利用小鼠動物模型

研究基因表達與病理發育

鄭耀武轉基因動物實驗中心綜合實驗樓20585098583目前一頁\總數八十七頁\編于六點轉基因動物技術原理與應用第一部分： 常規轉基因技術原理第二部分： 基因定位修飾技術原理第三部分：

CRISPR/Cas9技術原理與應用目前二頁\總數八十七頁\編于六點第一部分常規轉基因動物原理與應用目前三頁\總數八十七頁\編于六點什么是轉基因？狹義：人為將DNA片段插入基因組廣義：人為的對生物基因組的修飾，包括隨機的基因片段插入，基因定位敲除，基因定位敲入，基因定點突變等目前四頁\總數八十七頁\編于六點動物轉基因的重要性基礎理論研究

（小鼠）研究基因調節，包括啟動子功能基因功能追蹤（Knockout，GeneTrap）細胞追蹤，如癌細胞轉移（如EGFP基因敲入）基因表達與胚胎發育，器官發育基因表達與生物學功能、病理發育基因突變體表達功能研究基因相互作用應用研究（大動物）生產活性蛋白：酶，疫苗，抗體，生長因子，蛋白藥（蛋白活性要求特異的翻譯后修飾）低生產成本：轉基因動物可以傳代，可以連續生產，如血漿蛋白，乳蛋白，比細胞培養成本低病理動物模型，利用動物模型研究疾病發生機理、藥效測試器官移植：解決器官不足，重復感染問題，如豬肝臟品種改良(GMO)：抗病，高產，營養價值提升疾病治療：治療遺傳缺陷，組織再生目前五頁\總數八十七頁\編于六點轉基因技術研究歷史第一個轉基因小鼠：1974年第一個小鼠干細胞：1981年第一個基因捕獲小鼠：1989年第一個基因敲除小鼠：1997年第一個克隆動物：2008年第一個CRISPR/CAS9小鼠RudolfJaenischin1974.JaenishsuccessfullymanagedtoinsertforeignDNAintoearly-stagemouseembryoresultingmicecarriedmodifiedgeneinalltheirtissuesandprogeny.Gossler,A.,A.L.Joyner,etal.(1989)."Mouseembryonicstemcellsandreporterconstructstodetectdevelopmentallyregulatedgenes."Science244(4903):463-5.

MartinGR.Isolationofapluripotentcelllinefromealrymouseembryosculturedinmediumconditionedbyteratocarcinomastemcells.ProcNatlAcadSci

(USA).1981;78:7634-8.HooperM,HardyK,HandysideA,HunterS,MonkM.HPRT-deficient(Lesch-Nyhan)mouseembryosderivedfromgermlinecolonizationbyculturedcells.Nature.1987;326:292-5.

MultiplexgenomeengineeringusingCRISPR/Cassystems.CongL,RanFA,CoxD,LinS,BarrettoR,HabibN,HsuPD,WuX,JiangW,MarraffiniLA,ZhangF.Science.2013Feb15;339(6121):819-23.doi:10.1126/science.1231143.Epub2013Jan3.Dolly(5July1996–14February2003)wasafemaledomesticsheep,andthefirstmammaltobeclonedfromanadultsomaticcell,usingtheprocessofnucleartransfer.目前六頁\總數八十七頁\編于六點常見轉基因技術常規方法：受精卵細胞核DNA顯微注射，隨機插入，預見性低，但多樣性利用精子轉染DNA，效率低，重復性差利用轉坐子進行DNA在基因組的插入，方法復雜，受限多病毒感染：效率高，隨機性低，可帶DNA大小受限制，安全隱患，常用于大動物干細胞／胚胎顯微注射：常用于小鼠基因定位修飾，預見性高，費時，大動物不成功核移植／動物克?。捍髣游锘蚨ㄎ恍揎椢ㄒ煌緩紺RISPR/Cas9技術：最新發展的，快速、簡便、高效基因組修飾技術目前七頁\總數八十七頁\編于六點真核基因結構與調節真核基因結構（ciselement)：啟動子(promoter)，外顯子(exon)，內含子(intron)，polyA信號,活化信號（enhancers),沉默信號（silencers），封閉區(Insulators)轉錄因子(transelement)(transcriptionfactors)，活化因子(activators)，抑制因子(inhibitors)真核mRNA結構：Cap，5’非編碼區(5’-UT)，編碼區(codingregion)，3’非編碼區(3’-UT)，polyA組織專一性調節(tissue-specificregulation,spatial)發育階段調節(developmentalregulation,timingly)誘導性調節(inducible)轉錄后調節:mRNA剪接和修飾，mRNA的穩定性，蛋白質合成效率，蛋白質半衰期

