中mRNA被污染的RNA酶降解

b）增加了獲得全長cDNA克隆的概率

c）獲得更準確的分級分離效果（分子量）本文檔共187頁；當前第86頁；編輯于星期二\12點32分3）多聚核糖體免疫學純化法使用抗體純化合成目的多肽的多聚核糖體。將正在合成的新生多肽鏈的多聚核糖體結合到免疫親和柱上，隨后用EDTA將多聚核糖體解離下來，并通過Oligo(dT)層析分離mRNA,利用該方法可將目的mRNA純化數千倍。本文檔共187頁；當前第87頁；編輯于星期二\12點32分2.4cDNA基因文庫的構建及目的基因分離2.4.1cDNA基因文庫的概念2.4.2cDNA基因文庫的構建2.4.3mRNA豐度與cDNA基因文庫大小的關系2.4.4cDNA克隆的優越性本文檔共187頁；當前第88頁；編輯于星期二\12點32分2.4.4cDNA克隆的優越性①cDNA文庫以mRNA為材料，特別適用于某些RNA病毒等的基因組結構研究及有關基因的克隆分離。②cDNA文庫的篩選比較簡單易行。③每一個cDNA文庫都含有一種mRNA序列，這樣在目的基因的選擇中出現假陽性的概率就會比較低，因此陽性雜交信號一般都是有意義的，由此選擇出來的陽性克隆將會含有目的基因。④cDNA文庫可用于在細菌中能進行表達的基因的克隆，直接應用于基因工程操作。⑤cDNA克隆還可用于真核細胞mRNA的結構和功能研究。本文檔共187頁；當前第89頁；編輯于星期二\12點32分局限性：1）cDNA文庫包含的遺傳信息比基因組文庫的少，且受細胞來源或發育時期的影響。2）不能直接獲得基因的內含子序列和基因編碼區外大量的調控序列的結構與功能方面的信息。3）分離到的多為高豐度mRNA的產物。本文檔共187頁；當前第90頁；編輯于星期二\12點32分2目的基因的制備2.1直接分離法2.2基因文庫技術分離目的基因

2.3基因組文庫分離法2.4cDNA基因文庫分離2.5PCR技術擴增目的基因2.6化學合成基因本文檔共187頁；當前第91頁；編輯于星期二\12點32分PCR，PolymeraseChainReaction

（1）反應體系：含有目的基因或序列的DNA模板熱穩定的DNA聚合酶（Taq酶）一對脫氧寡核苷酸引物（primer）4種脫氧核苷三磷酸(dNTP)Buffer及Mg2+等本文檔共187頁；當前第92頁；編輯于星期二\12點32分5Primer15Primer2Cycle2Cycle155

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5

5TemplateDNA55

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55（2）基本工作原理本文檔共187頁；當前第93頁；編輯于星期二\12點32分Cycle355

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555

525～30次循環后，模板DNA的含量可以擴大100萬倍以上。本文檔共187頁；當前第94頁；編輯于星期二\12點32分（3）PCR的基本反應步驟變性95?C延伸72?C退火Tm-5?C本文檔共187頁；當前第95頁；編輯于星期二\12點32分如果知道目的基因的全序列或其兩側的序列，可以合成一對與模板DNA互補的引物，利用PCR技術擴增出含目的基因的DNA片段。2.5利用PCR擴增目的基因本文檔共187頁；當前第96頁；編輯于星期二\12點32分局限性：必須知道側接靶序列的核苷酸序列，以制備引物。常規PCR擴增片段一般在lkb以內。未知序列的目的基因和大片段基因的擴增，則需要特殊類型的PCR

：套式PCR、反向PCR、不對稱PCR、多重PCR、錨定PCR、長程PCR、反轉錄PCR、熒光定量PCR和原位PCR等。本文檔共187頁；當前第97頁；編輯于星期二\12點32分1）Nestedpcr （套式PCR）特點:

