霍亂弧菌檢測演示文稿目前一頁\總數三十二頁\編于二十一點學習要點：霍亂弧菌概述與分類霍亂弧菌的標本采集霍亂弧菌的分離培養霍亂弧菌的鑒定目前二頁\總數三十二頁\編于二十一點霍亂弧菌（V.cholera）是人類霍亂的病原體，霍亂是一種古老且流行廣泛的烈性傳染病之一。曾在世界上引起多次（7次）大流行。典型臨床表現：劇烈的嘔吐、腹瀉（無痛性）、米泔水樣便、脫水，死亡率甚高。屬于國際檢疫的烈性傳染病。一、概述目前三頁\總數三十二頁\編于二十一點大便≈小便目前四頁\總數三十二頁\編于二十一點病原學形態：霍亂弧菌屬于弧菌科弧菌屬，革蘭染色陰性菌體短小，稍彎曲，兩端鈍圓，長1.5～2.0μm,寬0.3～0.4μm。菌體尾端有單鞭毛，運動極為活潑，在暗視野顯微鏡下呈流星樣運動，培養溫度以37℃為最適宜，在堿性（PH8.8～9.0）肉湯（或蛋白胨）培養基上易于生長（耐堿怕酸）

目前五頁\總數三十二頁\編于二十一點革蘭染色鞭毛染色霍亂弧菌涂片、染色目前六頁\總數三十二頁\編于二十一點根據O抗原的特異性，可將霍亂弧菌分成200個血清群。根據是否與O1抗血清凝集分兩大群，

O1群霍亂弧菌：凡能與O1群抗血清發生凝集非O1群霍亂弧菌：凡不被O1群抗血清凝集的。分群與分型目前七頁\總數三十二頁\編于二十一點目前八頁\總數三十二頁\編于二十一點1、古典生物型（前6次大流行）2、E1Tor生物型（第7次1961年來）。兩個生物型具有相同的血清型。我國流行以ElTor霍亂弧菌為主。O1群霍亂弧菌的生物型目前九頁\總數三十二頁\編于二十一點古典生物型與El-Tor生物型區別特征古典生物型El-Tor生物型羊紅細胞溶血-D雞紅細胞凝集-+V-P試驗-+多粘菌素B敏感試驗+-IV組噬菌體裂解+-V組噬菌體裂解-+目前十頁\總數三十二頁\編于二十一點

O1群霍亂弧菌的血清分型及抗原成份型別別名O抗原成份原型稻葉型（Inaba）A、C異型小川型（Ogawa）A、B（少量C）中間型彥島型（Hikojima）A、B、C目前十一頁\總數三十二頁\編于二十一點O139群霍亂弧菌1992年，在印度印度馬德拉斯、泰米爾納德發生的霍亂疫情，分離到的菌株不與O1群霍亂血清凝集，但是引起O1群霍亂的典型癥狀。引起WHO重視，定為O139群霍亂弧菌，被認為下一次霍亂大流行主角。非O1群霍亂弧菌（O139霍亂）目前十二頁\總數三十二頁\編于二十一點生化特征與O1菌基本相同。含有與O1群霍亂弧菌相同毒力基因除O抗原不同外，其它性狀均與EL-Tor生物型相似。毒力蛋白及其調控因子與El-Tor霍亂具有高度同源的編碼。O139霍亂弧菌菌可以產生莢膜與O1群霍亂無交叉免疫力環境適應能力強耐藥性強O139群霍亂弧菌的生物學特征目前十三頁\總數三十二頁\編于二十一點二、標本的采集與送檢概述：標本采集：

