腦細(xì)胞間液藥理學(xué)的研究

腦細(xì)胞間液又稱腦細(xì)胞外液，是存在于腦神經(jīng)細(xì)胞之間的體液。它是神經(jīng)元生存的直接外環(huán)境，也是腦靶向藥物成分透過血腦屏障作用于神經(jīng)細(xì)胞的主要途徑，腦細(xì)胞間液中包涵了神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞釋放到胞外的內(nèi)源性物質(zhì)，是檢測(cè)入腦藥物成分的理想對(duì)象。基于上述理念，本課題組提出腦細(xì)胞間液藥理學(xué)的研究思路，采用微透析技術(shù)收集腦細(xì)胞間液，檢測(cè)其中藥物有效成分和內(nèi)源性成分如神經(jīng)遞質(zhì)等的變化，并研究其對(duì)細(xì)胞或組織等模型的藥效和作用機(jī)制。腦細(xì)胞間液藥理學(xué)用于腦保護(hù)中藥復(fù)方的有效物質(zhì)篩選和機(jī)制研究，具有重要的意義和明顯的優(yōu)勢(shì)。

一、腦細(xì)胞間液藥理學(xué)的概念

自田代真一等[1]首次提出“血清藥理學(xué)”的概念以來，逐漸形成了應(yīng)用此種方法研究中藥藥理的趨勢(shì)。但由于血腦屏障將大腦與外周嚴(yán)格區(qū)分，從而致使神經(jīng)細(xì)胞的微觀生存環(huán)境和屏障以外的其它體細(xì)胞有很大差別。首先，血清藥物成分與能進(jìn)入腦組織中的藥物成分也存在較大差異。血腦屏障控制著物質(zhì)的轉(zhuǎn)運(yùn)，保證中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)環(huán)境的高度穩(wěn)定。完整的血腦屏障是一個(gè)復(fù)雜的細(xì)胞系統(tǒng)，由血管內(nèi)皮細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞、周細(xì)胞、神經(jīng)元和細(xì)胞外基質(zhì)共同構(gòu)成，這一特殊結(jié)構(gòu)可使血液中多種溶質(zhì)從腦毛細(xì)血管選擇性的進(jìn)入腦組織。

其中，內(nèi)皮細(xì)胞間的緊密連接、基底膜及星形膠質(zhì)細(xì)胞的終足形成了BBB的3道機(jī)械屏障，而轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)和藥物代謝酶構(gòu)成了其酶屏障。水溶性藥物受到機(jī)械屏障的阻止，不能進(jìn)入血腦屏障。脂溶性藥物的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)受血腦屏障表面的多種轉(zhuǎn)運(yùn)體控制，轉(zhuǎn)運(yùn)體的表達(dá)受癲癇或炎癥等因素影響，間接影響到脂溶性藥物成分的透過率[2，3]。

其次，血清和腦細(xì)胞間液的基質(zhì)物質(zhì)不同。從該層意義上來講，將含藥血清用于神經(jīng)元的培養(yǎng)并不恰當(dāng)，已有實(shí)驗(yàn)證明含藥血清對(duì)神經(jīng)細(xì)胞有毒害作用[4]。所以，腦保護(hù)藥物研究不適用血清藥理學(xué)的方法，只能尋求其它手段。梅建勛等[4]提出腦脊液藥理學(xué)的概念，采用正常家兔給予受試中藥，然后從小腦延髓池穿刺采集腦脊液，用于神經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)。結(jié)果顯示，含藥腦脊液有一定的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)作用。由于腦脊液與腦細(xì)胞間液存在交換，研究腦脊液中化學(xué)物質(zhì)的變化，一定程度上可以反應(yīng)血腦屏障通透性的變化[5]，但不同藥物在腦脊液與腦細(xì)胞間液中的藥物濃度存在差距。LiuX等[6]分別采用微透析法和抽取腦脊液的方法，檢測(cè)了戊硫代巴比妥、9-羥利培酮等9種藥物在腦細(xì)胞間液和腦脊液中的含量，結(jié)果9-羥利培酮在腦脊液中的濃度是微透析液濃度的5倍，其余8種藥物腦脊液中濃度均在微透析液濃度的3倍以內(nèi)，證明腦脊液中藥物成分也有異于腦細(xì)胞間液。血-腦脊液屏障位于腦室脈絡(luò)叢的血液與腦脊液之間，其結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)主要是脈絡(luò)叢上皮細(xì)胞之間有閉鎖小帶相連，與血-腦屏障相比結(jié)構(gòu)疏松，存在滲漏的小孔，故腦脊液與血液間存在豐富的物質(zhì)交換。進(jìn)入腦脊液的小分子示蹤劑按時(shí)間順序依次在血管、毛細(xì)血管、引流靜脈和腦細(xì)胞間液中被檢出，這證明腦脊液與腦細(xì)胞間液的交換相比血液與腦脊液的交換更慢，這是因?yàn)槟X脊液中的成分要進(jìn)入腦組織間隙需要通過緊密連接，相比之下交換較為困難[5]。

