目的基因的獲取第一頁，共七十五頁，編輯于2023年，星期一生物種類人擬南芥果蠅水稻蠕蟲流感病毒基因數目（萬個）3~42.551.3651.780.175單個gene在整個基因組中所占的比例極其微小，加上復雜的基因間序列；對單個目的gene的分離如同大海撈針。第二頁，共七十五頁，編輯于2023年，星期一已知基因的獲取方法：⒈PCR技術擴增目的基因⒉化學方法人工合成目的基因第三頁，共七十五頁，編輯于2023年，星期一未知基因的獲得途徑：⒈構建基因組文庫利用鳥槍法克隆目的基因2.構建cDNA文庫，篩選目的基因3.mRNA差異顯示技術篩選差異表達基因4.酵母雙雜交體內鑒定基因第四頁，共七十五頁，編輯于2023年，星期一本章內容第一節基因組DNA的片斷化

第二節基因的化學合成第三節目的基因的保存和擴增第四節目的基因的分離和擴增

第五頁，共七十五頁，編輯于2023年，星期一第一節基因組DNA的片斷化二、限制性內切酶消化法一、

機械切割法第六頁，共七十五頁，編輯于2023年，星期一一.機械切割法（1）超聲波斷裂成約300bp的隨機片斷（2）高速攪拌1500轉/分下攪拌30min，可產生約8kb的隨機片斷（3）移液器抽吸法第七頁，共七十五頁，編輯于2023年，星期一二、限制性內切酶消化法用限制性內切酶把基因組DNA切成不同大小的片斷。酶切基因組DNA第八頁，共七十五頁，編輯于2023年，星期一1.優點

如果帶有粘性末端，產物可以直接與載體連接，連接效率高第九頁，共七十五頁，編輯于2023年，星期一2.缺點①目的基因內部可能有內切酶的切點BamHIBamHIBamHIGene目的基因也被切成碎片！第十頁，共七十五頁，編輯于2023年，星期一②消化的片斷分子量太大或太小不符合載體容量，不能克隆解決的辦法采用隨機片斷化制備DNA的克隆片斷第十一頁，共七十五頁，編輯于2023年，星期一3.限制性內切酶局部消化法控制內切酶的用量和消化時間，使基因組中的酶切位點只有一部分被隨機切開。①內切酶識別位點的堿基數影響所切出的產物的長度和隨機程度限制性內切酶的選用原則第十二頁，共七十五頁，編輯于2023年，星期一1）4bp的內切酶平均每4096（46）bp一個切點。2）6bp的內切酶平均每256（44）bp一個切點隨機程度高。如HaeⅢ、AluI、MobI、Sau3AI②內切酶粘性末端能與常用克隆位點相連Sau3AIBamHI5’-GATC-3’5’-GGATC-3’第十三頁，共七十五頁，編輯于2023年，星期一文庫：是指一種全體的集合。通過克隆方法保存在適當宿主中的某種生物、組織、器官或細胞類型的所有DNA片段而構成的克隆集合體。

克隆并不是為了保存，而是為了分離。

第三節目的基因的保存和擴增一、基因文庫（genelibrary）1.基因文庫第十四頁，共七十五頁，編輯于2023年，星期一為什么要建基因文庫？高等生物的基因組DNA十分復雜，單個基因在基因組或某個特定發育階段或特定組織中所占比例很小。因此，要想從龐大的基因組中分離某個特定的未知基因非常難的，必須構建基因文庫，利用文庫篩選技術獲得該基因的陽性克隆，然后對其進行分析。第十五頁，共七十五頁，編輯于2023年，星期一基因文庫的分類基因組文庫：提取染色體基因組DNA。如果要研究的是控制基因表達的調控序列，或是在mRNA中不存在的某種特定序列。cDNA文庫：mRNA反轉錄成的cDNA。如果研究的目標是弄清一種蛋白質的氨基酸序列，可以根據克隆的cDNA分子的核苷酸序列推導出來。第十六頁，共七十五頁，編輯于2023年，星期一mRNA結構圖DNA結構圖第十七頁，共七十五頁，編輯于2023年，星期一2.基因文庫的構建載體的制備DNA的提取及片段化、cDNA的合成載體與插入片段的連接