病例：糞便、肛拭子、嘔吐物未使用抗生素之前“健康”人：糞便、肛拭子其他傳播環節的標本：食物、水、環境類樣品……

監測：水樣，水產品等標本運送：一般要求在6小時內室溫（20-25℃）條件下送達實驗室檢測，

C-B運輸培養基（pH8.4）;（或文臘二氏保存液）

堿性蛋白胨水（）

：培養基質量的保證：堿性胨水要澄清透明（表明未長細菌）、8-10ml量要足。不符合規定，立即通知相關實驗室或CDC更換。便量合適：不要太少，不能太多（改變培養基的pH）。送檢及時：6h內送檢。目前十四頁\總數三十二頁\編于二十一點1、糞便標本（1）采樣逢疑必采應在發病早期，服用抗菌藥物之前完成，并盡快送到檢驗室。糞便標本采集方法如下：用棉拭子采取自然排出的新鮮大便，也可用直腸棉拭或采便管由肛門插入直腸內3cm-5cm處采取，水樣便采取1ml-3ml，成型便采取指甲蓋大小的糞便量。病人的嘔吐物，沾染糞便的衣服和用具，也可作為檢材。目前十五頁\總數三十二頁\編于二十一點注意！因腹瀉病因復雜，霍亂輕型病例的癥狀與體征很不明顯，不易與其他病因引起的腹瀉相區別。因此，霍亂流行季節，逢瀉必采是必須遵守的原則目前十六頁\總數三十二頁\編于二十一點（2）送檢劇烈腹瀉病人的水樣便含有大量病菌，直接分離培養不難檢出陽性。條件允許的醫院，通知實驗室人員直接水樣便接種四號平板培養。縮短檢測時間。不能立即檢查的，要接種于培養基內，盡快送往檢驗室。送檢標本可放入（）堿性蛋白胨水（不是最佳的，尤其6小時內還不能進行培養時，盡量采用C-B運輸培養基。），也可放入文—臘二氏保存液或插入Cary-Blair二氏半固體保存培養基中。目前十七頁\總數三十二頁\編于二十一點水體的采樣一般要求用滅菌的500ml水樣瓶采集相對靜止的表層水（水面30cm以內）450ml，加蓋密封后快速送檢。取水點的選擇應結合流行病學調查等資料確定，同時，采樣時應選擇在水流平穩或靜止處吸取。非疫情狀態下的監測采樣時間一般在清晨時，此時水體未受人群活動等因素影響。2、水樣標本目前十八頁\總數三十二頁\編于二十一點水生動物的采樣通常選取活的或新鮮的水生動物為采集對象，有時也應考慮冰凍的水生動物，以無菌操作采集合適的部位，如鰓部和/或腸內容物等，置采樣瓶（管）或食品采樣袋密封，在常溫下送檢。有條件的采樣點可將水生動物整體采回實驗室再進行相關處置。同時，要求以無菌棉簽涂抹五只（條）以上的某類水生動物體表、鰓及/或肛門，置堿性蛋白胨水送檢，每管堿性蛋白胨水作一份樣品看待。3、生物標本目前十九頁\總數三十二頁\編于二十一點增菌：堿性蛋白胨水（pH8.6）作為增菌液；分離：強選擇性分離培養基（慶大霉素培養基或TCBS培養基或4號培養基）分離；弱選擇性培養基使用堿性瓊脂或堿性膽鹽瓊脂。應注意不同廠商以及不同批號培養基的質量，每批培養基在使用前必須進行質量檢測。三、霍亂弧菌的培養分離目前二十頁\總數三十二頁\編于二十一點

挑取糞便，直接接種于堿性蛋白胨水（第一管）中，同時劃線分離選擇性平板（慶大／四號／ＴＣＢＳ平板，第一板）。

第一管堿性蛋白胨水在３７℃增菌６－８小時，沾取菌膜下表層液體，劃線分離選擇性平板（慶大／四號／ＴＣＢＳ平板，第二板），同時吸取0.1～0.2ml表層培養物，接種堿性蛋白胨水（第二管）。

第二管堿性蛋白胨水增菌１８小時后劃線分離選擇性平板（慶大／四號／ＴＣＢＳ平板，第三板）。分離培養要點（兩管三板法）：目前二十一頁\總數三十二頁\編于二十一點目前二十二頁\總數三十二頁\編于二十一點經典的鑒定步驟要求每個平板應挑取5個以上可疑菌落,轉種于克氏雙糖斜面或者普通瓊脂斜面待分純培養后,再進行O1、O139群血清玻片凝集試驗，鑒于對霍亂疫情應急處理的考慮,現大多數監測實驗室一般采用將血清玻片凝集試驗前置的做法,作為快速篩查的手段,直接對平板上生長的單個可疑菌落進行玻片凝集試驗,出現明顯凝集時可做初步報告,對平板上出現可疑凝集的菌株必須馬上轉種于克氏雙糖斜面或者普通瓊脂斜面,待純培養物生長良好后再次進行玻片凝集試驗加以確證。