基于上述研究，本課題組提出腦細(xì)胞間液藥理學(xué)的研究思路。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物口服或靜脈給藥后，采用含有藥物成分的腦細(xì)胞間液，研究對(duì)細(xì)胞或組織等模型的藥效和作用機(jī)制，即腦細(xì)胞間液藥理學(xué)。腦細(xì)胞間液是神經(jīng)細(xì)胞生存的直接外環(huán)境，也是藥物成分透過血腦屏障作用于神經(jīng)細(xì)胞的必經(jīng)途徑，故腦細(xì)胞間液是檢測(cè)透過血腦屏障藥物成分的最佳載體。參照血清藥理學(xué)，檢測(cè)腦細(xì)胞間液中藥物成分，并以其作為干預(yù)因素進(jìn)行體外實(shí)驗(yàn)是腦細(xì)胞間液藥理學(xué)的主要內(nèi)涵。

二、建立腦細(xì)胞間液藥理學(xué)的關(guān)鍵技術(shù)

微透析是灌流采樣與透析相結(jié)合的新型生物采樣技術(shù)，誕生于20世紀(jì)70年代，最早用來測(cè)定腦內(nèi)神經(jīng)遞質(zhì)的含量。因微透析具有活體微創(chuàng)、可動(dòng)態(tài)觀察、采樣量小的特點(diǎn)，在生命科學(xué)研究中應(yīng)用越來越廣泛。尤其在能透過血腦屏障藥物的藥代動(dòng)力學(xué)、生物利用度等研究中，微透析技術(shù)成為不可或缺的手段之一[7]。微透析技術(shù)用于腦細(xì)胞間液藥理學(xué)的優(yōu)點(diǎn)如下：①微透析可以用于實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的活體采樣，且對(duì)動(dòng)物的傷害較小，屬于微創(chuàng)手術(shù)。在采樣過程中可以保持小型動(dòng)物清醒活動(dòng)狀態(tài)，收集的數(shù)據(jù)能較為真實(shí)地反映動(dòng)物的活體生物指標(biāo)，不受大面積創(chuàng)傷、麻醉等激烈刺激的影響；②微透析樣品可以實(shí)時(shí)反映透析液中待測(cè)物的變化情況，以濃度為縱坐標(biāo)，時(shí)間為橫坐標(biāo)描繪待測(cè)物的量-時(shí)曲線，可以直觀地反映待測(cè)物含量的變化趨勢(shì)。若是微量樣品以微柱測(cè)定，時(shí)間間隔甚至可以縮短到3min，避免待測(cè)物因降解所造成的測(cè)定不準(zhǔn)確；③樣品中無大分子物質(zhì)，基本不需處理可直接分析。由于微透析樣品經(jīng)對(duì)大分子無通透性的半透膜透析得來，蛋白質(zhì)等大分子都被截留膜外，樣品可以直接由液相色譜、質(zhì)譜等精密儀器分析，省時(shí)高效，避免樣品處理過程中損耗、引入其它雜質(zhì)所造成的數(shù)據(jù)偏差；④腦微透析液可直接反映腦細(xì)胞間液中的藥物水平，在透析取樣過程中，由于與蛋白結(jié)合的藥物不能穿過半透膜，所以微透析樣品中所得的游離型藥物濃度更能體現(xiàn)與藥理作用的相關(guān)性；⑤微透析液是與神經(jīng)細(xì)胞外環(huán)境組成高度相似的基質(zhì)，從藥物或內(nèi)源性成分的組成都適用于神經(jīng)細(xì)胞的體外實(shí)驗(yàn)。因此，微透析技術(shù)為腦細(xì)胞間液藥理學(xué)提供了技術(shù)保障。