需要設計兩對引物，一對引物擴增稍長片段，在這一擴增范圍內再設計一對引物，擴增的產物是以第一對引物的產物為模版套式PCR

通過內外引物進行兩次擴增，大大提高了檢測的敏感性本文檔共187頁；當前第98頁；編輯于星期二\12點32分2）反向PCR（InversePCR）基本原理：擴增一段已知序列旁側的DNA，在引物外側合成DNA。本文檔共187頁；當前第99頁；編輯于星期二\12點32分已知序列未知序列未知序列連接酶本文檔共187頁；當前第100頁；編輯于星期二\12點32分3）不對稱PCR

目的：擴增產生特異長度的單鏈DNA。方法：采用兩種不同濃度的引物，最佳比例一般是0.01∶0.5μM。

本文檔共187頁；當前第101頁；編輯于星期二\12點32分

高濃度引物低濃度引物本文檔共187頁；當前第102頁；編輯于星期二\12點32分以其中的mRNA作為模板，以Oligo（dT）或隨機引物或基因特異性為引物，利用逆轉錄酶反轉錄成cDNA。以cDNA為模板進行PCR擴增，而獲得目的基因或檢測基因表達

4）RT-PCR:提取組織或細胞中的總RNA本文檔共187頁；當前第103頁；編輯于星期二\12點32分5）多重PCR：在一個反應體系中使用一對以上引物的PCR稱，其結果是產生多個PCR產物，用于檢測特定基因序列的存在或缺失。電泳引物本文檔共187頁；當前第104頁；編輯于星期二\12點32分6）原位PCR原位雜交PCR首先將樣品組織切片或細胞涂片，然后固定在載玻片上；適當預處理后，將細胞核內的DNA加熱變性形成兩條單鏈DNA。針對待檢測的選定序列設計一對引物，直接將引物dNTP緩沖液及TaqDNA聚合酶加到載玻片上在原位聚合酶儀內進行PCR擴增反應完畢后將PCR產物固定在載玻片上用相應的檢測信號系統進行檢測。可以檢測組織細胞中微量DNA或RNA，且可精確定位本文檔共187頁；當前第105頁；編輯于星期二\12點32分人類染色體端粒DNA的熒光原位雜交照片本文檔共187頁；當前第106頁；編輯于星期二\12點32分7）定量PCR：熒光實時定量PCR技術是指在PCR反應體系中加入熒光基團，利用熒光信號累積實時監測整個PCR進程，最后通過標準曲線對未知模板進行定量分析的方法。常用的熒光標記方法：非特異檢測——雙鏈DNA內插式熒光染料；代表是SYBRGreenI熒光染料擴增序列專一檢測——主要指TaqMan熒光探針熒光染料技術成本低廉，實驗設計簡便；而探針雜交技術在原理上嚴格，所得數據特異性高、更為精確本文檔共187頁；當前第107頁；編輯于星期二\12點32分SYBRGreenI工作原理：

SYBRGreen1

染料只有和雙鏈DNA結合后才發熒光。單鏈DNA、變性DNA:無熒光信號GTTTGGCCCCCCCAAAGGGACTTGATAGCATCGTAA本文檔共187頁；當前第108頁；編輯于星期二\12點32分TaqMan探針法： 指PCR擴增時在加入一對引物的同時另外加入一個特異性的熒光探針：該探針只與模板特異性地結合，其結合位點在兩條引物之間。探針的5′端標記有熒光報告基團(Reporter,R)，3′端標記有熒光淬滅基團(Quencher,Q。當探針完整的時候，5′端報告基團經儀器光源激發的熒光正好被近距離的3′端熒光基團淬滅，儀器檢測不到5′端報告基團所激發的熒光信號與目標序列互補本文檔共187頁；當前第109頁；編輯于星期二\12點32分

PCR擴增過程中：Taq酶在鏈延伸時遇到與模板結合的探針，其5′-3′外切酶活性（此活性是雙鏈特異性的，游離的單鏈探針不受影響）就會將切割探針釋放5′端報告基團游離于反應體系中，遠離3′端熒光淬滅基團的屏蔽，5′端報告基團受激發所發射的熒光信號就可以被探頭檢測到。每擴增一條DNA鏈，就有一個熒光分子形成，實現了熒光信號的累積與PCR產物形成完全同步。報告信號的強度就代表了模板DNA的拷貝數本文檔共187頁；當前第110頁；編輯于星期二\12點32分2目的基因的制備2.1直接分離法2.2基因文庫技術分離目的基因

