浙江大學細胞培養基本技術詳解演示文稿當前第1頁\共有83頁\編于星期四\8點優選浙江大學細胞培養基本技術當前第2頁\共有83頁\編于星期四\8點1.1細胞的原代培養是將機體內的某組織取出，分散成單細胞，在人工條件下培養使其生存并不斷生長繁殖的方法。借助這種方法可以觀察細胞的分裂繁殖、細胞的接觸抑制、細胞的衰老、死亡等生命現象。幼稚狀態的組織和細胞，如動物的胚胎、幼仔的臟器等更容易進行原代培養當前第3頁\共有83頁\編于星期四\8點意義原代培養的最大優點是細胞剛剛離體，生物性狀尚未發生很大變化，具有二倍體的遺傳性，而且大多數細胞表現出原來組織的特性。利用原代培養做各種實驗（藥物測試、細胞分化及病毒學方面）效果很好。原代培養也是建立各種細胞系（株）必須經過的階段。當前第4頁\共有83頁\編于星期四\8點掌握無菌操作技術了解小鼠解剖操作技術了解原代細胞培養的一般方法與步驟了解培養細胞的消化分散了解倒置顯微鏡的使用原代細胞培養的實驗目的和要求當前第5頁\共有83頁\編于星期四\8點實驗材料實驗動物：孕鼠或新生小鼠液體：細胞生長液（內含20%小牛血清）0.25%胰蛋白酶平衡鹽溶液70%乙醇器材：滅菌鑷子、剪刀、滅菌培養皿、細胞培養瓶、小瓶、燒杯、吸管、酒精燈當前第6頁\共有83頁\編于星期四\8點原代細胞培養方法胰酶消化法組織塊直接培養法冷消化溫消化一次性消化分次消化

消化法：采用無菌操作的方法，把組織（或器官）從動物體內取出，經酶消化處理，使分散成單個細胞，然后在人工條件下培養，使其不斷地生長和繁殖。當前第7頁\共有83頁\編于星期四\8點貼塊法消化法原代培養方法分類當前第8頁\共有83頁\編于星期四\8點分次消化

消化法的分類當前第9頁\共有83頁\編于星期四\8點外植塊培養步驟圖解當前第10頁\共有83頁\編于星期四\8點操作步驟1---取材用頸椎脫位法使孕鼠迅速死亡。把整個孕鼠浸入盛有75％乙醇的燒杯中數秒鐘消毒，取出后放在大平皿中攜入超凈臺。用無菌的鑷子和剪子在前腿下作一腹部水平切口，用無菌鑷子將皮膚扯向后腿。用另一無菌的剪刀和鑷子切開腹部，取出含有胚胎的子宮，置于無菌的培養皿上。剔除胚胎周圍的包膜（若胚胎較大，應剪去頭、爪），將胚胎放于無菌的含有平衡鹽溶液的培養皿中。漂洗胚胎，去掉平衡鹽溶液。繼續用平衡鹽溶液漂洗胚胎直至清洗液清亮為止。當前第11頁\共有83頁\編于星期四\8點操作步驟2---切割將部分胚胎轉移至一個無菌小瓶中，用平衡鹽溶液漂洗。然后用眼科手術剪刀小心地絞碎胚胎，直到成1mm3左右的小塊，再用平衡鹽溶液清洗，洗到組織塊發白為止。靜置，使組織塊自然沉淀到管底，棄上清。當前第12頁\共有83頁\編于星期四\8點當前第13頁\共有83頁\編于星期四\8點胰酶消化法操作步驟---消化、接種培養視組織塊量加入5-6倍的0.25%胰酶液，37℃中消化20-40min，每隔5min振蕩一次，或用吸管吹打一次，使細胞分離。加入3-5ml細胞生長液以終止胰酶消化作用（或加入胰酶抑制劑）。靜置5-10min，使未分散的組織塊下沉，取懸液加入到離心管中。1000rpm，離心5-10min，棄上清液。加入平衡鹽溶液5ml，沖散細胞，再離心一次，棄上清液。加入細胞生長液l-2ml（視細胞量），血球計數板計數。將細胞調整到5×105/ml左右，轉移至25ml細胞培養瓶中，37℃下培養。當前第14頁\共有83頁\編于星期四\8點胰酶消化法操作步驟---消化、接種培養也可將此步驟簡化為：視組織塊量加入5-6倍的0.25%胰酶液，37℃中消化20-40min，每隔5min振蕩一次。靜置，吸去上清，用細胞生長液漂洗消化后的組織塊，用吸管反復吹打組織塊，使細胞分離，靜置，使未分散的組織塊下沉。取細胞懸液接種至加了細胞生長液的培養瓶中（調整細胞濃度到5×105/ml左右），37℃下培養。（注意：省略了離心、計數等步驟）當前第15頁\共有83頁\編于星期四\8點組織塊直接培養法操作步驟

