分解尿素的細菌的計數與分離詳解演示文稿當前第1頁\共有25頁\編于星期三\0點優選分解尿素的細菌的計數與分離當前第2頁\共有25頁\編于星期三\0點3、常見的分解尿素的微生物芽孢桿菌、小球菌、假單胞桿菌、克氏桿菌、棒狀桿菌、梭狀芽孢桿菌，某些真菌和放線菌也能分解尿素。4、課題目的①從土壤中分離出能夠分解尿素的細菌②統計每克土壤樣品中究竟含有多少這樣的細菌一.研究思路㈠.篩選菌株㈡.統計菌落數目㈢.設置對照當前第3頁\共有25頁\編于星期三\0點1、實例：PCR技術啟示：尋找目的菌種時要根據它對生存環境的要求，到相應的環境中去尋找。原因：因為熱泉溫度70～800C，淘汰了絕大多數微生物只有Taq細菌被篩選出來。DNA多聚酶鏈式反應是一種在體外將少量DNA大量復制(PCR)的技術，此項技術要求使用耐高溫（930C）的DNA聚合酶。㈠.篩選菌株當前第4頁\共有25頁\編于星期三\0點要分離一種微生物，必須根據該微生物的特點，包括營養、生理、生長條件等；方法：⑴抑制大多數微生物的生長⑵促進目的菌株的生長結果：培養一定時間后，該菌數量上升，再通過平板稀釋等方法對它進行純化培養分離。2、實驗室中微生物的篩選原理：人為提供有利于目的菌株生長的條件(包括營養、溫度、pH等)，同時抑制或阻止其他微生物生長。當前第5頁\共有25頁\編于星期三\0點15.0g瓊脂1.0g尿素10.0g葡萄糖0.2gMgSO4`7H2O2.1gNaH2PO41.4gKH2PO43、土壤中分解尿素的細菌的分離與計數所需培養基：①從物理性質看此培養基屬于哪類？固體培養基當前第6頁\共有25頁\編于星期三\0點②在此培養基中哪些作為碳源、氮源？碳源：葡萄糖氮源：尿素培養基的氮源為尿素，只有能合成脲酶的微生物才能分解尿素，以尿素作為氮源。缺乏脲酶的微生物由于不能分解尿素，缺乏氮源而不能生長發育繁殖，而受到抑制，所以用此培養基就能夠選擇出分解尿素的微生物。5、培養基選擇分解尿素的微生物的原理當前第7頁\共有25頁\編于星期三\0點允許特定種類的微生物生長，同時抑制或阻止其他種類微生物生長的培養基，叫做選擇培養基尿素尿素當前第8頁\共有25頁\編于星期三\0點6、怎樣證明此培養基具有選擇性呢？以尿素為唯一氮源的培養基牛肉膏蛋白胨培養基

是分離尿素細菌判斷該培養基有無選擇性實驗組對照組培養基類型是否接種

目的

結果只生長尿素細菌生長多種微生物是當前第9頁\共有25頁\編于星期三\0點1、顯微鏡直接計數：利用血球計數板(血細胞計數板），在顯微鏡下計算一定容積里樣品中微生物的數量。㈡.統計菌落數目：不能區分死菌與活菌；不適于對運動細菌的計數；需要相對高的細菌濃度；個體小的細菌在顯微鏡下難以觀察；缺點：當前第10頁\共有25頁\編于星期三\0點2.間接計數法（活菌計數法）⑴原理：在稀釋度足夠高時，微生物在固體培養基上所形成的一個菌落是由一個單細胞繁殖而成的，即一個菌落代表原先的一個單細胞。⑵常用方法：稀釋涂布平板法。每克樣品中的菌落數＝(C÷V)×M其中，C代表某一稀釋度下平板上生長的平均菌落數，V代表涂布平板時所用的稀釋液的體積(ml)，M代表稀釋倍數。當前第11頁\共有25頁\編于星期三\0點？說明設置重復組的重要性。在設計實驗時，一定要涂布至少3個平板，作為重復組，才能增強實驗的說服力與準確性。在分析實驗結果時，一定要考慮所設置的重復組的結果是否一致，結果不一致，意味著操作有誤，需要重新實驗。當前第12頁\共有25頁\編于星期三\0點注意事項①為了保證結果準確，一般選擇菌落數在30——300的平板上進行計數。②為使結果接近真實值可將同一稀釋度加到三個或三個以上的平板中，經涂布，培養計算出菌落平均數。③統計的菌落往往比活菌的實際數目低。當前第13頁\共有25頁\編于星期三\0點計算公式：每克樣品中的菌株數=（C÷V）×M某同學在稀釋倍數為106的培養基中測得平板上菌落數的平均數為234，那么每克樣品中的菌落數是（涂布平板時所用稀釋液的體積為0.1ml）()A.2.34×108B.2.34×109C.234D.23.4B當前第14頁\共有25頁\編于星期三\0點（三）設置對照判斷培養基中是否有雜菌污染：將未接種的培養基同時進行培養。判斷選擇培養基是否具有篩選作用：完全培養基（營養成分齊全）接種后培養觀察菌落數目。主要目的是排除實驗組中非測試因素對實驗結果的影響，提高實驗結果的可信度。當前第15頁\共有25頁\編于星期三\0點實例：在做分解尿素的細菌的篩選與統計菌落數目的實驗時，A同學從對應的106倍稀釋的培養基中篩選出大約150個菌落，但是其他同學在同樣的稀釋度下只選擇出大約50個菌落。分析其原因。原因：⑴土樣不同⑵培養基污染或操作失誤(或者是混入了其他的含氮物質)當前第16頁\共有25頁\編于星期三\0點小結：通過這個事例可以看出，實驗結果要有說服力，對照的設置是必不可少的。方案一：由其他同學用與A同學相同土樣進行實驗方案二：將A同學配制的培養基在不加土樣的情況下進行培養，作為空白對照，以證明培養基是否受到污染。結果預測：如果結果與A同學一致，則證明A無誤；如果結果不同，則證明A同學存在操作失誤或培養基的配制有問題。當前第17頁\共有25頁\編于星期三\0點從肥沃、酸堿度接近中性的濕潤土壤中取樣。先鏟去表層土3cm左右，再取樣，將樣品裝入事先準備好的信封中。“微生物的天然培養基”[一]土壤取樣數量最大、種類最多大約70%—90%是細菌◆取土樣用的小鐵鏟和盛土樣的的信封在使用前都要滅菌。當前第18頁\共有25頁\編于星期三\0點[二]制備培養基

由于初次實驗，對于稀釋的范圍沒有把握，因此選擇了一個較為寬泛的范圍：稀釋倍數為103～107。

準備牛肉膏蛋白胨培養基和選擇培養基。每個稀釋度下需要3個選擇培養基，1個牛肉膏蛋白胨培養基。還需要8個滅菌試管和1個滅菌移液管。

將稀釋相同倍數的菌液，在牛肉膏蛋白胨培養基上生長的菌落數目應明顯多于選擇培養基上的數目，因此，牛肉膏蛋白胨培養基可以作為對照，用來判斷選擇培養基是否起到了選擇作用。當前第19頁\共有25頁\編于星期三\0點◆應在火焰旁稱取土壤10g。◆在稀釋土壤溶液的過程中，每一步都要在火焰旁進行◆分離不同的微生物采用不同的稀釋度原因：不同微生物在土壤中含量不同目的：保證獲得菌落數在30～300之間、適于計數的平板（三） 樣品的稀釋當前第20頁\共有25頁\編于星期三\0點問題：為什么分離不同的微生物要采用不同的稀釋度？測定土壤中細菌的總量和測定土壤中能分解尿素的細菌的數量，選用的稀釋范圍相同嗎？原因：土壤中各類微生物的數量（單位：株/kg）是不同的。例如在干旱土壤中的上層樣本中：好氧及兼性厭氧細菌數約為2185萬，放線菌數約為477萬，霉菌數約為23.1萬。結論：為獲得不同類型的微生物，就需要按不同的稀釋度進行分離，同時還應當有針對性地提供選擇培養的條件。當前第21頁\共有25頁\編于星期三\0點㈣.取樣涂布◆實驗時要對培養皿作好標記。注明培養基類型、培養時間、稀釋度、培養物等。◆如果得到了2個或2個以上菌落數目在30——300的平板，則說明稀釋操作比較成功，并能夠進行菌落的計數，如果同一稀釋倍數的三個重復的菌落數相差較大，表明試驗不精確，需要重新實驗。當前第22頁\共有25頁\編于星期三\0點㈤.微生物的培養與觀察在菌落計數時，每隔24h統計一次菌落數目。選取菌落數目穩定時的記錄作為結果，以防止因培養時間不足而導致遺漏菌落的數目。培養不同微生物往往需要不同培養溫度。細菌：30～37℃培養1～2d放線菌：25～28℃培養5～7d霉菌：25～28℃的溫度下培養3～4d。當前第23頁\共有25頁\編于星期三\0點微生物的培養與觀察當前第24頁\