第六章蛋白質(zhì)和DNA技術(shù)(jìshù)第一頁，共50頁。血清蛋白的提取和分離1.方法及原理(1)方法：電泳法。(2)原理：①各種蛋白質(zhì)分子帶電性質(zhì)的差異；②分子本身(běnshēn)大小、形狀的不同。第二頁，共50頁。2.實驗操作程序(1)點樣：用微量加樣器取新制血清，小心加到電泳樣品槽的膠面上。(2)電泳：打開并調(diào)節(jié)穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀進行(jìnxíng)電泳。(3)染色：用質(zhì)量分數(shù)為0.05%的考馬斯亮藍R250染色液對凝膠進行(jìnxíng)染色。(4)脫色：用體積分數(shù)為7%的醋酸溶液脫色。(5)制干膠板：保存液浸泡凝膠板后，放在兩層透氣玻璃紙中間自然干燥。第三頁，共50頁。【高考(ɡāokǎo)警示鐘】1.電泳時，帶電的顆粒向與其電性相反的電極方向移動。2.電泳時，蛋白質(zhì)所帶的電荷數(shù)越多，移動得越快；電荷數(shù)相同時，分子量越小，則移動越快。第四頁，共50頁。DNA片段的擴增1.細胞內(nèi)DNA復制(fùzhì)與PCR技術(shù)的比較第五頁，共50頁。細胞內(nèi)DNA復制PCR不同點解旋酶引物溫度相同點在解旋酶作用下邊(xiàbian)解旋邊復制95℃高溫(gāowēn)解旋，雙鏈完全分開DNA解旋酶、DNA聚合酶耐高溫的DNA聚合酶RNA人工合成(rénɡōnɡhéchénɡ)的DNA單鏈體內(nèi)溫和條件高溫①需提供DNA復制的模板；②四種脫氧核糖核苷酸作原料；③子鏈延伸的方向都是從5′端到3′端第六頁，共50頁。2.PCR技術(shù)反應過程中控制不同溫度的意義(yìyì)(1)95℃變性，雙鏈DNA解旋為單鏈；(2)55℃復性，引物與兩條單鏈DNA結(jié)合；(3)72℃延伸，耐高溫的DNA聚合酶有最大活性，使DNA新鏈由5′端向3′端延伸。第七頁，共50頁。【高考警示鐘】PCR技術(shù)的一個循環(huán)包括高溫變性、低溫復性和中溫延伸三個步驟；每一循環(huán)中DNA聚合酶只能特異(tèyì)地復制處于兩個引物之間的DNA序列，使這段固定長度的序列呈指數(shù)增長。第八頁，共50頁。血清蛋白的提取(tíqǔ)和分離【典例訓練1】我們(wǒmen)通常選用豬、牛、羊等動物的血液進行實驗，來提取和分離血清蛋白。請回答下列有關(guān)問題：(1)實驗前取新鮮血液，靜置凝固后會析出淡黃色的液體——血清，其中含有的蛋白質(zhì)有____、____等。(2)血清蛋白提取和分離的活動程序為：____，在染色和脫色步驟中，所用試劑分別為____、____。(3)能利用電泳技術(shù)分離血清蛋白的原理是____。第九頁，共50頁。【解題指南】1.考查實質(zhì)：本題考查提取和分離血清蛋白的相關(guān)知識(zhīshi)。2.解題關(guān)鍵：(1)血清蛋白主要有丙種球蛋白、凝集素等。(2)血清蛋白提取和分離的操作程序：點樣→電泳→染色→脫色→制干膠板。第十頁，共50頁。【解析】本題考查提取和分離血清(xuèqīng)蛋白的相關(guān)知識。(1)血清(xuèqīng)中含有丙種球蛋白、凝集素等多種蛋白質(zhì)。(2)血清(xuèqīng)蛋白的提取和分離步驟為：點樣→電泳→染色→脫色→制干膠板，其中染色、脫色所用試劑分別為質(zhì)量分數(shù)為0.05%的考馬斯亮藍R250染色液、體積分數(shù)為7%的醋酸溶液。