細菌表面展示技術

酵母表面展示技術

第七組定義：細菌表面展示技術是利用基因工程手段將某一蛋白或短肽段（靶蛋白）與微生物外膜蛋白（載體蛋白）以融合蛋白的形式呈現在細胞表面。外源蛋白與載體蛋白結合方式C端融合(N端錨定在外膜)N端融合

(C端錨定在外膜)夾心融合(有些蛋白本身具有信號肽序列及錨定于外膜的序列，內部合適位點插入外源蛋白)早期研究多集中在革蘭氏陰性菌。原因是遺傳背景清楚，便于控制蛋白展示。但是從應用上來看，革蘭氏陽性菌的某些特性更適合于表面展示。如下表：缺點：轉化率低，限制構建較大容量的肽庫；一些革蘭氏陽性菌分泌大量蛋白酶，這會給應用帶來麻煩。細菌表面展示技術，結合熒光激活細胞篩選儀或流式細胞篩選儀，是非常有效的高通量篩選方法。優點：1、能夠決定突變體庫中每個克隆的功能特性。2、目前唯一能夠定量檢驗單細胞水平和大量突變體催化活性的方法。3、定量分析酶活性4、同時檢測多個參數并且對每個觀察到的克隆進行記錄。與噬菌體相比：細菌表面展示技術在疫苗應用上具有獨特優勢；進行更快速更高效篩選與傳統的生物陶選技術相比，熒光激活細胞篩選儀具有以下特色

①高富集比

②高陽性率

③避免“親和效應”綜上所述，細菌表面展示系統靈活多樣，操作簡便，在多個領域顯示出廣泛的應用前景，隨著新的載體系統的發展和其自身的不斷完善，細菌表面展示技術必將在實踐中發揮更大的作用。酵母表面展示技術

簡介：

酵母表面展示系統是繼噬菌體展示技術創立以后發展起來的展示系統。酵母的蛋白質折疊和分泌機制與哺乳動物的細胞非常相似，對人的蛋白質表達和展示具有優越性。酵母細胞顆粒大，可用流式細胞儀進行篩選和分離。目前報道的兩種酵母展示系統分別以α-凝集素作為融合骨架。1.目的蛋白-α-凝集素表面展示系統此系統將目的蛋白作為N端，與α-凝集素C端部分融合，目的蛋白經α-凝集素展示酵母細胞表面。α-凝集素共價連接到細胞壁的葡聚糖上，其錨定部位由蛋白質C端320個氨基酸組成，富含Ser/Thr殘基。Ser/Thr富集區因廣泛存在的O-糖基化而擁有的一個桿狀構象，可作為空間支持無發揮作用。迄今，已有多個應用α-凝集素的C端作為融合蛋白的報道。第一個通過此系統表達的異源蛋白是α-半乳糖苷酶。Schreuder等將來自瓜兒豆膠的α-半乳糖苷酶的基因插入到釀酒酵母轉化酶分泌信號和α-凝集素C端部分編碼序列之間。α-半乳糖苷酶和α-半乳糖苷酶-α-凝集素（α-Gal-ACI）融合蛋白，均由固有的磷酸果糖激酶(PGK)啟動子控制，并且是多拷貝的。批量培養過程中檢測了細胞和生長介質中的酶活性，α-半乳糖苷酶被高效分泌入培養介質，而αGal-ACI融合蛋白主要與細胞有關。天然α-凝集素結合活性部位在Aga2p的C端，因此，此處代表了一個細胞外大分子的可及性區域和展示固定蛋白質的有用位點。

酵母有兩種交配類型MATa和MATa的單倍體細胞，這兩種細胞之間的相互交配融合是通過細胞表達α-凝集素和α-凝集素的相互作用介導的。目前，酵母表面展示技術被廣泛應用于蛋白質分子的相互識別、定向進化以及新型疫苗的研制等發面。①蛋白質的定向進化：酵母表面展示系統用于蛋白質親和力和穩定性的定型進化已有成功報道，最先被用于抗體的親和力成熟;②活的口服疫苗：在細胞表面表達的蛋白質易于接近抗體，因此，可被免疫系統識別，即使很小的肽，當展示在細胞表面時，也具有免疫原型。因而可通過在酵母表面表達異質性的抗原蛋白來發展疫苗。酵母是個足夠大的顆粒，可用流式細胞儀進行篩選和分離，這就使得基于特異定量親和力改變的的突變體分離成為可能。由于酵母展示的蛋白質是緊密錨定在細胞壁上，可以耐受SDS等的抽取，同時酵母有發酵特性且生長快，因此在工業上具有很好的應用前景。

前景：

表面展示技術日新月異，酵母展示系統在不斷的完善和改進