微生物的菌種選育第1頁，共101頁，2023年，2月20日，星期四5.2.2基因突變和誘變育種第2頁，共101頁，2023年，2月20日，星期四基因突變誘變育種第3頁，共101頁，2023年，2月20日，星期四一、基因突變（genemutation）一個基因內部遺傳結構或DNA序列的任何改變簡稱突變，是變異的一種，泛指細胞內（或病毒粒內）遺傳物質的分子結構或數量突然發生的可遺傳的變化，可自發或誘導產生。突變幾率一般很低（10-6～10-9）第4頁，共101頁，2023年，2月20日，星期四從自然界分離到的菌株，簡稱野生型。

野生型經突變后形成的帶有新性狀的菌株，又稱突變體或突變型。突變株（mutant）野生型菌株（wildtypestrain）第5頁，共101頁，2023年，2月20日，星期四（一）突變類型凡能用選擇性培養基（或其他選擇性培養條件）快速選擇出來的突變株。選擇性突變株（selectivemutant）非選擇性突變株（non-selectivemutant）反之。第6頁，共101頁，2023年，2月20日，星期四表型基因型這里主要介紹幾種常用的由于基因突變而造成微生物表型變化的突變型及其分離第7頁，共101頁，2023年，2月20日，星期四link1突變株的表型非選擇性突變株選擇性突變株抗性突變型（株）營養缺陷型（株）條件致死突變型（株）形態突變型（株）抗原突變型（株）產量突變型（株）第8頁，共101頁，2023年，2月20日，星期四突變率每一細胞在每一世代中發生某一性狀突變的幾率例如，突變率為10-8的，指該細胞在1億次細胞分裂中，會發生1次突變。某一單位群體在每一世代（即分裂1次）中產生突變株（mutant，即突變型）的數目來表示例如，一個含108個細胞的群體，當其分裂為2×108個細胞時，即可平均發生一次突變的突變率也是10-8。（二）突變率（mutationrate）第9頁，共101頁，2023年，2月20日，星期四第10頁，共101頁，2023年，2月20日，星期四突變一般是獨立發生的。某一基因發生突變不會影響其他基因的突變率。同一細胞中同時發生兩個基因突變的幾率是極低的。第11頁，共101頁，2023年，2月20日，星期四（三）基因突變的特點基因突變的7個共同點（1）自發性各種性狀的突變，可在無人為的誘變因素處理下自發地產生。第12頁，共101頁，2023年，2月20日，星期四（2）非對應性突變的性狀與引起突變的原因間無直接的對應關系。這是突變的一個重要特點，也是容易引起爭論的問題（3）稀有性自發突變雖可隨時發生，但其突變率卻是極低和穩定的，一般在10-6～10-9間。第13頁，共101頁，2023年，2月20日，星期四某基因的突變率不受它種基因突變率的影響。（5）可誘變性自發突變的頻率可因誘變劑（mutagen）的影響而大為提高（10～105倍）。（4）獨立性第14頁，共101頁，2023年，2月20日，星期四基因突變后的新遺傳性狀是穩定的、可遺傳的。野生型菌株某一性狀可發生正向突變（forwardmutation），也可發生相反的回復突變（reversemutation或backmutation

，也稱回變）。（7）可逆性（6）穩定性第15頁，共101頁，2023年，2月20日，星期四（四）基因突變自發性和不對應性

的實驗證明如何證明基因突變的非對應性？第16頁，共101頁，2023年，2月20日，星期四證明突變的性狀與引起突變的原因間無直接對應關系！三個經典實驗變量實驗、涂布實驗、影印實驗第17頁，共101頁，2023年，2月20日，星期四1.變量試驗（fluctuationtest）又稱波動試驗或彷徨試驗。1943年，S.E.Luria和M.Delbrück根據統計學的原理，設計實驗。SalvadorLuriaMaxDelbruckTheNobelPrizeinPhysiologyorMedicine1969甲管乙管第18頁，共101頁，2023年，2月20日，星期四2.涂布試驗（Newcombeexperiment）1949年，H.B.Newcombe在《NATURE》上發表了一篇與變量試驗屬同一觀點的但實驗方法更為簡單的涂布試驗結果。第19頁，共101頁，2023年，2月20日，星期四3.平板影印培養試驗（replicaplating）1952年，J.Lederberg夫婦發表了一篇著名的《平板影印培養法和細菌突變株的間接選擇》論文，它更好地證明了微生物的抗藥性是在未接觸藥物前自發地產生的，這一突變與相應的藥物環境毫不相干。第20頁，共101頁，2023年，2月20日，星期四影印的作用是保證這3個平板上所長出的菌落的親緣和相對位置保持嚴格的對應性。第21頁，共101頁，2023年，2月20日，星期四JoshuaLederbergJ.LederbergisawardedtheNoblePrizeinMedicineandPhysiologyin1958第22頁，共101頁，2023年，2月20日，星期四（五）基因突變及其機制僅影響一對堿基影響一段染色體第23頁，共101頁，2023年，2月20日，星期四

