Apoptosis細胞生物學系李莉lily@概述程序性細胞死亡(programmedcelldeath,PCD)凋亡(apoptosis),I型程序性細胞死亡自噬性細胞死亡(autophagiccelldeath),II型程序性細胞死亡壞死(necrosis)概述根據形態學特征,細胞死亡分為：Apoptosis/凋亡Autophagiccelldeath/自噬性細胞死亡Necrosis/壞死TheNomenclatureCommitteeonCellDeath(NCCD)CellDeathandDifferentiation(2009)16,3–11

細胞凋亡概念的形成

1964年Lockshin,R.A.和WilliamsC.M.明確提出程序性細胞死亡（programmedcelldeath,PCD）1965年JohnKerr提出凝集性壞死(shrinkagenecrosis)

1972年JohnKerr等三位科學家提出細胞凋亡(Apoptosis)的概念

Apoptosis源于希臘語，apo意為from，ptosis意為fall，用于描述花兒凋謝、樹葉落下的自然景色。(J.InsectPhysiol.10:643–649,1964)(JPathol.Bacteriol.90:419,1965)(BrJCancer.26:239–257,1972)

細胞凋亡概念的形成

細胞凋亡深入到基因水平的研究起始于秀麗隱桿線蟲(Caenorhabditis

elegans)SydneyBrenner,JohnE.Sulston系統研究了線蟲整個發育過程中的細胞分裂和分化，于1998年完成了線蟲的基因組測序工作。1970-1980年間，美國科學家RobertH.Horvitz

研究了線蟲細胞凋亡過程中的基因調控機制。三位科學家獲得2002年生理和醫學諾貝爾獎。羅伯特-霍維茨悉尼-布雷內約翰-蘇爾斯頓一、凋亡細胞的生物學特征1.細胞凋亡的形態學特征2.細胞凋亡的生物化學特征3.細胞凋亡的生理意義1.細胞凋亡的形態學特征1.凋亡的起始階段：

細胞變圓,偽足收縮;細胞質、細胞核體積縮小（固縮，pyknosis）;細胞器多無明顯變化

核染色質密度增高,凝聚在核膜周邊（邊緣化），呈半月形.2.凋亡小體的形成：核仁裂解，核染色質斷裂，細胞膜內陷將細胞進行分割;細胞表面產生許多泡狀或芽狀突起（blebbing）;形成單個的凋亡小體（apoptoticbody）。1.細胞凋亡的形態學特征1.細胞凋亡的形態學特征/flowcyt/research/cytotech/apopto/data/malorni/malorni.htmScanningelectronmicroscopy.Epithelialcells.Differentstages.1.細胞凋亡的形態學特征3.凋亡小體被鄰近的細胞吞噬并消化NATURECELLBIOLOGY|VOL2|JUNE2000,E1042細胞呈現沸騰運動，細胞膜發泡3凋亡小體形成5單核巨噬細胞吞噬1細胞體積變小，染色質凝集，周邊化，呈新月形4上皮細胞吞噬

1.細胞凋亡的形態學特征細胞壞死的形態學特征:膜通透性增加;細胞質、細胞器腫脹（線粒體腫脹）；溶酶體破壞；細胞膜破裂；核染色質不規則位移；引起嚴重的炎癥反應；成群細胞丟失；最終被巨噬細胞吞噬。細胞凋亡

細胞壞死1.單個細胞丟失細胞成群丟失2.細胞膜發泡但仍完整細胞膜不完整3.細胞膜內陷將細胞細胞腫脹、溶解分割成凋亡小體4.不發生炎癥反應發生嚴重炎癥反應5.被鄰近正常細胞被巨噬細胞所吞噬或吞噬細胞所吞噬6.溶酶體完整溶酶體裂解7.染色質均一凝集染色質聚集成塊、不均一

細胞凋亡與壞死在形態學上的差別細胞壞死的形態變化過程細胞凋亡的形態變化過程

A壞死細胞B凋亡細胞細胞凋亡與細胞壞死在形態學上的區別3.SEMofanecroticcell.Numerouslesionsappearonthecellsurface.