組織塊接種：將組織塊轉移到培養瓶，貼附于瓶底面。翻轉瓶底朝上，將細胞生長液加至瓶中，培養液勿接觸組織塊。37℃靜置3-5h，輕輕翻轉培養瓶，使組織浸入細胞生長液中（勿使組織漂起），37℃繼續培養。當前第16頁\共有83頁\編于星期四\8點原代細胞培養結果細胞接種后一般幾小時內就能貼壁，并開始生長如接種的細胞密度適宜，5-7d即可形成單層當前第17頁\共有83頁\編于星期四\8點1.2傳代細胞培養細胞“一代”指從細胞接種到分離再培養的一段期間，與細胞世代或倍增不同。在一代中，細胞培增3-6次培養的細胞形成單層匯合以后，由于密度過大生存空間不足而引起營養枯竭，將培養的細胞分散，從容器中取出，以1:2或1:3以上的比率轉移到新的容器中進行培養，即為傳代培養。也是一種將細胞種保存下去的方法。同時也是利用培養細胞進行各種實驗的必經過程。懸浮型細胞直接分瓶就可以，而貼壁細胞需經消化后才能分瓶。當前第18頁\共有83頁\編于星期四\8點細胞傳代方法根據細胞生長的恃點，傳代方法有3種。1.懸浮生長細胞傳代離心法傳代：離心（1000轉/分）去上清，沉淀物加新培養液后再混勻傳代。直接傳代法：懸浮細胞慢慢沉淀在瓶壁后，將上清培養液去除1/2-2/3，然后用吸管直接吹打形成細胞懸液再傳代。2.半懸浮生長細胞傳代（HeLa細胞）此類細胞部分呈現貼壁生長現象，但貼壁不牢，可用直接吹打法使細胞從瓶壁脫落下來，進行傳代。3.貼壁生長細胞傳代

采用酶消化法傳代。常用消化液是0.25％胰蛋白酶液。當前第19頁\共有83頁\編于星期四\8點消化法傳代培養步驟當前第20頁\共有83頁\編于星期四\8點選取生長良好的細胞，在超凈工作臺的酒精燈旁，倒去瓶中的舊培養液，加入2-3