誘發突變簡稱誘變，是指通過人為的方法，利用物理、化學或生物因素顯著提高基因自發突變頻率的手段。1.誘發突變（inducedmutation）凡具有誘變效應的任何因素，都稱誘變劑（mutagen）。第24頁，共101頁，2023年，2月20日，星期四(1)堿基的置換（substitution）堿基的置換只涉及一對堿基被另一對堿基所置換，屬于典型的點突變（pointmutation）。染色體的微小損傷（microlesion）第25頁，共101頁，2023年，2月20日，星期四堿基的置換轉換（transition）顛換（transversion）一個嘌呤另一個嘌呤一個嘧啶另一個嘧啶一個嘌呤另一個嘌呤一個嘧啶另一個嘧啶第26頁，共101頁，2023年，2月20日，星期四第27頁，共101頁，2023年，2月20日，星期四(2)移碼突變（frame-shiftmutation，phase-shiftmutation）指誘變劑使DNA序列中的一個或少數幾個核苷酸發生增添（插入）或缺失，從而使其后面的全部遺傳密碼發生閱讀框發生改變，并進一步引起轉錄和轉譯錯誤的一類突變。第28頁，共101頁，2023年，2月20日，星期四由吖啶類化合物誘發的移碼突變及其回復突變圖示：（雙線部分代表正常密碼子，單線部分表示不正常）①正常DNA鏈上的三聯密碼子：②第三個密碼子中增添一個堿基后的三聯密碼子：第29頁，共101頁，2023年，2月20日，星期四③在第二個密碼子上缺失一個堿基A后引起的變化：④增添一個堿基和缺失一個堿基后，其后的密碼子又恢復正常：第30頁，共101頁，2023年，2月20日，星期四⑥如缺失三個堿基，也只引起一段密碼子不正常：⑤增添三個堿基后，只引起一段密碼子不正常：第31頁，共101頁，2023年，2月20日，星期四(3)染色體畸變（chromosomalaberration）電離輻射（X射線等）烷化劑亞硝酸等某些強烈理化因子引起點突變DNA的大損傷（macrolesion）第32頁，共101頁，2023年，2月20日，星期四DNA的大損傷（macrolesion）染色體畸變缺失（deletion）重復（duplication）插入（insertion）易位（translocation）倒位（inversion）染色體結構上染色體數目的變化第33頁，共101頁，2023年，2月20日，星期四2.自發突變（spontaneousmutation）

自發突變（spontaneousmutation）是指生物體在無人工干預下自然發生的低頻率突變。第34頁，共101頁，2023年，2月20日，星期四自發突變的原因（1）背景輻射和環境因素（3）DNA復制過程中堿基配對錯誤（2）微生物自身有害代謝產物一個1000bp的基因自發突變頻率約為10-6例如，過氧化氫等例如，天然的宇宙射線等第35頁，共101頁，2023年，2月20日，星期四（六）紫外線對DNA的損傷及其修復嘧啶（敏感性）＞嘌呤紫外線（ultravioletray，U.V.）嘧啶二聚體（TT，TC，CC）和水合物第36頁，共101頁，2023年，2月20日，星期四第37頁，共101頁，2023年，2月20日，星期四把經UV照射后的微生物立即暴露于可見光下時，可明顯降低其死亡率的現象，稱為光復活作用。1.光復活作用（photoreactivation，photorestoration）最早是A.Kelner（1949）在Streptomycesgriseus（灰色鏈霉菌）中發現的。后來，在許多微生物中都得到了證實。第38頁，共101頁，2023年，2月20日，星期四最明顯的是在E.coli的實驗①對照：8×106個／mLE.coli→100個／mLE.coli②試驗：8×106個／mLE.coli→－－－－→2×106個／mLE.coliUVUV360～490nm可見光，30min第39頁，共101頁，2023年，2月20日，星期四使二聚體（dimer）重新分解成單體（monomer）帶有嘧啶二聚體的DNA分子DNA分子UV照射黑暗下結合光激活酶——光解酶（光裂合酶，photolyase）復合物300～500nm可見光獲得光能而激活釋放光解酶第40頁，共101頁，2023年，2月20日，星期四在一般的微生物中都存在光復活作用，在利用UV進行誘變育種等工作時，應在紅光下進行照射和后續操作，并放置在黑暗條件下培養。注意第41頁，共101頁，2023年，2月20日，星期四2.切除作用（excisionrepair）是活細胞內一種用于修復被UV等誘變劑（包括烷化劑、X射線和γ射線等）損傷后DNA的修復方式之一，又稱暗修復（darkrepair），通過酶切作用去除嘧啶二聚體，隨后重新合成一段正常DNA鏈的核酸修復方式。第42頁，共101頁，2023年，2月20日，星期四酶切合成切開切除聚合連接第43頁，共101頁，2023年，2月20日，星期四二、突變與育種