三、腦細(xì)胞間液藥理學(xué)用于中藥復(fù)方研究的優(yōu)勢(shì)

1.有助于中藥復(fù)方有效成分的靶向性篩選

中藥復(fù)方是中醫(yī)臨床用藥的主要形式，體現(xiàn)了中醫(yī)藥的特色與優(yōu)勢(shì)，同時(shí)，中藥復(fù)方的研究也充滿了復(fù)雜性，其作用規(guī)律及作用機(jī)制研究引起世界學(xué)者的興趣[8]。本課題組認(rèn)為，對(duì)中藥復(fù)方有效成分的研究必須與其特定功效緊密結(jié)合，具體問題具體分析[9]。我國(guó)學(xué)者王喜軍等進(jìn)行了大量的血清藥物化學(xué)的實(shí)踐研究工作，他從血清中分離、鑒定移行成分，研究血清中移行成分與傳統(tǒng)療效的相關(guān)性。中藥歸經(jīng)學(xué)說認(rèn)為，藥物的功效與其歸經(jīng)密切相關(guān)。受上述啟發(fā)，我們認(rèn)為復(fù)方的有效成分也應(yīng)與其代謝分布密切相關(guān)。靶向性篩選有助于研究中藥復(fù)方有效成分，即通過研究靶器官的藥物蓄積、代謝情況，為闡述藥物有效成分提供依據(jù)。針對(duì)腦血管疾病治療過程中的血腦屏障難題，藥物透過血腦屏障的靶向性研究是篩選腦保護(hù)中藥的重要途徑。雖然有研究表明中藥可通過作用于內(nèi)皮細(xì)胞間接干預(yù)腦實(shí)質(zhì)的病理變化[10]，但通過血腦屏障，直接作用于腦實(shí)質(zhì)是腦保護(hù)藥物的主要作用途徑[11，12]。對(duì)治療腦部疾病的中藥化學(xué)組分進(jìn)行靶向性篩選，檢測(cè)通過血腦屏障進(jìn)入腦實(shí)質(zhì)中的藥物組分，有助于發(fā)現(xiàn)中藥的腦保護(hù)物質(zhì)基礎(chǔ)。如本課題組研究了由3味中藥組成的復(fù)方塞絡(luò)通膠囊，給藥后大鼠腦微透析液中的藥物成分來源于其中兩味中藥的3種成分。

2.有利于動(dòng)態(tài)觀察腦內(nèi)藥理指標(biāo)的變化

腦缺血等疾病發(fā)生后，腦細(xì)胞間液中興奮性氨基酸、單胺類神經(jīng)遞質(zhì)和乙酰膽堿等內(nèi)源性物質(zhì)含量發(fā)生變化，反映了疾病進(jìn)程和病變機(jī)制。對(duì)腦細(xì)胞間液中上述內(nèi)源性生物活性物質(zhì)的檢測(cè)，是研究腦病發(fā)病機(jī)制和治療藥物的重要手段。如通過采用微透析技術(shù)研究腦細(xì)胞間液中興奮性氨基酸的含量，發(fā)現(xiàn)興奮性氨基酸異常釋放是腦缺血后的關(guān)鍵病理環(huán)節(jié)[13]，且一些治療藥物對(duì)此有抑制作用[14，15]。

另外，兒茶酚胺類神經(jīng)遞質(zhì)、5-HT及乙酰膽堿的釋放增加與很多腦病發(fā)病機(jī)制相關(guān)[16，17]。基于微透析技術(shù)，檢測(cè)上述神經(jīng)遞質(zhì)在腦細(xì)胞間液中的含量變化可以動(dòng)態(tài)、連續(xù)的反映其病理變化。