(3)血清(xuèqīng)蛋白為兩性電解質(zhì)，在一定pH條件下帶有電荷，可在電場中移動，故可用電泳技術(shù)進行分離。第十一頁，共50頁。答案：(1)丙種球蛋白凝集素(2)點樣→電泳→染色→脫色→制干膠板質(zhì)量分數(shù)為0.05%的考馬斯亮藍R250染色液體積分數(shù)為7%的醋酸溶液(róngyè)(3)血清蛋白為兩性電解質(zhì)，在一定pH條件下帶有電荷，可在電場中移動第十二頁，共50頁。【互動探究】收集的血紅蛋白溶液在透析袋中可以進行透析，這就是樣品的粗分離。透析的目的(mùdì)是什么？透析的原理是什么？提示：透析是為了去除相對分子質(zhì)量較小的雜質(zhì)。透析的原理是透析袋允許小分子自由進出，而大分子則保留在袋內(nèi)。第十三頁，共50頁。PCR擴增DNA技術(shù)【典例訓練2】(2011·江蘇高考)請回答(huídá)基因工程方面的有關(guān)問題：(1)利用PCR技術(shù)擴增目的基因，其原理與細胞內(nèi)DNA復制類似(如圖所示)。第十四頁，共50頁。第十五頁，共50頁。圖中引物為單鏈DNA片段，它是子鏈合成延伸的基礎(chǔ)。①從理論上推測，第四輪循環(huán)產(chǎn)物中含有引物A的DNA片段所占的比例為____。②在第____輪循環(huán)產(chǎn)物中開始出現(xiàn)兩條脫氧核苷酸鏈等長的DNA片段。(2)設計引物是PCR技術(shù)關(guān)鍵步驟之一。某同學設計的兩組引物(只標注(biāozhù)了部分堿基序列)都不合理(如圖)，請分別說明理由。第十六頁，共50頁。第十七頁，共50頁。①第1組：____；②第2組：____。(3)PCR反應體系中含有熱穩(wěn)定(wěndìng)DNA聚合酶，下面的表達式不能正確反映DNA聚合酶的功能，這是因為____。第十八頁，共50頁。(4)用限制酶EcoRV、MboⅠ單獨或聯(lián)合切割同一種質(zhì)粒，得到的DNA片段(piànduàn)長度如下圖(1kb即1000個堿基對)，請在質(zhì)粒上畫出EcoRV、MboⅠ的切割位點。第十九頁，共50頁。【解題指南(zhǐnán)】1.考查實質(zhì)：本題以基因工程為載體考查PCR技術(shù)的原理、過程以及應用。2.解題關(guān)鍵：了解PCR技術(shù)的過程，理解引物設計的原則，分析不同限制酶的切割位點。第二十頁，共50頁。【解析】(1)①從理論上推測，第四輪循環(huán)產(chǎn)物中含有引物A的DNA片段所占的比例為15/16。②在第三輪循環(huán)產(chǎn)物中開始(kāishǐ)出現(xiàn)兩條脫氧核苷酸鏈等長的DNA片段。(2)某同學設計的兩組引物(只標注了部分堿基序列)都不合理，原因①引物Ⅰ和引物Ⅱ局部發(fā)生堿基互補配對而失效。②引物Ⅰ′自身折疊后會出現(xiàn)局部堿基互補配對而失效。(3)DNA聚合酶只能將單個脫氧核苷酸連續(xù)結(jié)合到雙鏈DNA片段的引物鏈上。第二十一頁，共50頁。答案:(1)①15/16②三(2)①引物Ⅰ和引物Ⅱ局部發(fā)生堿基互補配對(pèiduì)而失效②引物Ⅰ′自身折疊后會出現(xiàn)局部堿基互補配對(pèiduì)而失效(3)DNA聚合酶只能將單個脫氧核苷酸連續(xù)結(jié)合到雙鏈DNA片段的引物鏈上(4)見圖第二十二頁，共50頁。