重組DNA分子導入宿主菌轉化細胞的篩選第十八頁，共七十五頁，編輯于2023年，星期一將某種生物細胞的整個基因組DNA切割成大小合適的片斷，并將所有這些片斷都與適當的載體連接，引入相應的宿主細胞中繁殖保存和擴增。二、基因組文庫的構建1.基因組文庫理論上講，這些重組載體上帶有了該生物體的全部基因第十九頁，共七十五頁，編輯于2023年，星期一篩選目的基因第二十頁，共七十五頁，編輯于2023年，星期一目前常用的載體2.載體選用載體能夠容載的DNA片斷大小直接影響到構建完整的基因文庫所需要的重組子的數目。載體容量越大，所要求的DNA片斷數目越少對載體的要求載體系列：容量為24kpcosmid載體：容量為50kbYAC：容量為1MbBAC:容量為300kb第二十一頁，共七十五頁，編輯于2023年，星期一（1）λ噬菌體載體最常用

插入型載體構建文庫時，通常用限制性核酸內切酶切割位于λ噬菌體DNA非必需區的單一酶切位點，以供外源基因片段的插入，插入片段適宜長度約為9kb。

替代型載體構建文庫時，需要將非必需區兩邊的臂進行分析純化，才能用于連接，插入片段適宜長度約為9～22kb。第二十二頁，共七十五頁，編輯于2023年，星期一第二十三頁，共七十五頁，編輯于2023年，星期一（2）黏粒載體不僅能克隆和增殖完整的真核基因，還可克隆和分析組成某一基因家族或基因座的真核DNA片段。構建過程與噬菌體文庫的構建過程相似。（3）YAC、BAC載體克隆大片斷DNA的載體。可用來克隆完整的動物基因。在人類基因組計劃中，YAC被廣泛地用于大規模基因組結構分析。第二十四頁，共七十五頁，編輯于2023年，星期一最早用于基因克隆的載體。只能容納比質粒分子量更小的片段。不能用于核基因組文庫。適合于短序列的克隆文庫。葉綠體DNA文庫、線粒體DNA文庫、cDNA文庫。（4）質粒載體第二十五頁，共七十五頁，編輯于2023年，星期一3.基因組文庫構建的一般步驟（1）基因組DNA的提取關鍵:制備高分子質量的基因組DNA經典的方法：在EDTA和SDS存在下，用蛋白酶K消化細胞，然后用酚－氯仿混合液抽提蛋白質，并用透析法去除分子質量雜質。在提取時必須盡可能地避免機械切割第二十六頁，共七十五頁，編輯于2023年，星期一關鍵：斷點完全隨機，片斷長度合適于載體連接（2）DNA克隆片段的制備超聲波（300bp）或機械攪拌（8kb）①物理切割法：內切酶Sau3A進行局部消化。可得到10-30kb的隨機片斷②酶切法：第二十七頁，共七十五頁，編輯于2023年，星期一第二十八頁，共七十五頁，編輯于2023年，星期一（3）載體與基因組DNA大片段的連接①粘性末端直接連接載體與外源DNA大片段的兩個末端都有相同的粘性末端。如：Sau3A與BamHI的酶切末端。直接連接、人工接頭或同聚物加尾②人工接頭法人工合成的限制性內切酶粘性末端片斷第二十九頁，共七十五頁，編輯于2023年，星期一各種酶的接頭可以向公司定做或購買接上人工接頭粘性末端CCCCCC末端轉移酶粘性末端③同聚物加尾第三十頁，共七十五頁，編輯于2023年，星期一第三十一頁，共七十五頁，編輯于2023年，星期一4.