目前八頁\總數八十七頁\編于六點基因結構圖示mRNA結構IV3’-UTAATAAAExonIGG5’-UTRAAAAAAAAA3’-UTRIIIIIIVIntronI翻譯起始點ExonIICCAATboxTATAboxEnhancer轉錄起始點ExonI5’UT…目前九頁\總數八十七頁\編于六點基因轉錄復合體目前十頁\總數八十七頁\編于六點轉基因載體構建啟動子選取cDNA選取PolyA選用內含子和封閉區載體構建目前十一頁\總數八十七頁\編于六點啟動子的類型和選取特異啟動子：研究基因調節（lacZ），啟動子功能，調節其它基因表達。用于其它基因表達，一定要查詢啟動子在轉基因動物應用文獻，了解啟動子完整性高表達啟動子選用：用于高表達某個基因，高表達蛋白生產廣譜啟動子應用：顯示基因細胞標記（EGFP）可誘導啟動子的應用：用于基因調節，有毒蛋白表達，致命基因的調控復合啟動子：可誘導、高表達、組織專一基因調節系統，用于調節基因或高表達蛋白目前十二頁\總數八十七頁\編于六點表達基因（cDNA）的類別顯示基因(reporters):lacZ,GFP,CAT,AP等調節基因:Cre,ER-Cre,tTA,tTR,PTX等蛋白質功能研究：蛋白突變體的表達基因剪接：研究外顯子、內含子功能商業基因：藥用蛋白，改良基因等生理功能基因:基因治療，干細胞移植等非編碼基因：非編碼RNA功能研究，siRNA基因沉默,CRISPR/Cas9gRNA基因組修飾抗性基因：細胞篩選目前十三頁\總數八十七頁\編于六點其它轉基因載體構件選取polyA

：提供穩定的mRNA常用polyA:SV40polyA,-GlobinpolyA內含子選用：第一個內含子，如-Globin內含子封閉區應用：增加表達幾率，減少對周圍或被周圍基因影響Loxp,FRT,tetO序列目前十四頁\總數八十七頁\編于六點基因A啟動子典型轉基因結構（Heterologous）CCAATboxTATAboxEnhancer轉錄起始點基因BcDNA翻譯起始點基因CpolyA5’-UT3’-UT拼接區域：目前十五頁\總數八十七頁\編于六點轉基因動物（Founders）鑒定檢測轉基因在基因組插入：PCRSouthern拷貝數：Southern,RealtimePCR插入位點：InversePCRmRNA表達：InSituRT-PCRNorthern蛋白表達：顯示基因：酶活性分析lacZ，Luciferase，AP,熒光EGFP,RFP功能分析：結構變化：石蠟切片，H&E染色免疫組織化學、免疫熒光定位：冰凍切片，抗體染色免疫沉淀：Western目前十六頁\總數八十七頁\編于六點小鼠生物學基礎及轉基因優越性小鼠免疫力強，繁殖率高，體型小，為經濟有效動物模型小鼠遺傳表型多樣，全基因組序列解析，經典哺乳類實驗動物模型多種自交系孕期19－21天性成熟時間：母4－5周，雄5-6周母鼠發情周期5天左右成鼠體重：20-50克母鼠平均產子5－6窩，自交系每窩6-8只，遠交系10-14只目前十七頁\總數八十七頁\編于六點產生轉基因鼠標準條件和要求