慶大霉素平板和4號瓊脂：多呈半透明狀，菌落中央常呈灰色或灰黑色，并隨培養時間的延長而加深（由于這類培養基均含有亞碲酸鹽成份）。TCBS（硫代硫酸鹽枸櫞酸鹽膽鹽瓊脂）：菌落生長呈黃色發亮、表面光滑、潤濕、稍凸起、邊緣整齊。（TCBS平板生長的菌落不能直挑取進行玻片凝集試驗，需按經典方法進行純培養后再進行玻片凝集試驗）

可疑菌落的挑取目前二十三頁\總數三十二頁\編于二十一點4號平板目前二十四頁\總數三十二頁\編于二十一點TCBS平板培養菌落形態（呈黃色）目前二十五頁\總數三十二頁\編于二十一點染色鏡檢革蘭染色陰性的短桿菌血清凝集試驗：

分別使用O1群，O139群霍亂血清進行凝集試驗，同時使用生理鹽水進行對照凝集，以排除與生理鹽水發生凝集的自凝菌。生理鹽水不凝集，O1群血清明顯凝集的菌落，進一步使用稻葉型和小川型血清進行凝集試驗，判定型別：稻葉型血清凝集而小川型血清不凝集的菌落為稻葉型，小川型血清凝集而稻葉型血清不凝集的菌落為小川型，如稻葉型血清和小川型血清均出現凝集的時候，要注意鑒別是否為彥島型，需進行試管凝集試驗且兩者的凝集效價均超過一半以上才能判定為彥島型，因為某些小川型菌落自身會帶有少量的C抗原而出現與稻葉型血清發生弱凝集，因此如小川型血清凝集較稻葉型血清凝集有明顯優勢時應維持小川型的判定。生理鹽水不凝集，O139群血清明顯凝集的菌落，一般為O139群，但其與O22群及O155群甚至一些非霍亂弧菌會出現交叉凝集，由上級實驗室進行進一步確認。結合菌落特征和菌體形態，作出初步報告。必須注意同一樣品中O1、O139群霍亂弧菌可能同時存在，有必要對所有選出的菌株都進行凝集試驗，以免遺漏。四、霍亂弧菌鑒定-玻片凝集目前二十六頁\總數三十二頁\編于二十一點霍亂弧菌的血清學鑒定要點9cm平板，1劃1，嚴禁1劃2。純培養做血清學鑒定。凝集，肉眼可見大顆粒。不要誤判。血清學凝集同時做鹽水凝集對照，自凝菌排除。血清學凝集覆蓋O1與O139。霍亂弧菌鑒定，以血清學為主，血清學凝集陽性即可初步報告。區別于腸桿菌科細菌（生化報告）。目前二十七頁\總數三十二頁\編于二十一點進一步實驗氧化酶試驗1％鹽酸對氨基二甲基苯胺或鹽酸二甲基對苯二胺水溶液

粘絲試驗0.5％去氧膽酸鈉水溶液

目前二十八頁\總數三十二頁\編于二十一點進一步實驗生化鑒定

生化鑒定管：發酵葡萄糖、甘露醇、蔗糖、產酸不產氣能分解色氨酸賴氨酸、鳥氨酸脫羧酶（+）精氨酸雙水解酶（-）

霍亂弧菌生化鑒定管（11種生化,套裝，環凱）；

生化鑒定條：梅里埃API20E鑒定條等全自動生化檢測儀檢測：梅里埃VITEK2COMP全自動生化鑒定卡等進一步分型鑒定(省CDC進行)噬菌體分型PFGE脈沖場分型目前二十九頁\總數三十二頁\編于二十一點快速檢測試劑盒1