基因組文庫的大小一個文庫要包含99%的基因組DNA時所需要的克隆數目N=ln(1-p)ln(1-f)p:文庫包含了整個基因組DNA的概率（99%）f:插入載體的DNA片斷的平均長度占整個基因組DNA的百分數N:所需的重組載體數（克隆數）基因文庫的大小以及從中獲得特定序列的概率的計算公式：第三十二頁，共七十五頁，編輯于2023年，星期一例如：人的基因組是3×109bp，插入DNA片斷的平均長度如果是1.7×104bpN=ln(1-p)ln(1-f)=ln(1-99%)ln(1-f)=4.61×GfN=4.61×GfG:Genome大小；f:fragment大小N=4.61×Gf=4.61×3×1091.7×104=8.1×105第三十三頁，共七十五頁，編輯于2023年，星期一第三十四頁，共七十五頁，編輯于2023年，星期一5.基因組文庫的擴增及保存（1）基因組文庫的擴增①液體培養增殖法最簡便混合培養方法：從瓊脂糖平板上挑取已長出的克隆子轉入含適當的抗生素培養基中，混合的細菌生長數代后，其培養物于-80℃儲存（加終濃度為25%的甘油）缺點：由于細菌在液體中以混合群體的形式生長和不同克隆生長速率的差異，導致文庫中某些特定的序列過多或過少。第三十五頁，共七十五頁，編輯于2023年，星期一保存單個克隆子于含有甘油的培養基中方法：從平板上挑選單個克隆子接種于合適的含抗生素的培養基中，菌體生長到一定濃度后，加入終濃度為25%的甘油，于-80℃保存。缺點：需保存的克隆子數過多，工作量大。第三十六頁，共七十五頁，編輯于2023年，星期一384孔板第三十七頁，共七十五頁，編輯于2023年，星期一②影印濾膜培養法失真最小，最麻煩用包裝后的噬菌體顆粒感染細菌，并讓細菌在硝酸纖維素膜上生長，然后將濾膜上的文庫影印到其他濾膜上，以供篩選和低溫（-80℃）保存。③制備已包裝的轉導性裂解物適用于粘粒文庫，轉導性裂解物可以在低溫下長期保存。第三十八頁，共七十五頁，編輯于2023年，星期一（2）基因組文庫的保存小包裝，方便，避免反復凍融噬菌體一類的基因文庫：密封，加入少許氯仿，在4℃冰箱內可較長時間地保存（6個月），低溫冰箱可保存數年。第三十九頁，共七十五頁，編輯于2023年，星期一500kb50-300kb第四十頁，共七十五頁，編輯于2023年，星期一100-300kb，濃縮產物濃度達到100ng/ul第四十一頁，共七十五頁，編輯于2023年，星期一第四十二頁，共七十五頁，編輯于2023年，星期一第四十三頁，共七十五頁，編輯于2023年，星期一第四十四頁，共七十五頁，編輯于2023年，星期一第四十五頁，共七十五頁，編輯于2023年，星期一第四十六頁，共七十五頁，編輯于2023年，星期一三、cDNA文庫的構建cDNA文庫：是指某種生物體某一發育時期所轉錄的全部的mRNA經反轉錄形成的cDNA片段與某種載體連接而形成的克隆的集合。cDNA文庫具有組織細胞特異性，具有時效性。為什么要構建cDNA文庫？真核生物的基因組DNA龐大且含有大量的重復序列，難以分離到目的基因片段。第四十七頁，共七十五頁，編輯于2023年，星期一1.cDNA以mRNA為模板逆轉錄出的DNA稱cDNA。mRNAcDNA3’3’5’5’反轉錄酶引物2.cDNA文庫的特點（1）不含內含子序列（2）可以在細菌中直接表達（3）包含了所有編碼蛋白質的基因（時效性）（4）比基因組DNA文庫小得多，容易構建第四十八頁，共七十五頁，編輯于2023年，星期一3.構建cDNA文庫的一般步驟第四十九頁，共七十五頁，編輯于2023年，星期一第五十頁，共七十五頁，編輯于2023年，星期一（1）mRNA的來源特點：多數基因的表達具有不同程度的組織特異性和發育階段性。