潔凈動物房，高蛋白，高脂肪飼料（Breederchows)供卵鼠：4-6周雜交子一代母鼠(C57B6xCBAorDBA),每次10-12只，每周兩次種鼠：年齡兩月到一年的雜交子一代雄鼠(C57B6xCBAorDBA)20-24只代孕母鼠：每次見栓2-5只，2-6月高繁殖率母鼠(CD1)50-100只結扎公鼠：(C57B6xCBAorDBA)子一代或(CD1)雄鼠，各需求10-20只，適用年齡2-18月目前十八頁\總數八十七頁\編于六點轉基因小鼠具體操作過程構建載體，純化DNA片段，去除原核載體序列促排卵激素超排卵，合籠，分離E0.5受精卵DNA顯微注射胚胎培養過夜胚胎回移代孕鼠切尾鑒定傳代雜交表達分析目前十九頁\總數八十七頁\編于六點轉基因鼠建立時間表注射出生分窩傳代F1出生分窩分析孕期轉基因鼠鑒定傳代鑒定性成熟孕期時間（月）012345出生率30－50%轉基因比率15－50%傳代效率

~90%性成熟目前二十頁\總數八十七頁\編于六點供體受精卵收集，每次100－200個供體受精卵細胞核DNA顯微注射濃度:2-5ng/ul受精卵回移代孕母鼠:每只移植20-30個左右雙細胞卵

PCR或Southern篩選轉基因鼠(founders),15-50%,隨機插入，拷貝數1-≥100

第一代下傳（F1)0-100%，有卵裂后插入或兩個以上的插入位點

第二帶下傳，蒙德爾遺傳，50％表達功能分析：從E10到5個月轉基因鼠產生相關的數據目前二十一頁\總數八十七頁\編于六點轉基因常見問題啟動子不完整，造成基因不表達或錯誤表達DNA插入隨機性造成不表達、低表達、鼠系間差異封閉區(insulaters)序列基因高表達毒性，得不到轉基因鼠或不表達第一個內含子重要性轉基因片段的大?。?kb到>1000kb大部分2-10kb,容易注射P1質粒(PAC),70kb左右，黏度大細菌人工染色體BAC，120kb左右，黏度更大酵母人工染色體YAC，500kb-1000kb，非常難注射同時注射兩個以上的轉基因：效率高，一般插入同一位點多拷貝插入方式：頭尾相接拷貝數與表達水平：無緊密關聯，多數拷貝被甲基化，轉錄因子濃度限制其它因素：DNA濃度(2-3ng/ul)，酒精、嗅化乙錠和EDTA殘留載體骨架DNA對轉基因表達影響：原核序列不穩定C57/BL6純系轉基因鼠受精卵注射：效率略低目前二十二頁\總數八十七頁\編于六點轉基因動物原理及應用第一部分： 常規動物轉基因技術原理第二部分：

基因定位修飾技術原理第三部分：

CRISPR/Cas9技術原理與應用目前二十三頁\總數八十七頁\編于六點第二部分：基因定位修飾基因定位修飾原理基因定位修飾過程基因定位修飾應用

目前二十四頁\總數八十七頁\編于六點基因定位修飾重要性基因功能研究：隨著基因組解析，基因敲除和基因定位修飾進行基因功能解析基因調節：可以人為控制基因位點準確修飾，基因調節更為精確，研究結果更確定，病理模型更有價值基因修飾穩定性，低拷貝，對基因組影響小，表達特定蛋白，大動物克隆，抗體基因組置換基因治療：準確定位修飾，結合人類干細胞培養和CRISPR/Cas9技術，是將來基因治療(GeneTherapy)、組織再生(RegenerationMedicine)重要途徑目前二十五頁\總數八十七頁\編于六點小鼠早期發育示意圖3.5天目前二十六頁\總數八十七頁\編于六點干細胞特性祖細胞(projenitorcells)的特性可以分化成少數不同種類細胞的原性細胞，可以進行有限次數的不等分裂干細胞(stemcell)的特性可以分化成多種組織器官、不斷增殖的少數細胞胚胎干細胞(ES)具有全能性每個細胞可以發育分化成任何組織器官、個體小鼠胚胎干細胞來源：囊胚內細胞群(ICM)來源種系：多數129SV/jae,少數C57/BL6毛色：棕色(129),黑色(C57/BL6)性別：雄性干細胞更穩定