2.3基因組文庫分離法2.4cDNA基因文庫分離2.5PCR技術擴增目的基因2.6化學合成基因本文檔共187頁；當前第111頁；編輯于星期二\12點32分2.6化學合成法獲取目的基因由已知氨基酸序列推測可能的DNA序列本文檔共187頁；當前第112頁；編輯于星期二\12點32分基因的化學合成20世紀70年代，Khorana提出，

提出體外擴增DNA1922-）印度-美國化學家遺傳密碼的破譯，獲得1968年諾貝爾醫學和生理學獎。本文檔共187頁；當前第113頁；編輯于星期二\12點32分DNA合成儀的基本工作原理是：將要合成的DNA片段3’端的第一個核苷酸固定于不溶性載體上．該核苷酸開始與另一核苷酸進行縮合反應，形成二核苷酸分子通過酸或堿洗脫其一端的保護基團，再次與另一個5’或3’保護的核苷酸分子進行第二次縮合反應，形成三核苷酸分子；再用同樣的步驟與下一個核苷酸進行循環反應。每循環反應一次就接長一個核苷酸，一般一個循環只需幾分鐘。接長的鏈始終被固定在不溶的固相載體上，合成結束后，將寡核苷酸鏈從固相載體上洗脫下來。本文檔共187頁；當前第114頁；編輯于星期二\12點32分化學合成法優缺點優點：準確性極高，合成速度較快缺點：合成的寡核苷酸鏈長度短(不大于80個堿基)一般用于PCR引物、寡核苷酸探針、人工接頭、較小基因的合成。對于超過該法合成范圍的寡核苷酸鏈的合成，可采用分段合成法，再連接組裝成完整的基因。本文檔共187頁；當前第115頁；編輯于星期二\12點32分圖1基因合成的全片段酶促連接法本文檔共187頁；當前第116頁；編輯于星期二\12點32分圖2基因合成的酶促填充法本文檔共187頁；當前第117頁；編輯于星期二\12點32分2目的基因的制備直接分離法基因文庫技術分離目的基因基因組文庫分離法

cDNA基因文庫分離

PCR技術擴增目的基因化學合成基因本文檔共187頁；當前第118頁；編輯于星期二\12點32分基因文庫和cDNA文庫的建立組織可克隆之DNA載體DNAcDNAmRNA部分或完全酶解DNADNA長度分級甲基化，雙鏈接頭DNADNA與載體連接引入大腸桿菌鑒定文庫的克隆數和特性擴增后供長期儲存篩選出所需要的克隆從中分離出目的基因本文檔共187頁；當前第119頁；編輯于星期二\12點32分基因文庫技術分離目的基因

基因的克隆：獲得含重組DNA的宿主細胞克隆基因的分離:從文庫中分離出目的基因分離基因的鑒定:

確定基因的結構及功能

測序自動測序儀功能分析預測軟件本文檔共187頁；當前第120頁；編輯于星期二\12點32分1目的基因2目的基因的制備3目的基因的分離本文檔共187頁；當前第121頁；編輯于星期二\12點32分基因文庫的篩選和基因分離：在成千上萬的克隆中僅極少數含目的基因，且大多數基因的產物不具有可選擇的表型特征，如何篩選？：(1)用特異探針進行分子雜交；(2)用免疫和生化方法來檢測基因產物；(3)用特異性引物進行PCR擴增。本文檔共187頁；當前第122頁；編輯于星期二\12點32分雜交：親緣關系很近的不同來源的DNA單鏈或RNA單鏈與DNA單鏈之間通過堿基互補形成雜交分子的過程。分子雜交本文檔共187頁；當前第123頁；編輯于星期二\12點32分分子探針標記核酸分子探針：用同位素、生物素或熒光染料標記一小段已知核苷酸序列作為探針，探針的序列如果與DNA或RNA序列互補，就可以探知核酸分子。粗線表示分子探針檢測方法：同位素標記、熒光標記、顏色標記本文檔共187頁；當前第124頁；編輯于星期二\12點32分平板雜交/菌落雜交技術本文檔共187頁；當前第125頁；編輯于星期二\12點32分3目的基因的分離3.1編碼產物已知的目的基因3.2編碼產物未知的目的基因本文檔共187頁；當前第126頁；編輯于星期二\12點32分3目的基因的分離3.1編碼產物已知的目的基因根據特異蛋白分離目的基因氨基酸順序反推核苷酸序列蛋白免疫反應功能互補法分離基因根據已知基因序列或同源基因序列分離目的基因3.2編碼產物未知的目的基因本文檔共187頁；當前第127頁；編輯于星期二\12點32分3.1已知編碼產物的目的基因分離3.1.1根據特異蛋白分離目的基因功能克隆法：依賴于基因表達產物及其生物功能進行基因克隆。①分析特異蛋白質中氨基酸順序，合成寡核苷酸探針，從文庫中分離出相應基因。本文檔共187頁；當前第128頁；編輯于星期二\12點32分如：Leu-Val-Phe-His-Asp-Ala六肽

對應mRNAQUN-GUN-UUQ-CAQ-GAQ-GCNN=ACGT/U探針序列

CAN-AAP-GTP-CTP-CGQ=CT/UP=AG32種14聚體混合物，其中必有一種14聚體與待測DNA完全互補本文檔共187頁；當前第129頁；編輯于星期二\12點32分利用這種方法首次人工合成了胰島素基因。雖然在早期采用這種方式已經成功地克隆了許多基因。局限性：兼并密碼子效率低未知基因及產物本文檔共187頁；當前第130頁；編輯于星期二\12點32分②制備特定的蛋白質抗體及蛋白質功能檢測，篩選相應的基因。待分離基因的表達產物—蛋白質純化和制備出相應抗體。再用特異的蛋白質抗體篩選含有目的基因的cDNA表達文庫，分離含目的基因的克隆。局限性：特異蛋白必須是已知且分離純化的。將菌落或噬菌斑原位復制到膜上處理之后蛋白質暴露，與第一抗體溫育漂洗未結合的抗體，加入經標記的第二抗體能與第一抗體結合本文檔共187頁；當前第131頁；編輯于星期二\12點32分3.1.2功能互補法分離基因基本原理：利用被克隆的DNA片段與寄主細胞的染色體DNA在功能上有同源互補性來分離基因。例如：營養缺陷型互補基因。本文檔共187頁；當前第132頁；編輯于星期二\12點32分實例：基因組文庫DNA→

轉化釀酒酵母細胞（leu2,Leu-）→轉化細胞（leu2/LEU2，Leu+）→LEU2基因Leu2(基因型),Leu-（表型）營養缺陷型特點：在選擇培養基（一般為基本培養基）上不生長本文檔共187頁；當前第133頁；編輯于星期二\12點32分3.1.3根據已知基因序列或同源基因序列分離目的基因基本原理：從DNA序列數據庫（Genbank

等）中查找有關基因的序列，以此為核酸探針進行雜交篩選。對雜交后的陽性克隆子重組DNA進行測序，與已知基因的核苷酸序列進行比較和鑒定，確定是否是待分離的目的基因。本文檔共187頁；當前第134頁；編輯于星期二\12點32分舉例：菠菜的基因組中尋找耐受重金屬基因對應mRNAAUC-GUG-UUA-CAU-GAA-GCA