選用mRNA含量高的組織材料，或通過藥物等方法提高mRNA的含量。高豐度：當特定的mRNA在細胞總mRNA群體中所占比例達到50～90％時。低豐度：當上述比例小于0.5％時。第五十一頁，共七十五頁，編輯于2023年，星期一分離mRNA用商業化的OligodT纖維柱。利用真核生物mRNA都含有一段30～300個A組成的polyA尾巴，將mRNA從總RNA（rRNA、tRNA等）中分離純化。mRNA只占總RNA的1%-5%。（2）mRNA的分離純化①原理②mRNA的分離純化纖維素柱層析法第五十二頁，共七十五頁，編輯于2023年，星期一第五十三頁，共七十五頁，編輯于2023年，星期一③mRNA的長度哺乳動物mRNA長度為500-8000bp，大部分mRNA位于1.5-2.0kb。第五十四頁，共七十五頁，編輯于2023年，星期一反轉錄酶（3）cDNA的合成①cDNA第一鏈合成逆轉錄酶能以RNA為模板合成DNA。a.OligodT引導合成法從3’-開始，無法到達5’-末端mRNAcDNA3’5’5’AAAAAAATTTTTTTOligodT引物RNA－DNA雜交分子第五十五頁，共七十五頁，編輯于2023年，星期一mRNA第五十六頁，共七十五頁，編輯于2023年，星期一b.隨機引物引導的cDNA合成法合成6～10個核苷酸長的寡核苷酸短片段，作為合成第一鏈cDNA的引物。隨機引物可用于合成特長的mRNA分子5’mRNA3’第五十七頁，共七十五頁，編輯于2023年，星期一用堿處理或用RNaseH降解mRNA-DNA雜交分子中的mRNA。mRNAcDNA3’3’5’5’反轉錄酶引物mRNAcDNA第一鏈3’3’5’5’引物cDNA第一鏈3’5’引物②降解mRNA模板RNaseH第五十八頁，共七十五頁，編輯于2023年，星期一剩下的cDNA單鏈的3’末端一般形成一個彎回來的雙鏈發卡結構（機理不明），可成為合成第二條cDNA鏈的引物。用DNA聚合酶合成第二鏈DNA。cDNA第一鏈5’cDNA第二鏈合成DNA聚合酶cDNA第一鏈cDNA第二鏈5’3’③cDNA第二鏈合成自我引導合成法第五十九頁，共七十五頁，編輯于2023年，星期一④去掉發卡結構核酸酶S1用核酸酶S1可以切掉發卡結構（這會導致cDNA中有用的序列被切掉！）。cDNA第一鏈cDNA第二鏈5’3’cDNA第一鏈cDNA第二鏈5’3’5’3’第六十頁，共七十五頁，編輯于2023年，星期一第六十一頁，共七十五頁，編輯于2023年，星期一這種酶能識別mRNA-cDNA雜交分子中的mRNA，并將其降解成許多小片斷。妙用RNaseH（置換合成法）小片斷正好成為DNA聚合酶的引物，用來合成岡崎片斷。優點：a）合成cDNA的效率高

b）直接利用第一鏈的反應產物，不需純化

c）避免使用S1核酸酶來切割雙鏈cDNA第六十二頁，共七十五頁，編輯于2023年，星期一mRNAcDNA3’5’反轉錄酶引物mRNAcDNA第一鏈3’5’引物mRNAcDNA第一鏈3’5’mRNAmRNADNA聚合酶DNA聚合酶cDNA第二鏈cDNA第一鏈3’5’RNaseHDNAligase去引物第六十三頁，共七十五頁，編輯于2023年，星期一第六十四頁，共七十五頁，編輯于2023年，星期一在雙鏈cDNA末端接上人工接頭，即可與載體連接，轉入受體菌。或借助末端轉移酶給載體和雙鏈cDNA的3’端分別加上幾個C或G，成為粘性末端。（4）cDNA與載體連接：接上人工接頭粘性末端CCCCCC末端轉移酶第六十五頁，共七十五頁，編輯于2023年，星期一第六十六頁，共七十五頁，編輯于2023年，星期一4.cDNA文庫的大小一個cDNA文庫要包含99%的mRNA時所需要的克隆數目。:某一種低豐度（不足14份拷貝）mRNA占細胞整個mRNA的比例N=ln(1-p)ln(1-)1nP: