淺論一種人硫氧還蛋白基因修飾肝細胞的制備【摘要】【目的】制備出一種人硫氧還蛋白(hTrx)基因修飾的肝細胞。【方法】逆轉錄聚合酶鏈反應法擴增出hTrxcDNA，應用重組逆轉錄病毒制備hTrx基因修飾大鼠肝細胞。白蛋白免疫組化SABC法進行肝細胞活性鑒定，MTT比色試驗進行抗氧化應激能力檢測。【結果】克隆出hTrx開放閱讀框cDNA并制備出重組逆轉錄病毒，感染真核細胞后可分泌融合表達的hTrx并具有生物學活性。制備出hTrx基因修飾大鼠肝細胞，免疫組化SABC法顯示肝細胞功能正常，MTT比色法檢測具有較強的抗氧化應激能力(P)，并可有效增殖。【結論】成功制備出一種具有較強抗氧化應激的hTrx基因修飾肝細胞。

【關鍵詞】肝細胞;人硫氧還蛋白;基因修飾

Abstract：【Objective】Topreparethehumanthioredoxin(hTrx)gene-modifiedhepatocytes.【Methods】hTrxcDNAwasamplifiedbyreversetranscription-polymerasechainreaction(RT-PCR)，recombinantretroviruswasappliedtoprimaryculturedrathepatocyteforinfectiontogeneratehTrxgene-modifiedrathepatocytes，whoseviabilityandantioxidativecapacitywereexaminedwithalbumin-immunohistochemicalstainingandMTTassay，respectively.【Results】ThehTrxopenreadingframescDNAwasclonedandassembledwithrecombinantretrovirus，theneukaryoticcellsinfectedbythisviruswerecapableofexpressingbioactivehTrxintheformoffusionproteins.ImmunohistochemistrydemonstratednormalfunctionofthehTrxgene-modifiedhepatocytes，whichpossessedstrongantioxidativecapacityasshownbyMTTassayandcouldbeproliferatedeffectively.【Conclusion】ThehTrxgene-modifiedhepatocytewithmorestrongerantioxidativecapacityisprepared.

人硫氧還蛋白(humanthioredoxin，hTrx)是目前已知Trx中活性最好的蛋白，由TrX構成的氧化還原系統廣泛存在于組織細胞中，具有清除自由基和維持體內穩定的氧化還原狀態的重要作用，對缺血再灌注損傷有明確的保護作用。Trx也可通過對轉錄因子如NF-κB等的調節作用，促進細胞的增殖及抑制細胞的凋亡等[1-2]。研究發現Trx對肝細胞生存生長具有明顯的促進作用，同時其抗氧化和凋亡抑制作用，因此可在肝細胞移植和生物人工肝細胞保存方面發揮重要作用。但能否持久地促進肝細胞的增殖，減少凋亡和氧化應激成為Trx應用的關鍵。本實驗成功進行了hTrx基因修飾肝細胞的制備，修飾后的肝細胞表現出較強的抗氧化應激能力，可緩解細胞損傷等。

1材料和方法

hTrxcDNA基因克隆

根據GenBank中hTrxcDNA序列(J04026)設計引物，引入BglⅡ、BamHⅠ酶切位點，并加入對框序列TT(不含終止子TAA)。引物：正向5′-GCAGATCTATGGTGAAGCAGATCGAGAG-3′，反向5′-GCGGATCCTTGACTAATTCATTAATGGTGGCTTC-3′。異硫氰酸胍一步法從143(TK-)人骨肉瘤細胞中提取模板RNA。應用錨定引物oligo(dT)15逆轉錄合成cDNA第一條鏈，聚合酶鏈反應(PCR)擴增hTrxcDNA基因，插入載體質粒pGEM-TEasy構建重組質粒pGEM/hTrx，并進行基因序列測定。質粒的制備、純化、酶切、連接及轉化按常規方法進行。

含hTrx基因的重組逆轉錄病毒載體的構建

大量制備逆轉錄病毒載體pLEGFP-N1(購自Clontech公司)，將其和pGEM/hTrx分別行BglⅡ、BamHⅠ聯合酶切、回收、連接。篩選鑒定含hTrx基因的重組質粒pLEGFP/hTrx。

重組逆轉錄病毒的制備

運用磷酸鈣共沉淀轉染法進行重組逆轉錄病毒的制備。取pLEGFP/hTrx，電泳定量約1g/L。加入mol/LCaCl2，加至復蘇的PA317細胞(胚胎成纖維細胞)表面，可見細密沉淀鈣粒形成。37℃下CO2培養箱內培養8h，加入含100mL/L小牛血清的DMEM培養液，置37℃培養箱內72h。g/L胰酶消化后按1：3傳代，質量濃度為400μg/mL的G418(一種氨基糖苷類抗生素)篩選高表達細胞株。14d時有多個抗性克隆形成，細胞克隆單瓶培養至抗性細胞形成單層，消化傳代后，加入DMEM培養液(不含G418)培養;收集細胞上清液進行病毒濃縮純化。加入預冷飽和硫酸銨，透析純化濃縮，經μm微孔濾膜除菌處理。

重組逆轉錄病毒滴度測定

復蘇NIH3T3細胞(小鼠胚胎成纖維樣細胞)，鋪滿培養瓶后，g/L胰酶消化，培養接種于24孔培養板。將制備的多組病毒液均相應作104、105和106倍稀釋接種在細胞表面;37℃，5%體積分數CO2條件下培養72h，熒光顯微鏡下觀察每孔含熒光的細胞數，計算病毒滴度，選擇最高滴度的病毒液為實驗用重組病毒。重組質粒含EGFP，與目的基因表達的蛋白融合，熒光顯微鏡下顯現綠色熒光，較好地反映重組逆轉錄病毒的形成情況及感染活性。

重組逆轉錄病毒感染細胞后hTrx表達和活性測定

用胰島素還原實驗進行重組逆轉錄病毒感染細胞后hTrx表達和活性測定。取重組逆轉錄病毒液，接種于NIH3T3細胞表面。37℃，5%體積分數CO2條件培養后取上清液，取不同體積(25μL、50μL、100μL)上述標本，加入實驗用Buffer，30℃反應，檢測波長為650nm時的吸光度。另取空質粒pLEGFP-N1、DMEM培養基制備對照組，本實驗前期制備的hTrx作為標準品陽性對照(1μmol/L，μmol/L，10μmol/L)。比較各組酶反應速度(某一濃度的酶在達到最大吸光度值時與所用最小時間之間的比值，用以反映該酶反應的活性)。

hTrx基因修飾大鼠肝細胞的制備

原代SD大鼠肝細胞的培養方法同前所述。將分離的大鼠肝細胞按1×106細胞/mL接種于涂有多聚賴氨酸培養瓶中，加入含100mL/L小牛血清DMEM培養基培養，加入重組逆轉錄病毒原液及8μg/mLpolybrene(凝聚胺)作用3h;重復感染一次，繼續培養48h，至培養肝細胞80%成片，以400μg/mLG418篩選肝細胞抗性克隆并生長穩定成片，熒光顯微鏡下觀察肝細胞中熒光蛋白表達情況。空質粒pLEGFP-N1制備的逆轉錄病毒制備對照組肝細胞。

hTrx基因修飾大鼠肝細胞活性鑒定

白蛋白免疫組化SABC法進行肝細胞活性鑒定。將制備的病毒感染肝細胞以g/L胰酶消化后接種于蓋玻片上，37℃，5%體積分數CO2培養4h使細胞貼壁緊密，丙酮固定。一抗兔抗鼠白蛋白單克隆抗體(1∶200)，二抗生物素化HRP-山羊抗兔單克隆抗體IgG(1∶4000)。DAB顯色，以細胞漿內出現棕黃色顆粒為陽性染色。正常大鼠原代培養肝細胞作為陽性對照。

hTrx基因修飾大鼠肝細胞抗氧化應激能力檢測

MTT比色試驗進行抗氧化應激能力檢測。將肝細胞(hTrx基因修飾大鼠肝細胞、空質粒pLEGFP-N1轉染病毒感染肝細胞及正常大鼠肝細胞)制成單細胞懸液，以每孔100μL，細胞數104接種于96孔培養板上，培養至細胞80%成片，加入實驗濃度為200μmol/LH2O2作用12h、24h和48h，每孔加入新鮮配制的MTT(g·L-1)25μL作用4h，待出現藍色結晶后，加入二甲基亞砜(DMSO)150μL，震蕩使其溶解，570nm波長下測定各組不同時間吸光度值，繪制生長曲線。

統計學方法

采用SPSS統計軟件包處理，組間均數比較采用單因素方差分析，率的比較為?字2檢驗。

2結果

克隆基因的序列

克隆上的hTrx開放閱讀框cDNA基因序列為315bp(含起始子ATG、不含終止子TAA)，推導氨基酸數104個(不含起始子ATG編碼的Met)。另外可見BglⅡ、BamHⅠ識別位點及對框堿基TT。與已知序列比對2個堿基發生改變：第117位C→G、第221位C→T，這可能由于模板來源不同所致，其它堿基完全一致。推導的氨基酸序列，第39位Asn→Lys，第74位Thr→Met，存在活性位點保守序列—Trp—Cys32—Gly—Pro—Cys35—Lys—，以及其外側3個半胱氨酸Cys殘基Cys62，Cys69和Cys73。

pLEGFP/hTrx的篩選

重組質粒經BamHⅠ單酶切后，1%瓊脂糖凝膠電泳見7172bp處有一光亮帶;BglⅡ、BamHⅠ雙酶切后在323bp、6849bp處各有一光亮帶，與理論值完全一致，確定為pLEGFP/hTrx重組載體質粒(圖1)。