（擬南芥/水稻的Genbank

）探針序列

TAG-CAC-AAT-GTA-CTT-CGT

缺陷：分離的基因一般不是新的基因。本文檔共187頁；當前第135頁；編輯于星期二\12點32分3目的基因的分離3.1編碼產物已知的目的基因根據特異蛋白分離目的基因氨基酸順序反推核苷酸序列蛋白免疫反應功能互補法分離基因根據已知基因序列或同源基因序列分離目的基因3.2編碼產物未知的目的基因本文檔共187頁；當前第136頁；編輯于星期二\12點32分3.2編碼產物未知的基因分離采用特殊手段獲得探針，再從文庫中分離；差別雜交(differentialhybridization)，減法雜交（subtractivehybridization）DNA標簽法，也叫DNA插入誘導法mRNA差別顯示技術,DD-PCR酵母雙雜交系統染色體步查法本文檔共187頁；當前第137頁；編輯于星期二\12點32分3.2.1差別雜交法基本原理：利用兩組細胞mRNA種類的差異，分離克隆差異mRNA所對應的cDNA，用于分離克隆新基因；分別制備兩種細胞群體的mRNA提取物，以這兩種總mRNA（或其cDNA)，分別篩選由表達目的基因的細胞群體構建的cDNA文庫。本文檔共187頁；當前第138頁；編輯于星期二\12點32分舉例：分離受生長因子調節的基因1）構建的cDNA文庫涂鋪在平板上2）一式兩份轉至膜上。3）用血清刺激的和未刺激的細胞的po1y(A)RNA，經反轉錄制備放射性標記的總cDNA探針4）分別與已轉移噬菌體DNA的膜雜交5）通過對雜交結果的仔細對比分析，可以找到那些僅與血清刺激細胞總cDNA探針雜交的或雜交信號明顯強烈的克隆，它們代表了血清誘導表達的mRNA。本文檔共187頁；當前第139頁；編輯于星期二\12點32分根據目的基因特異性表達進行分離：有的基因只有在某生物的一定的生長發育階段或一定的器官中才能表達。例如，待分離的目的基因只有在植物的根中才能有效表達，而在其他器官中(如植物的葉)不能表達。因此用根構建的cDNA文庫中含有攜帶目的基因cDNA的克隆子，而用葉構建的cDNA文庫中不含攜帶目的基因cDNA的克隆子。根據這一性質以根和葉的總mRNA(或它們的cDNA)為探針，分別對兩種cDNA文庫進行雜交比較(圖)。用根的總mRNA(或它們的cDNA)制備的探針對這兩個cDNA文庫進行雜交時，所有克隆子都呈陽性反應；而用葉的總mRNA(或它們的cDNA)制備的探針進行雜交時，葉cDNA文庫中的所有克隆子都呈陽性反應，根cDNA文庫中的某些克隆子呈陰性反應。最后比較4份雜交結果，便可以在根cDNA文庫轉膜的大量菌落中挑選出含目的基因的菌落。分離特定組織中表達的基因本文檔共187頁；當前第140頁；編輯于星期二\12點32分差示雜交法的特點：不需要知道目的基因的序列特別適用于分離在特定組織中表達的基因特定發育階段表達的基因受生長因子調節的基因或者分離經特殊處理而被誘發表達的基因。本文檔共187頁；當前第141頁；編輯于星期二\12點32分差示雜交法的局限1）反應靈敏性不夠高，不適用于低豐度的mRNA的目的基因。2）需要篩選大量的雜交濾膜，鑒定大量噬菌斑，十分費時耗力；3）重復性差。本文檔共187頁；當前第142頁；編輯于星期二\12點32分3.2.2減法雜交基本原理：盡量消除兩種樣品共同存在的基因序列，從而有效富集目的基因序列，提高基因篩選分離的敏感性。本文檔共187頁；當前第143頁；編輯于星期二\12點32分1）mRNA減法雜交從表達目的基因的組織提取mRNA并反轉錄為cDNA，再與無目的基因表達的組織提取的mRNA做過量雜交，兩者均表達的基因產物將形成cDNA/mRNA雜交分子，而特異mRNA反轉錄的cDNA仍單鏈，將其分離即為差異表達序列。本文檔共187頁；當前第144頁；編輯于星期二\12點32分圖用遞減文庫和探針分離T細胞受體基因從T細胞提取RNA假定編碼T細胞受體的基因僅在T細胞中表達而在B細胞中不表達用從T細胞制備的單鏈cDNA與過量的B細胞poly(A)RNA雜交，在這兩種類型細胞中均表達的分子將以cDNA-RNA的形式發生雜交，那些僅在T細胞中表達的cDNA分子(約占總mRNA的2％)仍以游離的單鏈形式存在。從B細胞制備RNA用羥磷灰石柱分離這種雜交混合物，在一定洗脫條件下，DNA-RNA雜交雙鏈分子結合在柱上，單鏈cDNA則從柱中流出。回收這些T細胞特異的單鏈cDNA分子并把它們轉變成雙鏈，再克隆至λ噬菌體載體中，產生一個約含5000個克隆的遞減文庫。本文檔共187頁；當前第145頁；編輯于星期二\12點32分2）基因組DNA減法雜交可以用來分離缺失突變基因。本文檔共187頁；當前第146頁；編輯于星期二\12點32分3.2.3mRNA差別顯示技術mRNAdifferentialdisplaybyRCR,DD-PCR基因的差異表達：在生物個體發育不同階段，或不同的組織與細胞中或不同環境下，基因表達差異。即不同基因有序的時空表達方式。差異顯示PCR(DD-PCR)：通過對特定組織類型的總mRNA進行PCR擴增、電泳，并找出待測組織和對照之間的特異擴增條帶。本文檔共187頁；當前第147頁；編輯于星期二\12點32分差異顯示PCR(DD-PCR）的引物:3’-端錨定引物，5’-T11MN或5’-T12MN通式表示。其中M為除了T以外的任何一種核苷酸（即A、G或C），而N則為任何一種核苷酸（即A、G、C或T），故MN共有12種不同的排列組合方式。5’端隨機引物：10個核苷酸長度，20種全部的240組引物，以反轉錄第一鏈為模板進行PCR擴增，可以得到20000條DNA帶，基本涵蓋了一定發育階段某種類型細胞所表達的全部mRMA。本文檔共187頁；當前第148頁；編輯于星期二\12點32分DD－PCR本文檔共187頁；當前第149頁；編輯于星期二\12點32分本文檔共187頁；當前第150頁；編輯于星期二\12點32分切割差異條帶，回收cDNA制備探針在基因文庫中篩選，獲得該差異片段對應的全長cDNA或者完整基因本文檔共187頁；當前第151頁；編輯于星期二\12點32分優點：