【互動探究】(1)上題(1)中變性、復性、延伸需要的溫度分別是多少(duōshǎo)？提示：95℃、55℃、72℃。分析：當溫度上升到90℃以上時，雙鏈DNA解聚為單鏈，稱之為變性；當溫度下降到50℃左右時，兩種引物通過堿基互補配對與兩條單鏈DNA結(jié)合；當溫度上升到72℃左右時，溶液中的四種脫氧核苷酸在TaqDNA聚合酶的作用下，根據(jù)堿基互補配對原則合成新的DNA鏈，稱為延伸。第二十三頁，共50頁。(2)PCR一般要經(jīng)過三十多次循環(huán)，從第二輪循環(huán)開始，上一次循環(huán)的產(chǎn)物也作為模板參與反應，由引物A延伸而成的DNA單鏈作為模板時將如何延伸？提示：與引物B結(jié)合進行DNA子鏈的延伸。分析：當引物A延伸而成的單鏈作模板時，此單鏈引物端為5′端，因此與它互補的子鏈應從(yīnɡcónɡ)另一端開始合成，即由引物B結(jié)合延伸的子鏈。第二十四頁，共50頁。1.(2012·西安模擬)近20年來，PCR技術(shù)(聚合酶鏈式反應)成為分子生物學實驗室的一種常規(guī)實驗手段，其原理是利用DNA半保留復制，在試管中進行DNA的人工復制(如圖)，在短時間內(nèi)，將DNA擴增幾百萬倍甚至(shènzhì)幾十億倍，從而使實驗室所需要的遺傳物質(zhì)不再受限于活的生物體。第二十五頁，共50頁。(1)加熱使DNA雙鏈間的___鍵完全打開，稱為___；而在細胞中是在___酶的作用下進行的。(2)如果只需要大量克隆模板DNA中間的某個特定區(qū)段，應該加入___種特定的引物。(3)PCR技術(shù)的必需條件，除了(chúle)模板、原料、酶之外，至少還有三個條件，即液體環(huán)境、適宜的___和___，前者由___自動調(diào)控，后者則靠來___維持。(4)通過PCR技術(shù)使DNA分子大量復制，如果將一個用15N標記的DNA分子放入試管中，以14N標記的脫氧核苷酸為原料，連續(xù)復制四次之后，則15N標記的DNA分子占全部DNA分子總數(shù)的比例是___。第二十六頁，共50頁。【解析】(1)PCR技術(shù)利用熱變性原理使DNA雙鏈之間的氫鍵斷裂，稱為解旋，而在細胞內(nèi)是在解旋酶的作用下使氫鍵斷裂。(2)PCR分為三個基本反應步驟：高溫變性(95℃)、低溫復性(55℃)、中溫延伸(72℃)，其特異性依賴于與靶序列互補的引物，引物是兩段與待擴增DNA序列互補的片段(piànduàn)，兩引物之間的距離決定擴增片段(piànduàn)的長度。第二十七頁，共50頁。(3)PCR技術(shù)與細胞內(nèi)的DNA復制不完全相同，除了需要模板、原料、酶以外，至少還需要液體環(huán)境(穩(wěn)定的緩沖溶液)，每一個步驟都需要適宜的溫度和酸堿度等。(4)一個DNA分子連續(xù)復制四次之后，形成(xíngchéng)16個DNA分子，15N標記的DNA分子有2個，則15N標記的DNA分子占全部DNA分子總數(shù)的比例為1/8。第二十八頁，共50頁。答案(dáàn)：(1)氫解旋解旋(2)2(3)溫度酸堿度PCR儀緩沖液(4)1/8第二十九頁，共50頁。2.(2012·惠山模擬)某生物興趣小組在“蛋白質(zhì)的提取和分離”實驗(shíyàn)中，準備從豬的血液中初步提取血紅蛋白，設計的“血紅蛋白提取、分離流程圖”如下：第三十頁，共50頁。