重組逆轉錄病毒滴度

本實驗最高病毒滴度為×106感染數/mL，選擇該組進行擴增生產重組逆轉錄病毒，進行后續實驗。

重組逆轉錄病毒感染細胞后hTrx表達和活性

重組病毒組、空質粒病毒組及無病毒組之間酶反應活性的比較見表1，可見在各個反應劑量重組病毒組酶反應速度均遠高于空質粒病毒組和無病毒組(P=)，顯示有較高的酶反應活性，并有一定的劑量依賴性。該結果與標準品組實驗結果相似。提示本實驗制備的重組病毒感染真核細胞后，細胞可分泌融合表達的hTrx并具有硫氧還蛋白生物學活性。

hTrx基因修飾大鼠肝細胞的制備和活性

實驗制備的hTrx基因修飾大鼠肝細胞有EGFP綠色熒光蛋白表達。免疫組化SABC法檢測可見細胞漿內出現棕黃色顆粒的陽性染色，表明hTrx基因修飾大鼠肝細胞可分泌表達白蛋白，細胞功能正常(圖2)。

hTrx基因修飾大鼠肝細胞抗氧化應激能力

hTrx作為一種抗氧化劑，具有較強的抗氧化應激能力。打擊實驗中，MTT比色法檢測在12h和24h時，hTrx基因修飾組與空病毒組、正常肝細胞組D(650nm)值比較有統計學意義(P=)，48h時差異有明顯統計學差異(P=)，而后兩組在任何時間段差異均無統計學意義(P=，表1)。顯示出hTrx基因修飾大鼠肝細胞具有較強的抗氧化應激能力，并可有效增殖，表明hTrx具有明確的肝細胞保護作用。各組生長曲線之間的比較見圖3。

3討論

肝細胞移植技術已具有較為完備的實驗及理論基礎，可以治療多種肝相關疾病，但尚有許多問題有待進一步解決，包括增殖、免疫、養營等。成熟肝細胞為終末分化細胞，分裂增殖能力較差，也不能冷凍保存，移植后增殖緩慢及增殖能力受限。由于移植肝細胞數量的限制以及很難得到滿意的增殖，肝功能支持的時間及受損肝實質的替代的程度不甚理想，有研究顯示其替代作用一般不超過受體肝臟功能的1%，提高移植肝細胞的增殖指數、防止過多凋亡及氧化應激成為需要重點解決的關鍵問題之一。促進干細胞向成熟肝細胞定向轉化的研究尚需完善，對成熟肝細胞的改造仍有現實的意義。

hTrx在細胞生存和生長中具有極重要的作用，它的生物學功能包括促進細胞DNA和蛋白質合成、生長因子樣作用、抗氧化作用、轉錄因子調節以及凋亡抑制作用等。我們前期制備出具有生物學活性的rhTrx對原代培養肝細胞的生存生長也顯示出具有促進作用。外源性hTrx在體內實驗中局部應用較難進入細胞內部，很快代謝使其作用不夠持久。本實驗將目的基因導入離體肝細胞，從而達到在體內長期表達的目的。

目前已有多個實驗對肝細胞進行體外基因修飾，主要在于增強移植肝細胞的增殖與功能，降低移植后的排斥反應和逆轉肝纖維化等。在提高增殖方面，有研究將外源性基因片段整合入肝細胞DNA中，成為所謂“永生化細胞”，并能夠加以人為控制[7-8];敲除與抑制細胞增殖密切相關基因的小鼠肝細胞，移植后細胞增殖數量明顯增加;將血管內皮生長因子(vascularendothelialgrowthfactor，VEGF)、Bcl-2、肝細胞生長因子(hepatocytegrowthfactor，HGF)等基因導入供體肝細胞后移植，肝細胞的存活和再生增加，抗凋亡能力明顯增強[10-13]。本實驗制備出hTrx基因修飾肝細胞表現出較強的抗氧化應激能力，可緩解細胞損傷并可有效增殖，也進一步表明hTrx具有明確的肝細胞保護和促進增值作用。這種hTrx基因修飾肝細胞可在肝細胞移植和生物人工肝細胞保存方面發揮重要作用。

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