ml的D-Hanks液，輕輕振蕩漂洗細胞，以除去懸浮在細胞表面的碎片(思考：還有什么作用？）加入適量0.1-0.25％胰蛋白酶消化液，室溫消化，倒置顯微鏡下觀察，待細胞單層收縮突起出現空隙時，倒去酶液用Hanks液洗滌1次，加入適量培養液，反復吹打細胞，使其成細胞懸液。以1:2或1:3進行分裝，并在培養瓶上做好標記，注明代號、日期，輕輕搖勻，37℃CO2培養箱培養。觀察：細胞培養24h后，即可觀察培養液的顏色及細胞的生長情況。貼壁生長細胞傳代方法當前第21頁\共有83頁\編于星期四\8點傳代細胞培養結果一般情況，傳代后的細胞在2h時左右就能附著在培養瓶壁上，2-4d就可在瓶內形成單層，需要再次進行傳代當前第22頁\共有83頁\編于星期四\8點取生長良好的細胞，在超凈工作臺用無菌吸管把培養瓶中的細胞吹打均勻。轉移到無菌的離心管中，蓋緊膠蓋，平衡后離心（1000rpm/min）5min。(區別貼壁傳代)在超凈工作臺中吸去上清液，加入適量新培養液，用吸管吹打細胞，制成懸液。以1:2或1:3進行分裝，并在培養瓶上做好標記，注明代號、日期，輕輕搖勻，37℃CO2培養箱培養。觀察：細胞培養24h后，即可進行觀察。懸液細胞的傳代培養當前第23頁\共有83頁\編于星期四\8點要預先與臨床外科醫生和護士商量，并做好一切必要的準備工作。爭取拿到的標本新鮮、無菌、少壞死等。聯系好手術時間后，立即做好如下準備工作：準備1-2個貯有培養液和抗生素的標本收集瓶，將蓋蓋緊，保持無菌，瓶外貼上標簽，寫上工作人員名字、地點和電話號碼；將收集瓶送往醫院，并與醫生和護士講清取手術標本的部位及注意事項。1.3人體活檢(或手術)材料當前第24頁\共有83頁\編于星期四\8點標本放入收集瓶后，送出手術間，立即送往組織培養實驗室。工作人員最好是等在手術間外。但有時手術時間難以掌握。則請護士將收集材料的瓶子蓋好后，放入4℃冰箱，盡快打電話通知工作人員。取臨床標本時，雖然盡可能做到無菌操作，但仍有污染可能性的存在。可選用抗生素類控制污染。如手術標本比較大（約200mg以上），可將其浸于70%酒精中約30-60秒，這樣會減少表面污染而不損壞內部組織的結構和存活。不要用紗布包裹標本，紗布纖維易粘附在組織上。人體活檢(或手術)材料當前第25頁\共有83頁\編于星期四\8點整個取材過程中，都要注意保持組織的濕潤，隨時給組織塊滴加一些培養液或平衡鹽溶液。一般情況下，最好是使用冰冷的液體。在剪碎或切割組織塊時，盡量使用鋒利的刀剪，防止以鈍器對組織揉、捻、撕拉等而造成細胞損傷。整個取材過程耗時越短越好。在萬不得已的情況下，取材后也可將組織貯存在冷的(4

℃)含平衡鹽溶液(或其它緩沖鹽溶液)的營養液中，最好不超過24-48

h(視不同組織類型而定)。需要注意的事項當前第26頁\共有83頁\編于星期四\8點1.4培養細胞生長測定是腫瘤體外研究中應用最廣的技術手段之一。

任何培養瓶內生長的細胞都由死細胞和活細胞組成，從形態上區別死、活細胞是困難的。方法：細胞計數法臺盼藍染色法生長曲線法

四唑鹽（MTT）比色法

當前第27頁\共有83頁\編于星期四\8點細胞計數用細胞計數法測定細胞生長動力學是目前采用的最普遍的方法。

血細胞計數板人工計數細胞計數器血細胞計數板：常用的是改良的紐巴氏(Neubauer)血細胞計數板。當前第28頁\共有83頁\編于星期四\8點細胞計數實驗原理：血球計數盤一般有二個chambers，每個chamber中細刻9個1mm2大正方形，其中4個角落之正方形再細刻16個小格，深度均為0.1mm。當chamber上方蓋上蓋玻片后，每個大正方形之體積為1mm2×0.1mm=1.0×10-4ml。使用時，計數每個大正方形內之細胞數目，乘以稀釋倍數，再乘以104，即為每ml中之細胞數目。存活測試為利用染料會滲入死細胞中而呈色，而活細胞因細胞膜完整，染料無法滲入而不會呈色。當前第29頁\共有83頁\編于星期四\8點細胞計數具體操作：

1.將計數板及蓋片用75%酒精擦拭干凈，并將蓋片蓋在計數板。

2.吸取少許混合均勻的細胞懸液，滴加在蓋片邊緣，使懸液充滿蓋片和計數板之間，靜置3min，注意蓋片下不要有氣泡，也不能讓懸液流入旁邊槽中。3.計算板四大格細胞總數，壓線細胞只計左側和上方的。然后按公式計算：