目前二十七頁\總數八十七頁\編于六點GeneTrap(基因捕獲）源于小鼠干細胞全能性的發現標示基因高通量小鼠基因組隨機插入，基因分析利用無啟動子標示基因表達框，前端有內含子/外顯子剪接信號，后面有PolyA，中間有抗性基因隨機插入內含子后會剪接成融合表達蛋白，標示基因表達原基因位點失活公數據共平臺庫：InternationalGeneTrapConsortiumiscentralizingdataandcelllinescanberequestedfromthem.

目前二十八頁\總數八十七頁\編于六點基因定位修飾載體類型簡單基因敲除載體構建原理條件性敲除載體構建原理點突變顯示基因敲入組織專一基因位點敲入（LacZ,EGFP），研究基因表達廣譜loxp敲入，與調節基因Cre結合，進行組織特異性敲除目前二十九頁\總數八十七頁\編于六點NEO13TKXX1NEO3132野生型載體重組后基因敲除載體設計原理

目前三十頁\總數八十七頁\編于六點NEOTKFRTFRTloxPloxP野生型載體用Flipase去NEOFRTCRE雜交失活基因loxPFRT條件性敲除載體構建原理目前三十一頁\總數八十七頁\編于六點目前三十二頁\總數八十七頁\編于六點Genetargetinginembryonicstemcellshasbecometheprincipaltechnologyformanipulationofthemousegenome,offeringunrivalledaccuracyinalleledesignandaccesstoconditionalmutagenesis.Tobringtheseadvantagestothewiderresearchcommunity,large-scalemouseknockoutprogrammesareproducingapermanentresourceoftargetedmutationsinallprotein-codinggenes.Herewereporttheestablishmentofahigh-throughputgene-targetingpipelineforthegenerationofreporter-tagged,conditionalalleles.Computationalalleledesign,96-wellmodularvectorconstructionandhigh-efficiencygene-targetingstrategieshavebeencombinedtomutategenesonanunprecedentedscale.Sofar,morethan12,000vectorsand9,000conditionaltargetedalleleshavebeenproducedinhighlygermline-competentC57BL/6Nembryonicstemcells.High-throughputgenomeengineeringhighlightedbythisstudyisbroadlyapplicabletoratandhumanstemcellsandprovidesafoundationforfuturegenome-wideeffortsaimedatdecipheringthefunctionofallgenesencodedbythemammaliangenome.目前三十三頁\總數八十七頁\編于六點基因定位修飾過程干細胞分離、培養，多用固定細胞系基因定位修飾載體構建干細胞轉染和重組克隆篩選干細胞囊胚顯微注射嵌合體產生與傳代雜合體產生純合體產生基因功能的分析目前三十四頁\總數八十七頁\編于六點利用小鼠干細胞進行基因打靶過程目前三十五頁\總數八十七頁\編于六點嵌合體的傳代雜交嵌合體（Founders）ES均來源于129鼠系，為棕色(agouti)C57／BL6

囊胚為黑色(black)ES注入后，毛色可以預測干細胞并入比例40-100%雄性嵌合體與C57/BL6母鼠交配6周左右與兩只C57母鼠雜交，每周換一次母鼠棕色為顯性，如果連續六窩全黑，放棄嵌合鼠目前三十六頁\總數八十七頁\編于六點目前三十七頁\總數八十七頁\編于六點目前三十八頁\總數八十七頁\編于六點目前三十九頁\總數八十七頁\編于六點目前四十頁\總數八十七頁\編于六點輸卵管移植子宮移植代孕鼠電擊篩選囊胚注射轉基因和基因定位修飾過程的比較Founder的產生