請回答下列有關(guān)問題：(1)樣品處理中紅細胞的洗滌要用____反復沖洗、離心。向紅細胞懸液中加入一定量的低濃度pH=7.0的緩沖液并充分攪拌，可以破碎紅細胞，破碎細胞的原理是____。(2)血紅蛋白粗分離階段，透析的目的是____，若要盡快達到理想的透析效果，可以____(寫出一種方法)。(3)電泳利用了待分離樣品中各種分子(fēnzǐ)的____等的差異，而產(chǎn)生不同遷移速度，實現(xiàn)各種分子(fēnzǐ)的分離。(4)一同學通過血紅蛋白醋酸纖維薄膜電泳，觀察到正常人和鐮刀型細胞貧血癥患者的血紅蛋白電泳結(jié)果如圖所示。由圖可知攜帶者有____種血紅蛋白，從分子(fēnzǐ)遺傳學的角度作出的解釋是____。第三十一頁，共50頁。第三十二頁，共50頁。【解析】(1)洗滌紅細胞所用的溶液是生理鹽水，根據(jù)滲透作用原理，將紅細胞置于低滲溶液中，紅細胞會吸水漲破，釋放出血紅蛋白。(2)血紅蛋白粗分離階段，透析的目的是除去樣品中的小分子雜質(zhì)；可通過增加緩沖液的量或及時更換緩沖液等方法縮短透析時間，能盡快達到理想的透析效果。(3)由于各種分子帶電性質(zhì)以及分子大小、形狀等的差異，在電泳過程中產(chǎn)生了不同的遷移速度，實現(xiàn)各種分子的分離。(4)根據(jù)圖示可知，鐮刀型細胞貧血癥的攜帶者含有兩種血紅蛋白，原因(yuányīn)是攜帶者具有(控制血紅蛋白的)一對等位基因，分別控制合成兩種不同的蛋白質(zhì)。第三十三頁，共50頁。答案：(1)生理鹽水滲透原理(當外界溶液濃度低于動物細胞內(nèi)液濃度時，細胞吸水漲破)(2)除去小分子雜質(zhì)增加緩沖液的量或及時更換緩沖液(3)帶電(dàidiàn)性質(zhì)以及分子大小、形狀(4)2攜帶者具有(控制血紅蛋白的)一對等位基因，可以控制合成兩種不同的蛋白質(zhì)第三十四頁，共50頁。3.聚合酶鏈式反應(PCR)是一種體外迅速擴增DNA片段的技術(shù)。請回答(huídá)下列有關(guān)PCR技術(shù)的基本原理及應用的問題。(1)DNA的兩條鏈是反向平行的，通常將____的末端稱為5′端，當引物與DNA母鏈通過堿基互補配對結(jié)合后，DNA聚合酶就能從引物的____開始延伸DNA鏈。第三十五頁，共50頁。(2)PCR利用DNA的熱變性原理解決了打開DNA雙鏈的問題，但又導致了DNA聚合酶失活的新問題。到20世紀80年代，科學家從一種Taq細菌中分離到____，它的發(fā)現(xiàn)和應用解決了以上問題。要將Taq細菌從其他普通的微生物中分離出來，所用的培養(yǎng)基叫____。(3)PCR的每次循環(huán)可以分為____三步。假設在PCR反應中，只有一個DNA片段作為模板，請計算在5次循環(huán)后，反應物中大約有____個這樣(zhèyàng)的DNA片段。(4)請用簡圖表示出一個DNA片段PCR反應中第二輪的產(chǎn)物。(5)簡述PCR技術(shù)的主要應用。第三十六頁，共50頁。【解析】(1)DNA聚合酶只能把新的核苷酸加到已經(jīng)存在的核酸的3′-羥基上，與DNA母鏈結(jié)合的RNA引物就提供這個羥基。(2)因PCR利用了DNA的熱變性原理解決了打開DNA雙鏈的問題，所以用于催化DNA復制過程的DNA聚合酶要具有耐高溫的特性。用選擇(xuǎnzé)培養(yǎng)基可將Taq細菌從其他普通的微生物中分離出來。