細胞數/mL=四大格細胞總數/4×104×稀釋倍數注意：鏡下偶見有兩個以上細胞組成的細胞團，應按單個細胞計算，若細胞團10%以上，說明分散不好，需重新制備細胞懸液當前第30頁\共有83頁\編于星期四\8點由于死細胞的細胞膜通透性發生改變，某些染料可大量進入卻不被排出，因而細胞呈色。而活細胞反之，能排出進入細胞內的染料，因而不易著色。此法的原理即是利用死、活細胞對染料的不同反應而區分開兩種細胞。臺盼藍染細胞時，時間不宜過長（約2min）。臺盼藍排除檢測法當前第31頁\共有83頁\編于星期四\8點①將1滴細胞懸液(貼壁細胞可經0.25％胰蛋白酶溶液消化后，吹打制成細胞懸液)與2滴臺盼藍液混合后，滴入細胞計數板。②2min后，在顯微鏡下計數至少200個細胞。未著色的為活細胞，呈藍色的為死細胞。計算活細胞百分比。活體染色與細胞計數當前第32頁\共有83頁\編于星期四\8點細胞生長曲線的繪制細胞生長曲線(cellgrowthcurve)是觀測細胞在一代生存期內的增生過程的重要指標，可根據細胞生長曲線分析細胞增殖速度，確定細胞傳代、細胞凍存或具體實驗的最佳時間。它以培養時間為橫坐標、細胞密度為縱坐標作坐標圖。當前第33頁\共有83頁\編于星期四\8點1)培養細胞首先在2４孔培養板內分別接種相同數量的細胞。計數并記錄接種的細胞懸液之密度。接種時間記為0h。2)計數細胞密度從接種時間算起，每隔24

h計數３孔內的細胞密度，算出平均值。為提高準確率，對每孔細胞可計數2-3次。如此操作至第七天結束。

3)繪制曲線

以培養時間為橫坐標、細胞密度

為縱坐標，將全部結果在坐標紙

上繪圖，即得所培養細胞的生長

曲線。當前第34頁\共有83頁\編于星期四\8點四唑鹽（MTT）商品名為噻唑藍四唑鹽比色法的原理：活細胞中脫氫酶能將四唑鹽還原成不溶于水的藍紫色產物（formazan)，并沉淀在細胞中，而死細胞沒有這種功能。二甲亞砜（DMSO）能溶解沉積在細胞中藍紫色結晶物，溶液顏色深淺與所含的formazan量成正比，用酶標儀測定OD570nm值。MTT法簡單快速、準確，廣泛應用于新藥篩選、細胞毒性試驗、腫瘤放射敏感性實驗等。四唑鹽（MTT）比色法當前第35頁\共有83頁\編于星期四\8點操作步驟四唑鹽（MTT）比色法100L單細胞懸液接種于96孔板(5×104)。37℃、5％CO2培養箱中培養一段時間加入2mg/ml的MTT液（50L/孔）；繼續培養3h。吸出孔內培養液后，加入DMSO液（150L/孔），將培養板置于微孔板扳蕩器上振蕩10min，使結晶物溶解。酶標儀檢測各孔OD值（檢測波長570nm）。記錄結果。高濃度血清可影響光吸收值，在加入異丙醇溶液或DMSO前盡量吸凈培養液。吸去培養液時動作要慢,以免吸去形成的結晶。當前第36頁\共有83頁\編于星期四\8點1.5細胞凍存和復蘇Spallanzani(1776)最早發表了“冷”處理對“細胞”生命活動影響的報道。1900年前后，科學家基本上肯定了生物成分(如精子)能夠在零下溫度貯存的事實。Polge等人(1949)發現了甘油對低溫下貯存細胞的保護作用。Luyet(1951)與Lovelock(1953)等多位學者發現電解質濃度增大是造成冷凍貯存細胞損傷的主要原因。Lovelock等人(1959)發現了一種新的化學保護劑，這就是現在人們熟知的二甲基亞砜(DMSO)。當前低溫液氮凍存貯存細胞已是細胞培養室常規性通用技術，貯存時間幾乎是無限的。當前第37頁\共有83頁\編于星期四\8點細胞凍存(cryopreservation)：將體外培養物懸浮在冷凍保護劑的溶液中，以一定的降溫速率降至零下某一溫度(<-70℃)，并在此溫度下對其長期保存的過程。復蘇(thawing)：以一定的復溫速率將凍存的培養物恢復到常溫的過程。當前第38頁\共有83頁\編于星期四\8點影響冷凍效果的因素1.冷凍速率細胞冷至-5~-15℃之間時，細胞外溶液先出現結冰而細胞內仍保持未結冰狀態，細胞內未結冰的水分子會向細胞外流動