傳代，分析受精卵細胞顯微核注射目前四十一頁\總數八十七頁\編于六點轉基因與基因打靶比較轉基因基因打靶遺傳特性顯性，穩定或不穩定，多用于基因過表達隱性或顯性，穩定多用于失活基因插入位點隨機，不可控固定位點，可人為控制拷貝數多變,1to>100雜合1,純合2表達取決于插入位點和啟動子完整性模仿原基因表達模式時間五個月以上九個月以上花費3萬元以上8-10萬美元周圍基因相互影響一般有影響無法預測一般沒有影響可以預測目前四十二頁\總數八十七頁\編于六點第三部分基因定位修飾進展CRISPR/Cas9技術原理利用CRISPR/Cas9技術研究生理、病理發育目前四十三頁\總數八十七頁\編于六點DNA隨機突變（化學誘變，放射線誘變）轉基因技術（DNA片段基因組隨機插入）小鼠全能干細胞發現和應用（基因捕獲）基因打靶（DNA重組基因定位修飾）鋅指核酸酶ZNF（基因組定位切割修飾）TALEN（基因組定位切割修飾）CRIPSR-Cas9（基因組定位切割修飾）基因組修飾歷史目前四十四頁\總數八十七頁\編于六點利用ZFN技術進行基因組修飾2000早期，研究者開發了鋅指核酸酶（ZFN）技術,首次利用人工構建DNA序列特異核酸酶，對基因組進行識別、切割和修飾鋅指酶發源于轉錄因子結構，類似于轉錄因子，具有兩個結構域：人工設計DNA-bindingzinc-fingerprotein(ZFP)domainFokIDNAnucleasedomainDNA識別域由3-6個Cys2-His2鋅指蛋白串聯組成，每個鋅指蛋白區結合3’-5’方向DNA鏈上特異三聯體堿基以及5’-3’方向的一個堿基ZFN以二聚體結合到靶位點上，相距5-7個堿基，通過兩個FokI核酸酶切割靶位點由于信息有限，設計復雜，有多達60種的鋅指庫，設計完美的鋅指核酸酶要花費很長時間目前四十五頁\總數八十七頁\編于六點ZFN工作原理目前四十六頁\總數八十七頁\編于六點利用TALEN技術進行基因組修飾Transcriptionactivator-likeeffectornucleases(TALENs)TALENs同樣包括兩個結構域，一個是DNABinding，另一個是FokInucleaseTranscriptionactivator-likeeffectors(TALEs)為33–35aminoacidrepeats,每一個repeat識別一個堿基對，由中間的第12和13氨基酸決定，稱為repeatvariablediresidues(RVDs).最常用的四組為Asn-Asn,Asn-Ile,His-AspandAsn-Gly，分別識別G,A,C和T四個堿基。目前四十七頁\總數八十七頁\編于六點TALEN工作原理目前四十八頁\總數八十七頁\編于六點CRISPR/Cas9發現與應用進展目前四十九頁\總數八十七頁\編于六點目前五十頁\總數八十七頁\編于六點最初發現于bacteriaorarchaea，由protospacers和directrepeat序列順序排列，可以轉錄成crRNA和tracrRNA兩種小RNA。Protospacers，DNAfragments(~20bp)，來源于噬菌體或質粒，相間于directrepeat，統稱為CRISPR。兩個小RNA與CRISPR-associatedprotein9(Cas9)一起，具有DNA特異序列endonuclease活性，識別和切割外源DNA、RNA，行使免疫保護功能。crRNAandtracrRNA可以通過DNA轉錄成single-chainguideRNA(sgRNA)，同樣具有CRISPR功能。Clusteredregularlyinterspacedshortpalindromicrepeat(CRISPR)目前五十一頁\總數八十七頁\編于六點CRISPR－Cas9工作原理目前五十二頁\總數八十七頁\編于六點常用表達系統