3.有利于體外研究中藥復(fù)方的作用機(jī)制

因腦細(xì)胞間液是神經(jīng)細(xì)胞的真實(shí)生存環(huán)境，采用微透析技術(shù)采集的樣品是腦細(xì)胞間液的稀釋液，故微透析液體外培養(yǎng)神經(jīng)細(xì)胞理論上存在可能。本課題組對(duì)MCAO大鼠給予復(fù)方中藥治療，收集腦微透析液進(jìn)行體外藥理實(shí)驗(yàn)。前期研究表明，采用含40%正常腦細(xì)胞間液的培養(yǎng)液，對(duì)正常和受損神經(jīng)元的生存率和LDH釋放率均無顯著干預(yù)作用，而加入同樣濃度的含藥腦細(xì)胞間液，對(duì)受損神經(jīng)元有顯著保護(hù)作用[18]。采用含藥微透析液，相比直接采用藥物或藥物有效成分進(jìn)行體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，具有如下優(yōu)點(diǎn)：①中藥復(fù)方制劑多為湯劑、膠囊、丸劑等，在加入培養(yǎng)液前的溶解、過濾等環(huán)節(jié)均存在較大困難，而微透析液中多為小分子物質(zhì)，僅過濾除菌即可應(yīng)用，其成分不會(huì)發(fā)生改變；②微透析液中的藥物成分是復(fù)方經(jīng)吸收、代謝、透過血腦屏障后到達(dá)作用部位的實(shí)際狀態(tài)，更接近藥物在臨床中的應(yīng)用；③中藥復(fù)方有可能作用于神經(jīng)元外的其它細(xì)胞而發(fā)揮作用，如促進(jìn)星型膠質(zhì)細(xì)胞分泌神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子，而腦細(xì)胞間液體現(xiàn)了給藥后腦內(nèi)的內(nèi)源性分子改變，所以可更全面體現(xiàn)復(fù)方的腦保護(hù)功效。

4.反映病理狀態(tài)下血腦屏障透過率的改變

在血清藥理學(xué)研究中，人們注意到中藥復(fù)方進(jìn)入生理狀態(tài)下的動(dòng)物機(jī)體與進(jìn)入病理狀態(tài)的動(dòng)物機(jī)體，其體內(nèi)過程是不一致的[19]。在病理狀態(tài)下，藥物通過血腦屏障的透過率也不同于生理狀態(tài)。腦缺血引起炎癥反應(yīng)、蛋白酶激活、氧自由基產(chǎn)生等一系列的病理變化，會(huì)導(dǎo)致緊密連接的破壞和血腦屏障通透性的增加，有些藥物較生理狀態(tài)時(shí)更容易進(jìn)入血腦屏障[2]，如銀杏內(nèi)酯B在缺血側(cè)半腦的藥物濃度顯著高于健側(cè)[20]。但有些藥物與之相反，如Spudich等[21]發(fā)現(xiàn)在局灶性腦缺血發(fā)生后，腦毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的抗藥轉(zhuǎn)運(yùn)體Mdr-1表達(dá)明顯上調(diào)，造成某些藥物透過血腦屏障明顯受阻。所以，腦缺血中風(fēng)治療藥物的靶向性研究應(yīng)在其相應(yīng)病理模型上進(jìn)行。另外，給藥劑量也應(yīng)按臨床正常用量進(jìn)行人與動(dòng)物給藥劑量換算，既與臨床用藥規(guī)范相符合，又不會(huì)改變藥物代謝及與機(jī)體間的相互作用[1]。

四、腦細(xì)胞間液藥理學(xué)尚須解決的問題

病理狀態(tài)下血腦屏障通透性發(fā)生改變，腦細(xì)胞間液中藥物含量與生理狀態(tài)下有所不同，更接近臨床實(shí)際。從篩選藥物靶向性物質(zhì)基礎(chǔ)的角度，應(yīng)采集病理模型動(dòng)物的微透析液進(jìn)行分析。但因病理狀態(tài)下，微透析液中內(nèi)源性毒性物質(zhì)含量也同時(shí)增加，如微透析液中興奮性氨基酸含量會(huì)增加至正常水平的數(shù)十甚至數(shù)百倍，對(duì)神經(jīng)細(xì)胞具有毒性作用。故病理狀態(tài)下微透析液不能直接用于體外神經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)。尋求一種既能體現(xiàn)臨床實(shí)踐中透過血腦屏障的藥物成分含量