-冷凍速度慢，細胞內水分外滲多，細胞內溶質濃度增高，細胞內不發生結冰，但脫水嚴重，細胞體積嚴重收縮，甚至使細胞失去活性；

-冷凍速度快，細胞內水分沒有足夠的時間外滲，隨著溫度的下降會發生細胞內結冰，造成細胞膜及細胞器的破壞。當前第39頁\共有83頁\編于星期四\8點影響冷凍效果的因素2.冷凍保存溫度液氮溫度（-196℃）是目前最佳冷凍保存溫度。

-70～-80

℃條件冷凍保存細胞，短期內對細胞活性無明顯影響，時間延長，細胞存活率下降。3.復溫速率

是在細胞復蘇時溫度升高的速度一般復溫速度越快越好1-2min內從-196℃升溫至37℃（水浴鍋）。當前第40頁\共有83頁\編于星期四\8點4.

冷凍保護劑

可以保護細胞免受冷凍損傷的物質。

滲透性：甘油、DMSO非滲透性：聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、蔗糖、聚乙二醇影響冷凍效果的因素甘油或DMSO分子量小，溶解度大，易穿透細胞，可使冰點下降，提高細胞膜對水的通透性，且對細胞無明顯毒性。甘油和DMSO并不能防止細胞內結冰。在使用該類冷凍保護劑時，需要一定的時間進行預冷。當前第41頁\共有83頁\編于星期四\8點慢凍程序標準程序：采用細胞凍存器當溫度在-25℃以上時，1～2℃/min當溫度達-25℃以下時，5～10℃/min當溫度達-100℃時，可迅速放入液氮(-196C)中簡易程序：將冷凍管（管口要朝上）放入紗布袋內，紗布袋系以線繩，通過線繩將紗布袋固定于液氮罐罐口，按每分鐘溫度下降1-2℃的速度，在40min內降至液氮表面過夜，次晨投人液氮中。傳統程序：冷凍管置于4℃1h→-20℃1h→-80℃16-18h(或隔夜)→液氮槽長期儲存當前第42頁\共有83頁\編于星期四\8點低溫保護劑的應用在細胞凍存時加入低溫保護劑，能大大提高凍存效果。常用的低溫保護劑是二甲基亞楓（DMSO），它是一種滲透性保護劑，可迅速透入細胞，提高胞膜對水的通透性，降低冰點，延緩凍結過程，能使細胞內水分在凍結前透出細胞外，在胞外形成冰晶，減少胞內冰晶，從而減少冰晶對細胞的損傷。常溫下DMSO對細胞的毒副作用較大，在4℃時，其毒副作用大為減弱，凍存時DMSO平衡應在4℃下進行。當前第43頁\共有83頁\編于星期四\8點細胞凍存方法預先配制凍存液

-10％DMSO＋細胞生長液（20％血清＋基礎培養液）取對數生長期細胞，經胰酶消化后，加入適量凍存液,用吸管吹打制成細胞懸液（1-5×106cell/ml)加1ml細胞于凍存管中，密封后標記冷凍細胞名稱和冷凍日期。液氮長期保存當前第44頁\共有83頁\編于星期四\8點注意事項控制凍存細胞的質量不宜將凍存的細胞放置在-20℃過長時間，易引起低溫損傷凍存小管宜用塑料凍存管當前第45頁\共有83頁\編于星期四\8點保存細胞的復蘇方法快速解凍凍存細胞從液氮中取出后，立即放入37℃水浴中，輕輕搖動冷凍管，使其在1min內（不要超過3min）全部融化解凍后的細胞可直接接種到含完全生長培養液的細胞培養瓶進行培養，24h后再用新鮮完全培養液替換舊培養液，以去除DMSO如果細胞對冷凍保護劑特別敏感解凍后的細胞應先通過離心去除冷凍保護劑，然后再接種到含完全生長培養液的培養瓶中當前第46頁\共有83頁\編于星期四\8點準備水浴取凍存管，入水浴快速晃動至完全融化去除DMSO4.加入培養基制成細胞懸液，移入培養瓶培養當前第47頁\共有83頁\編于星期四\8點注意事項盡快使細胞恢復到常溫盡快離心棄去冷凍保護液，防止對細胞的毒害當前第48頁\共有83頁\編于星期四\8點凍存和復蘇的原則：慢凍快融冷到零度以下，細胞可以產生以下變化：細胞器脫水，細胞中可溶性物質濃度升高，并在細胞內形成冰晶。如果緩慢冷凍，可使細胞逐步脫水，細胞內不致產生大的冰晶；相反，結晶就大，大結晶會造成細胞膜、細胞器的損傷和破裂。復蘇過程應快融，目的是防止小冰晶形成大冰晶，即冰晶的重結晶。當前第49頁\共有83頁\編于星期四\8點1.6細胞的運輸由于培養細胞株(系)的商品化，細胞培養室之間的交流、交換和購買已成為生命科學研究中的一個重要組成部分，培養細胞的運輸成為研究工作的一個重要環節。如果不了解所要細胞的性狀、培養液特點及培養注意事項，運輸時不注意使用特殊容器或溫度等，就可能影響細胞的生長，或出現差錯，或導致培養失敗等。裝運細胞的主要方法如下：冷凍儲存運輸充液法當前第50頁\共有83頁\編于星期四\8點細胞的運輸---冷凍儲存運輸利用特殊容器內盛液氮或干冰的運輸方法。保存效果較好，但缺點是比較麻煩，不宜長時間運輸，多需空運，代價較大。