(3)DNA復制兩條鏈均作為模板，進行半保留復制，所以復制5次后得到的子代DNA分子數(shù)為25=32個。(4)新合成的DNA鏈帶有引物，而最初的模板DNA的兩條鏈不帶有引物。(5)PCR技術(shù)可以對DNA分子進行擴增，所以可用于遺傳疾病的診斷、刑偵破案、古生物學研究、基因克隆和DNA序列分析等方面。第三十七頁，共50頁。答案：(1)磷酸基團3′端(2)耐高溫的TaqDNA聚合酶選擇培養(yǎng)基(3)高溫變性、低溫復性和中溫延伸32(4)(5)遺傳疾病的診斷、刑偵破案、古生物學研究、基因(jīyīn)克隆和DNA序列分析(要求3項以上)。第三十八頁，共50頁。4.PCR技術(shù)是把某一DNA片段在體外酶的作用下，合成許許多多相同片段的一種方法，利用它能快速而特異地擴增任何要求的目的基因或DNA分子片段；電泳技術(shù)是在外電場作用下，利用分子攜帶的靜電荷不同，把待測分子的混合物放在一定的介質(zhì)(如瓊脂糖凝膠)中進行分離(fēnlí)和分析的實驗技術(shù)，利用它可分離(fēnlí)氨基酸、多肽、蛋白質(zhì)、核苷酸、核酸等物質(zhì)和做親子法學鑒定。如圖是電泳裝置及相應電泳結(jié)果。第三十九頁，共50頁。第四十頁，共50頁。請回答：(1)葉綠體色素提取所采用的紙層析法與電泳相比，前者使用的介質(zhì)是____。電泳過程中分子的遷移速率除與本身所帶的凈電荷的多少有關(guān)外，你認為還受什么因素(yīnsù)的影響？____(至少列出一種)。(2)PCR技術(shù)模擬了DNA合成的環(huán)境和條件，擴增過程所需要的基本條件是____，所遵循的原則是____。第四十一頁，共50頁。(3)圖3是把含有21個氨基酸的多肽進行水解，得到的氨基酸混合物進行電泳的結(jié)果，故可推測該多肽是由____種氨基酸構(gòu)成的。(4)圖4是通過提取某小孩和其母親及待測定四位男性的DNA，分別由酶處理后，生成(shēnɡchénɡ)含有若干DNA片段并已進行擴增得到的混合物，然后進行電泳所得到的一組DNA指紋圖譜，請分析：最可能是該小孩真正生物學上的父親的是____。第四十二頁，共50頁。【解析】(1)層析液是一種脂溶性很強的有機溶劑。葉綠體中的四種色素在層析液中的溶解度是不同的：溶解度最高的是胡蘿卜素，它隨層析液在濾紙上擴散得最快；葉黃素和葉綠素a的溶解度次之；葉綠素b的溶解度最低，擴散得最慢。這樣，幾分鐘之后，四種色素就在擴散過程中分離開來。電泳過程中分子的遷移速率除與本身所帶的靜電荷的多少有關(guān)(yǒuguān)外，還與分子大小、電場大小等有關(guān)(yǒuguān)。第四十三頁，共50頁。(2)PCR技術(shù)模擬了DNA合成的環(huán)境和條件，實際就是DNA在體外的復制過程，需要親代(qīndài)DNA作模板，在酶的作用下，利用脫氧核苷酸，合成子代DNA。在DNA復制的過程中，遵循堿基互補配對原則，即A與T配對，G與C配對。(3)此氨基酸混合物電泳的結(jié)果出現(xiàn)了六條帶紋，說明該多肽是由6種氨基酸構(gòu)成的。(4)由圖可知該小孩的DNA片段和F2最接近。第四十四頁，共50頁。答案：(1)層析液分子大小(電場大小)(2)DNA模板(múbǎn)、原料、酶堿基互補配對原則(3)6(4)F2第四十五頁，共50頁。5.請回答下列問題：(1)商品化植酸酶主要來自微生物。在產(chǎn)酶菌株篩選過程中，常在基本培養(yǎng)基中添加不溶于水的植酸鈣制成