4.SEMofanapoptoticcell.Surfaceblebbingisevident.

細胞凋亡與細胞壞死在形態學上的區別2.細胞凋亡的生物化學特征凋亡細胞膜上出現一些標志性變化:磷脂酰絲氨酸(PS)由膜內側翻到膜外表面NATURECELLBIOLOGY|VOL2|JUNE2000,E1042.細胞凋亡的生物化學特征

胞質內：蛋白酶(caspase)活化，發生級聯反應（cascade）,并伴隨有能量消耗、新基因轉錄或蛋白質合成DNA片段化：細胞核內染色質DNA被核酸內切酶降解;從凋亡細胞中提取的DNA在瓊脂糖凝膠電泳中呈梯狀

(DNAladder)。2.細胞凋亡的生物化學特征細胞壞死的生物化學特征

線粒體相關的功能紊亂,ROS(ReactiveOxideStress)的產生、ATP供應不足、Ca2+流失衡等；

溶酶體膜電位(LMP,lysosomalmembranepermeabilization)變化

；組織蛋白酶（cathepsins）等活化；染色質DNA被隨機降解為任意長度的片段,在瓊脂糖凝膠電泳中呈現彌散性（smear）的DNA圖譜。3.細胞凋亡的生物學意義1.確保正常個體發育：2.維持內環境穩定：一、細胞凋亡信號細胞外部：細胞微環境中的某些因子、相鄰細胞等細胞內部：DNA損傷、活性氧等。不同的因素啟動細胞凋亡的方式不同，所引起的信號傳遞途徑也不相同。

二、細胞凋亡的信號轉導途徑二、細胞凋亡的信號轉導途徑1.依賴于胱天蛋白酶的信號傳導途徑2.不依賴于胱天蛋白酶的信號傳導途徑

細胞凋亡的信號轉導途徑

接受凋亡信號

凋亡調控分子間的相互作用

蛋白水解酶（caspases）的活化

凋亡的級聯反應1.依賴于胱天蛋白酶的信號傳導途徑

Caspases(Cysteinal-aspartic-acid–proteases):胱天蛋白酶，特異性水解底物天冬氨酸C端肽鍵哺乳動物中已發現15種同源分子，其中7種參與了細胞凋亡的過程。Caspases體內的存在形式：以胱天蛋白酶原（zymogen）的形式合成，呈低水平組成性表達。酶原主要由兩部分組成：前導肽結構域（prodomain）（氨基端）和酶活性區域。CaspasesCaspase的活化凋亡啟動亞類Caspase（Initiatorcaspase

）：Caspase－8，9，10。凋亡效應亞類Caspase（effector

caspase）：Caspase－3，6，7。其中-3和-7導致DNA修復受到抑制，引起DNA的降解；-6的底物是laminA和keratin18，降解后引起核纖層和細胞骨架的去組裝。Caspases同源活化（homo-activation）/自身活化（self-activation）：起始酶（initiators）的活化。起始Procaspase有少量蛋白水解酶活性，可與來源于同一前體的Procaspase之間發生

互相降解和活化。Caspase的活化異源活化（hetero-activation）：活化的caspase催化水解同一家族中其它procaspase成員的活化途徑。將凋亡信號級聯放大。Caspase的活化Caspase的效應機制效應性caspase可裂解多種底物蛋白：多種蛋白激酶，如FAK等。FAK的降解可使細胞喪失粘附能力，形成游離細胞核纖層蛋白，導致細胞染色質固縮細胞骨架結構蛋白，如微絲等，使細胞變形Caspase的效應機制效應性caspase可裂解多種底物蛋白：活化核酸酶，Caspase激活的脫氧核糖核酸酶（caspase-activateddeoxyribonulease，CAD），正常活細胞核酸酶CAD與其抑制物ICAD結合在一起處于無活性狀態caspase可以裂解其抑制物ICAD而激活核酸酶CADCaspase的效應機制Caspase的效應機制效應性caspase可裂解多種底物蛋白：