當前第51頁\共有83頁\編于星期四\8點細胞的運輸---充液法一般選擇生長良好的細胞，以生長1/3～1/2瓶底壁為宜，去掉舊培養液，補充新的培養液至瓶頸部，保留微量空氣，擰緊瓶蓋，并用膠帶密封，放在一運送盒內，用棉花等做防震防壓處理。運輸時間需4-5d，一般放在貼身口袋即可，到達目的地后倒出多余的培養液，只需保留維持生長所需的培養液置37℃培養，次日傳代。如果在市內運輸或僅需數小時運輸路程，也可將細胞附著面朝上，或把培養液全部倒掉放在胸部口袋運送。靠附著于細胞表面的培養液，可使細胞短時間不受損。

當前第52頁\共有83頁\編于星期四\8點2、細胞系的建立正常細胞系癌細胞系轉化細胞系細胞克隆當前第53頁\共有83頁\編于星期四\8點正常細胞系建立的程序：原代培養第一次傳代常規傳代凍存和復蘇當前第54頁\共有83頁\編于星期四\8點癌細胞系建立的程序：步驟類似正常細胞系建立注意：取轉移灶組織癌細胞、癌最外層組織去除癌組織中的間質細胞--膠原酶法當前第55頁\共有83頁\編于星期四\8點細胞系的維持細胞系檔案要記錄好：組織來源、培養基要求、傳代時間等；傳代換液有規律，否則會引起生物學特性改變；多種細胞維持傳代，要防止交叉污染；要有充足的凍存儲備，防止因污染造成絕種；細胞暫時不用，最好凍存，以免老化或性狀改變。當前第56頁\共有83頁\編于星期四\8點證明細胞系的種系：人源、鼠源或其他，染色體分析、同工酶分析、DNA指紋技術明確細胞系的組織來源：檢測細胞抗原標記的方法細胞是否是正常細胞，有無發生惡性轉化：正常細胞二倍體特征，惡性轉化細胞為異倍體細胞有無交叉污染：同工酶方法，DNA指紋技術也可以鑒定鑒定細胞系的內容當前第57頁\共有83頁\編于星期四\8點3、細胞培養物的固定、染色培養物的常用固定方法染色方法當前第58頁\共有83頁\編于星期四\8點2.1常用固定方法固定細胞的目的：

把組織和細胞的原有結構盡可能完整地保存下來，避免組織和細胞發生降解、自溶、腐敗和變形等，使細胞的化學物質和酶能準確定位，使細胞的各部分易于著色、適于觀察、長期保存和分析。當前第59頁\共有83頁\編于星期四\8點2.1常用固定方法固定細胞的原則：