1)可以同時比較多個樣品表達的差異；

2)可以同時檢測“上游”及“下游”的基因；

3)檢測靈敏度高，所需樣品少，經PCR擴增一些低峰度的mRNA也可以被檢測出來；

4)結合使用了PCR和序列膠電泳分析兩項技術，使本方法顯得較單方便。本文檔共187頁；當前第152頁；編輯于星期二\12點32分局限性：1)假陽性比例高（50%～75%）；同一長度的條帶，含有多種DNA序列；鄰近條帶回收時，造成人為誤差；

mRNA3’-端序列保守性高，而常用3’-端cDNA作探針。2)擴增的差別條帶分子長度比較短小（110～450bp）；

本文檔共187頁；當前第153頁；編輯于星期二\12點32分Ac/Ds玉米轉座子

本文檔共187頁；當前第154頁；編輯于星期二\12點32分

T-DNA插入基因組

本文檔共187頁；當前第155頁；編輯于星期二\12點32分3.2.4DNA標簽法也稱DNA插入誘變法分離目的基因。基本原理：一段特定DNA序列插入到植物基因的內部或鄰近位置時，會誘導該基因發生突變形成突變體植株，或者在插入位置產生一個新基因。以插入序列DNA分子探針，從突變體植株的基因組DNA文庫中篩選突變基因片段。再以此為探針，從野生型植株中克隆出該目的基因。