DNA修復酶，如多聚（ADP-核糖）聚合酶（poly(ADP-ribose)polymerase,PARP）細胞凋亡的外在途徑(extrinsicpathway)

由細胞膜上的死亡受體接受外環境中的死亡信號并迅速激活胞內胱天蛋白酶級聯反應，使凋亡信號放大并傳遍整個細胞，引起凋亡效應。1.依賴于胱天蛋白酶的信號傳導途徑死亡受體：FasL等配體通過與細胞表面相應的受體結合而啟動細胞凋亡信號傳遞，這類受體統稱為細胞凋亡受體或死亡受體（DeathReceptor）

死亡受體（DeathReceptor）死亡受體（DeathReceptor）屬于腫瘤壞死因子受體(TNFR)/神經生長因子受體(NGFR)家族其中：TNFR-1、Fas(APO-1或CD95)及TNF相關凋亡誘導配體（TNF-relatedapoptosisinducingligand，TRAIL）的受體是研究最多的3個細胞凋亡受體。胞外區:結構相似，有多個富含半胱氨酸殘基的保守序列。胞內區:有一段約90個氨基酸殘基組成的基序（motif），稱為死亡結構域(deathdomain,DD)。DD不具有任何酶活性，但可與具有相似死亡結構域的蛋白質結合。死亡受體（DeathReceptor）ADeathReceptorDDDDDEDDEDDEDFas(CD95)介導的細胞凋亡信號傳遞途徑DED,deatheffectordomain

死亡效應結構域FADD,Fas-associateddeathdomain,

Fas相關死亡結構域蛋白DD,deathdomain,死亡結構域HIV介導的細胞凋亡TNFTNFR細胞膜DD死亡結構域FADDTRADD,TNFreceptorassociateddeathdomainprotein,TNF受體相關死亡結構域蛋白天冬蛋白酶原-8

細胞死亡2.

細胞凋亡的內在途徑(intrinsicpathway)

射線、化學物質等造成DNA損傷以及藥物和活性氧等的直接作用，通過活化凋亡調節蛋白直接或間接地影響線粒體膜的通透性，而使線粒體釋放一些細胞凋亡相關分子，并啟動細胞凋亡的級聯反應，引起細胞凋亡的過程。1.依賴于胱天蛋白酶的信號傳導途徑

細胞凋亡的內在途徑凋亡信號刺激細胞引起：1.線粒體膜通透性（mitochondrialmembranepermeability,MMP）增加；2.跨膜電位（△φ）下降；3.膜孔變大，導致線粒體內的電子載體蛋白細胞色素C釋放。1.CytC2.胞質中的Apaf-1因子(凋亡蛋白酶活化因子apoptosisproteaseactivatingfactor1，Apaf-1)3.脫氧三磷酸腺苷4.多個Procaspase-9形成一個活化的凋亡體（apoptosome)。細胞凋亡的內在途徑凋亡體使半胱氨酸蛋白酶原-9被水解形成有活性的半胱氨酸蛋白酶-9，再進一步激活下游的半胱氨酸蛋白酶的級聯反應，誘導凋亡

。細胞凋亡的內在途徑細胞凋亡的內在途徑DeathReceptorpathwayAIF:apoptosisinducingfactorIAP：inhibitorofapoptosis2.不依賴于胱天蛋白酶的信號傳導途徑