盡可能選用新鮮培養物，根據檢測工具、對象、目的和要求選擇固定劑和固定方法。

培養物的準備和固定前處理各種細胞培養物。雙蓋片懸滴和懸液培養物：離心--PBS漂洗2-3次，固定制片；蓋片單層培養物：蓋片從培養器中取出--PBS漂洗2-3次，固定當前第60頁\共有83頁\編于星期四\8點常用固定液簡單固定液：甲醇、乙醇、醋酸、甲醛、戊二醛、丙酮、苦味酸、鉻酸、重鉻酸鉀、氯化汞、氯化鎘、鋨酸混合固定液：

Mueller固定液、Flernming固定液、FAA固定液、Carnoy固定液、Rossman固定液、Altmann固定液、Bouing固定液當前第61頁\共有83頁\編于星期四\8點常用固定液固定液用途固定液用途4%甲醛-PBS(1:9)大標本、染色體、線粒體、高爾基體戊二醛蛋白質、微管和膜性結構丙酮純冷丙酮固定細胞內酶甲醇/醋酸(3:1)培養細胞、染色體，現用現配乙醇(70-100%)血纖維蛋白、色素、彈性纖維、細菌和白細胞FAA固定液蓋片單層培養的細胞醋酸(0.3-5%)減少其它固定劑引起的細胞收縮Carnoy固定液單層細胞1%苦味酸白蛋白、核蛋白、球蛋白、組蛋白和核酸Bouing固定液雙蓋片培養細胞的糖原鋨酸(1-2%)結膜、細胞結構4%多聚甲醛-PBS腎纖維蛋白、細胞骨架蛋白當前第62頁\共有83頁\編于星期四\8點FAA固定液：

90ml80%的酒精中加入冰乙酸和40%甲醛各5mlCarnoy固定液：

60ml純乙醇中加入氯仿30ml及冰乙酸10mlBouing固定液：

75ml飽和苦味酸（100ml水中加入1.2-1.4g）過濾，加入25ml福爾馬林（40%甲醛，有沉淀時禁用），再加入5ml冰醋酸（最好用前加）4%多聚甲醛-PBS：

50ml蒸餾水中加入4g多聚甲醛，加熱至60-70oC，邊攪拌邊逐滴加入2M的NaOH至液體清澈透明；用1M的HCl調pH至7.4，冷卻后加入10mM的PBS至100ml鋨酸：在棕色試劑瓶中加入50-100ml的0.1MPBS（），再將裝有1g鋨酸的安培瓶放入，擊碎安培瓶，搖晃使鋨酸溶解當前第63頁\共有83頁\編于星期四\8點2.2染色方法染色是利用化學染料與細胞及各種細胞器發生化學作用和/或吸附作用，使各種細胞結構能夠通過染色而改變其折射率，從而清晰的顯現出來。影響因素：所用的固定液染液的pH值：組織的酸性成分用pH偏高的染液，堿性成分用偏酸染液當前第64頁\共有83頁\編于星期四\8點1）Giemsa染色簡便、快速，適用于多種細胞和染色體染色染色液現用現配，保存時間最好不超過48h；Giemsa液對pH敏感。母液制備：

Giemsa粉0.5g，甘油22ml，在研缽內將少量甘油和Giemsa粉混合研磨至無顆粒，加入剩余甘油，56oC保溫2h，加入33ml甲醇，棕色瓶保存。當前第65頁\共有83頁\編于星期四\8點1）Giemsa染色染色步驟（蓋片培養或涂片法）：1）Sorensenbuf和Giemsa染液9:1體積比混合即得到染色液2）用甲醇固定細胞標本10min，或醋酸/甲醇(1:3)固定30min3）用滴管將染色液布滿材料面（不要有氣泡）4）染色10-15min，用自來水將玻片沖洗干凈，空氣干燥，二甲苯透明5）光學樹脂膠封片后觀察結果：細胞核染成紫紅色或藍紫色，胞漿染成粉紅色當前第66頁\共有83頁\編于星期四\8點2）蘇木精-伊紅染色染液制備：

1）蘇木精染液(20×):