本文檔共187頁；當前第156頁；編輯于星期二\12點32分轉座子載體構建↓

轉化植物（T1，雜合子)收獲T2種子↓

篩選T2，獲突變體↓

提取其DNA,建立基因組文庫↓

以轉座子為探針，篩選突變體文庫↓

PCR技術克隆轉座子兩側的DNA序列↓

利用側翼DNA序列作探針從野生型植物的基因組文庫中釣取基因↓

基因功能的驗證

轉座子標簽法克隆基因本文檔共187頁；當前第157頁；編輯于星期二\12點32分

3.2.5酵母雙雜合系統

---利用生物大分子之間的互作分離基因轉錄激活因子參與真核生物的基因轉錄。ADBD許多真核生物的轉錄激活因子都是由兩個結構上可以分開的、功能上相互獨立的結構域組成.本文檔共187頁；當前第158頁；編輯于星期二\12點32分酵母雙雜交法原理:利用釀酒酵母的GAL4蛋白質N-端和C-端分別融合的兩種蛋白質相互作用可激活具有UAS（upstreamactivatingsequence，上游激活序列）報告基因表達篩選目的基因的方法。i.

GAL4蛋白質是一個調控基因，控制半乳糖利用酶類基因的表達，這些基因的5’-端存在UAS序列；ii.

GAL4存在兩個結構域：N-端(1-147)具有UAS-DNA結合域(DNA-bindingdomain,BD),C-端(768-881)具有轉錄激活結構域(transcriptionalactivationdomain,AD)。這兩個結構域可以單獨起作用。ADBD本文檔共187頁；當前第159頁；編輯于星期二\12點32分本文檔共187頁；當前第160頁；編輯于星期二\12點32分

iii.

如果AD和BD分別與兩個基因編碼序列融合，且兩種蛋白質能相互發生結合，就可導致GAL1-LacZ基因的表達。其中與AD融合的基因稱之為釣餌基因，與BD融合的基因可稱之為目的基因(即建立的基因文庫)。

本文檔共187頁；當前第161頁；編輯于星期二\12點32分本文檔共187頁；當前第162頁；編輯于星期二\12點32分酵母雙雜交技術的基本原理本文檔共187頁；當前第163頁；編輯于星期二\12點32分1）已知蛋白之間相互作用的檢測：2）蛋白質的功能域研究：通過對其中某一個蛋白質作缺失或定點突變，再用此系統檢測是否還存在相互作用，可闡明其功能域或關鍵氨基酸；3）克隆新基因和新蛋白：將感興趣的蛋白質基因與AD基因構建成“誘餌”表達質粒，將某一器官或組織的cDNA文庫與BD基因構建成“獵物”基因庫，共轉化酵母細胞，可篩到與感興趣蛋白質相互作用的蛋白質的cDNA序列，并推測其蛋白質序列。

用途本文檔共187頁；當前第164頁；編輯于星期二\12點32分染色體步差法分離目的基因

---基因定位克隆技術

利用已知基因或DNA分子標記來分離與其緊密連鎖的目的基因。已知基因或分子標記做探針本文檔共187頁；當前第165頁；編輯于星期二\12點32分目的基因的制備和分離2.1直接分離法2.2基因文庫技術分離目的基因2.3基因組文庫分離法2.4cDNA基因文庫分離2.5PCR技術擴增目的基因2.6化學合成基因本文檔共187頁；當前第166頁；編輯于星期二\12點32分思考題圖示說明考斯質粒基因組文庫的構建，指出與λ噬菌體載體的區別。有何優缺點？cDNA基因文庫有何優點？如何構建？怎么樣樣估算基因組文庫大小？結合圖示簡要說明λ噬菌體基因組文庫的構建過程。什么叫差別雜交？簡述其原理？本文檔共187頁；當前第167頁；編輯于星期二\12點32分本文檔共187頁；當前第168頁；編輯于星期二\12點32分本章重點和思考題目的基因的概念基因文庫的概念基因組文庫的概念及操作步驟。cDNA文庫的概念及操作步驟基因組DNA文庫與cDNA文庫的優缺點？什么叫差別雜交？簡述其原理？本文檔共187頁；當前第169頁；編輯于星期二\12點32分例如，已知某目的基因位于1.8