Bcl－2家族與細胞凋亡P53與細胞凋亡三、細胞凋亡的調控線蟲(Caenorhabditis

elegans)為細胞凋亡的研究作出了巨大貢獻。線蟲在發育過程中，共產生1090個細胞，其中131個細胞發生凋亡。1970-1980年間，美國科學家RobertH.Horvitz研究了線蟲細胞凋亡過程中的基因調控機制，獲得2002年生理和醫學諾貝爾獎。1.Bcl-2家族與細胞凋亡線蟲中有15個基因與PCD有關，其中ced3(celldeathabnormal)和ced4基因是促進細胞凋亡，ced9基因抑制細胞凋亡。突變體ced-3:所有的131個細胞存活ced-4:所有的131個細胞存活ced-9:在胚胎發生過程中所有的細胞死亡1.Bcl-2家族與細胞凋亡1.Bcl-2家族與細胞凋亡Bcl-2（Bcelllymphoma/leukemia-2）B細胞淋巴瘤/白血病-2

Bcl-2是一種原癌基因，是ced-9在哺乳類中的同源物促進細胞存活(survival)，抑制細胞凋亡,而不是促進細胞增殖（proliferation）

Bcl-2家族已發現15個成員Bcl-2家族所有Bcl-2家族成員均含有1個或多個BH結構域:Bcl-2同源區(Bcl-2homologue,BH)BH1、BH2控制Bcl-2家族成員之間形成同二聚體或異二聚體，調控細胞死亡BH4對發揮抗凋亡作用起關鍵作用BH3對發揮促凋亡作用起關鍵作用Bcl-2家族根據對細胞凋亡調節功能的不同，將Bcl-2家族成員分為兩類：抗凋亡的負調節因子；促進細胞凋亡的正調節因子Bcl-2家族Bcl-2亞家族：

Bcl-2、Bcl-xl、

Bcl-w、Mcl-1、A1。具有BH1、BH2、BH3和BH4四個結構域。Bcl-2亞家族成員抑制細胞凋亡Bax亞家族：Bax、Bak、Bok，具有BH1、BH2、BH3三個結構域，它們的作用與Bcl-2亞家族的作用相反，可促進細胞凋亡BH3亞家族：Bik、Blk、Hrk、BNIP3、Biml、Bad、Bid；僅有BH3結構域。它們的作用也與Bcl-2亞家族的作用相反，可促進細胞凋亡Bcl-2家族調控細胞凋亡的機制改變線粒體的氧化還原狀態和膜電位調節線粒體膜的通透性1.Bcl-2家族與細胞凋亡VDAC（voltage-dependentanionchannel）：

電壓依賴的離子通道P53是腫瘤抑制基因，其產物主要存在于細胞核內；在依賴P53蛋白的細胞凋亡中，P53基因通過調節Bc1-2和Bax基因的表達影響細胞凋亡：特異地抑制Bc1-2的表達，促進Bax的表達。2.P53與細胞凋亡自噬性細胞死亡AutophagiccelldeathAutophagy1963ChristiandeDuve提出；溶酶體清除自身成分或侵入的異源物質；可以清除多余的、損傷的或衰老的細胞器，以及長壽命的蛋白質；調節細胞代謝平衡、維持自穩；一種真核細胞中普遍存在的生理過程；在個體發育、人類疾病、細胞應對饑餓等應激條件時發揮重要作用。

NatureCellBiology12,2010:817Autophagy

自噬Autophagy

自噬分類：MacroautophagyMicroautophagyChaperone-mediatedautophagy(CMA)

Chaperone-mediatedautophagyNatureCellBiology12,2010:823Autophagy

自噬aNucleation/Assembly成核/組裝

bMembraneelongation膜延長dFusion融合自噬性溶酶體eDegradation降解NatureCellBiology9,2007.1102-1109cAutophagosome自噬體Schematicdepictionofautophagy.

Nature，

2007,8:742自噬相關基因，AuTophaGy-related

，AtgLC3-ILC3-II

Autophagiccelldeath‘Autophagiccelldeath’ismorphologicallydefinedasatypeofcelldeaththatoccursintheabsenceofchromatincondensationbutaccompaniedbymassiveautophagicvacuolizationofthecytoplasm.Incontrasttoapopto