蘇木精0.5g，銨礬(NH4)2SO4Al2(SO4)324g，H2O50ml，NaIO30.5g，甘油30ml，冰醋酸2ml。2）1%伊紅染液：

1g伊紅溶于100ml蒸餾水。當前第67頁\共有83頁\編于星期四\8點2）蘇木精-伊紅染色染色步驟（蓋片培養法）：1）37oC溫PBS中漂洗3次，每次20-60sec，中性福爾馬林固定30min2）蒸餾水漂洗1次，用蒸餾水稀釋的1×蘇木精染液染色10min，自來水洗后置入1%NaHCO3中漂洗至藍紫色3）伊紅水溶液中染0.5-1min，蒸餾水洗后迅速通過丙酮2次，每次3-5min4）通過2:1和1:2丙酮/二甲苯各3次，每次1-2min；純二甲苯5-10min5）用光學樹膠封片（注意勿將蓋片的細胞面放反）后觀察結果：細胞核染成紅色，胞質染成藍紫色當前第68頁\共有83頁\編于星期四\8點3）吖啶橙染色吖啶橙(acridineroange,AO)：常用熒光染料，可用于活細胞、固定細胞染色，可與細胞中DNA和RNA結合而發出不同顏色的熒光，DNA亮綠色，RNA橘紅色至火紅色。快速、簡便、并有一定特異性。染液配制：用生理鹽水將AO配成1%的母液，冰箱保存，用時則0.1M的PBS（pH4.8）稀釋成0.01%工作液。當前第69頁\共有83頁\編于星期四\8點3）吖啶橙染色染色步驟（蓋片培養）：1）Hank’s液洗蓋玻片上的貼壁細胞3次2）用95%乙醇固定細胞標本15-30min，濾紙吸干3）1%醋酸作用30sec，PBS清洗1min4）用0.01%的AO染液染色1-5min，PBS清洗1min5）0.1MCaCl2分色0.5-2min，PBS清洗3次，每次數秒6）1:1的甘油:PBS封片，立刻觀察(用激發波405的濾光片)當前第70頁\共有83頁\編于星期四\8點4）免疫熒光染色原理：用熒光素標記已知抗體或抗原，檢查細胞或組織標本中相應的抗原或抗體。在熒光顯微鏡下，抗原抗體特異性結合部位的熒光素受激發光照射而發出明亮的熒光。熒光素：異硫氰酸熒光素（FITC）：發射熒光波長為490-619nm（黃綠色熒光）

四乙基羅丹明（RB200）：發射熒光波長為540-660nm（橙紅色熒光）當前第71頁\共有83頁\編于星期四\8點4）免疫熒光染色染色步驟（間接熒光染色法）：1）用95%乙醇固定單層細胞標本10-30min，或冷丙酮固定5-10min，PBS洗3次，每次5min，邊洗邊震蕩2）滴加未標記的一抗液，37oC濕盒中30min，PBS洗3次，每次5min，邊洗邊震蕩3）滴加熒光標記二抗，37oC濕盒中30min，PBS洗3次，每次5min，邊洗邊震蕩4）去除玻片周圍及材料上的水分5）熒光顯微鏡下觀察當前第72頁\共有83頁\編于星期四\8點5）細胞活體染色—臺盼藍用Hank’s液配制0.1%臺盼藍溶液用等比的0.5%胰酶和0.2%EDTA混合液消化貼壁細胞加入適量Hank’s液制成細胞懸液，每ml懸液中加入0.1%的臺盼藍溶液10ul并混勻細胞計數板計數1000個細胞中的活細胞（折光性強且不著色）和死細胞（染為藍色）數目當前第73頁\共有83頁\編于星期四\8點6）細胞骨架染色微絲：PBS洗蓋片培養的細胞3次，每次0.5min2%的甲醛/PBS液固定3min0.5%的三硝基甲苯/PBS處理3次，每次10min，PBS漂洗3次用羅丹明（rhodamine）標記的鬼筆環肽（phalloidin）（1:10）室溫中反應15min，PBS漂洗3次60%甘油+熒光防淬劑封片后熒光顯微鏡觀察當前第74頁\共有83頁\編于星期四\8點6）細胞骨架染色微管：PBS洗蓋片培養的細胞3次，每次0.5min3%的甲醛/PBS液室溫固定20min0.5%的三硝基甲苯/PBS處理3次，每次10min，PBS漂洗3次，最后用濾紙吸干多余的PBS投入冷丙酮中（-10~20oC）7min，PBS漂洗3次，最后用濾紙吸干多余的PBS當前第75頁\共有