AvailableExpressionCassette目前五十三頁\總數八十七頁\編于六點目前五十四頁\總數八十七頁\編于六點常用質粒px330目前五十五頁\總數八十七頁\編于六點目前五十六頁\總數八十七頁\編于六點PAM序列出現頻率目前五十七頁\總數八十七頁\編于六點設計簡單效率高特異性強一次性多位點修飾適用于各種生物用途廣CRISPR－Cas9系統優勢目前五十八頁\總數八十七頁\編于六點CRISPR－Cas9技術應用目前五十九頁\總數八十七頁\編于六點Cas9蛋白和導向RNA共轉染人細胞基因組修飾1）核定位Cas9蛋白2）U6啟動子帶動的一個或多個導向RNA3）導向RNA緊跟著正確的PAM序列4）任何GN20NGG均可為靶點目前六十頁\總數八十七頁\編于六點目前六十一頁\總數八十七頁\編于六點目前六十二頁\總數八十七頁\編于六點3gene,6locustargetingefficiency目前六十三頁\總數八十七頁\編于六點目前六十四頁\總數八十七頁\編于六點目前六十五頁\總數八十七頁\編于六點目前六十六頁\總數八十七頁\編于六點目前六十七頁\總數八十七頁\編于六點目前六十八頁\總數八十七頁\編于六點目前六十九頁\總數八十七頁\編于六點目前七十頁\總數八十七頁\編于六點目前七十一頁\總數八十七頁\編于六點目前七十二頁\總數八十七頁\編于六點Nickase工作原理目前七十三頁\總數八十七頁\編于六點Cas9突變，細菌篩選不同PAM序列增加了特異性發現更多的Cas9變異型具有更好的特異性發現更小的Cas9變異型說明還有挖掘潛力和改進的空間目前七十四頁\總數八十七頁\編于六點Cell.2015Oct22;163(3):759-71.doi:10.1016/j.cell.2015.09.038.Epub2015Sep25.Cpf1IsaSingleRNA-GuidedEndonucleaseofaClass2CRISPR-CasSystem.ZetscheB1,GootenbergJS2,AbudayyehOO3,SlaymakerIM3,MakarovaKS4,EssletzbichlerP3,VolzSE3,JoungJ3,vanderOostJ5,RegevA6,KooninEV4,ZhangF7.AbstractThemicrobialadaptiveimmunesystemCRISPRmediatesdefenseagainstforeigngeneticelementsthroughtwoclassesofRNA-guidednucleaseeffectors.Class1effectorsutilizemulti-proteincomplexes,whereasclass2effectorsrelyonsingle-componenteffectorproteinssuchasthewell-characterizedCas9.Here,wereportcharacterizationofCpf1,aputativeclass2CRISPReffector.WedemonstratethatCpf1mediatesrobustDNAinterferencewithfeaturesdistinctfromCas9.Cpf1isasingleRNA-guidedendonucleaselackingtracrRNA,anditutilizesaT-richprotospacer-adjacentmotif.Moreover,Cpf1cleavesDNAviaastaggeredDNAdouble-strandedbreak.Outof16Cpf1-familyproteins,weidentifiedtwocandidateenzymesfromAcidaminococcusandLachnospiraceae,withefficientgenome-editingactivityinhumancells.IdentifyingthismechanismofinterferencebroadensourunderstandingofCRISPR-Cassystemsandadvancestheirgenomeeditingapplications.目前七十五頁\總數八十七頁\編于六點FengZhanglab'sTargetFinder?IdentifiesgRNAtargetsequencesfromaninputsequenceandchecksforoff-targetbinding.Currentlysupports:Drosophila,Arabidopsis,zebrafish,C.elegans,mouse,human,rat,rabbit,pig,possum,chicken,dog,mosquito,andstickleback.MichaelBoutroslab'sTargetFinder(E-CRISP)?IdentifiesgRNAtargetsequencesfromaninputsequenceandchecksforoff-targetbinding.Currentlysupports:Drosophila,Arabidopsis,zebrafish,C.elegans,mouse,human,rat,yeast,frog,Brachypodiumdistachyon,Oryzasativa,OryziaslatipesRGENTools:Cas-OFFinder?IdentifiesgRNAta