（一）自發突變與育種

（breedingbyspontaneousmutation）

1.從生產中育種在生產第一線易獲得較優良的生產菌株。第44頁，共101頁，2023年，2月20日，星期四2.定向培育優良菌株定向培育是一種利用微生物自發突變，并采用特定的選擇條件，通過對微生物群體不斷移植以選育出較優良菌株的古老方法。第45頁，共101頁，2023年，2月20日，星期四（二）誘變育種（breedingbyinducedmutation）

誘變育種是指利用物理、化學等誘變劑處理均勻而分散的微生物細胞群，在促進其突變率顯著提高的基礎上，采用簡便、快速和高效的篩選方法，從中挑選出少數符合育種目的的突變株，以供科學實驗或生產實踐使用。第46頁，共101頁，2023年，2月20日，星期四篩選誘變誘變育種定向的——更重要隨機的第47頁，共101頁，2023年，2月20日，星期四可獲得供工業和實驗室應用的各種菌株；提高有用代謝產物的產量；減少雜質、提高產品質量、擴大品種和簡化工藝等。誘變育種具有重大的實踐意義第48頁，共101頁，2023年，2月20日，星期四誘變育種的特點（1）提高突變率，擴大突變譜（2）有效地改良個別、單一性狀（3）縮短育種年限（4）定向變異和有益突變的頻率低第49頁，共101頁，2023年，2月20日，星期四出發菌株純化、同步培養培養液離心收集細胞，洗滌，制菌懸液玻璃珠打散，過濾細胞或孢子懸液誘變處理平板分離初篩復篩保藏及擴大試驗活菌計數，誘變預備試驗存活細胞計數，致死率計算變異率計算1.誘變育種的基本過程第50頁，共101頁，2023年，2月20日，星期四2.誘變育種中的原則

（1）選擇簡便有效的誘變劑誘變劑（mutagen）物理因素化學誘變劑非電離輻射類的紫外線、激光和離子束（ionbeam，有小型加速器提供）等引起電離輻射的X射線、γ射線和快中子等主要有烷化劑、堿基類似物和吖啶類化合物第51頁，共101頁，2023年，2月20日，星期四

烷化劑可與巰基、氨基和羧基等直接發生反應，更易引起基因突變。最常用的烷化劑N-甲基-N′-硝基-N-亞硝基胍（NTG）、甲基磺酸乙酯（EMS）、甲基亞硝基脲（NMU）、硫酸二乙酯（DES）、氮芥、乙烯亞胺和環氧乙烷等。第52頁，共101頁，2023年，2月20日，星期四擬輻射物質氮芥、硫芥和環氧乙烷等各種點突變一般只有輻射才能誘發的染色體畸變誘發第53頁，共101頁，2023年，2月20日，星期四

出發菌株（originalstrain）是指用于育種的原始菌株，選用合適的出發菌株有利于提高育種的效率。（2）挑選優良的出發菌株第54頁，共101頁，2023年，2月20日，星期四合適的出發菌株來源：①由自然界直接分離獲得的野生型菌株；②在生產中經歷生產條件考驗的菌株；③已經過誘變甚至多次改造的菌株；④選用對誘變劑敏感性較高增變變異株；等等。第55頁，共101頁，2023年，2月20日，星期四在誘變育種中，所處理的細胞必須是單細胞、均勻的懸液狀態。（3）處理單細胞或單孢子懸液菌懸液制備目的在于提高誘變處理的效果因為:一方面，分散狀態的細胞可以均勻地接觸誘變劑，另一方面，又可避免長出不純菌落。第56頁，共101頁，2023年，2月20日，星期四誘變劑的作用有三條：一是提高誘變的頻率二是擴大變異的幅度三是使變異向正變的方向移動（產量提高）（4）選用最適的誘變劑量第57頁，共101頁，2023年，2月20日，星期四誘變劑的復合處理常常表現出明顯的協同效應，這對育種工作是有利的。（5）充分利用復合處理的協同效應（synergism）第58頁，共101頁，2023年，2月20日，星期四第59頁，共101頁，2023年，2月20日，星期四復合處理有幾類：①兩種或多種誘變劑的先后使用；②同一種誘變劑的重復使用；③兩種或多種誘變劑的同時使用。第60頁，共101頁，2023年，2月20日，星期四為了大大提高育種時初篩的效率，必須進行大量的分析測定和統計工作，并找到形態變異與產量變異兩者間的相關性。（6）利用和創造形態、生理與產量間的相關指標第61頁，共101頁，2023年，2月20日，星期四利用鑒別性培養基的原理或其他途徑，就可有效地把原先肉眼無法觀察的生理性狀或產量性狀轉化為可見的“形態”性狀?？焖倨桨鍣z出法第62頁，共101頁，2023年，2月20日，星期四在瓊脂平板上，通過觀察測定某突變菌落周圍蛋白酶水解圈的大小、淀粉酶變色圈（用碘液使淀粉顯色）的大小，氨基酸顯色圈（將菌落用打孔機取下，轉移到濾紙上，再用茚三酮試劑顯色）的大小，檸檬酸變色圈（可在厚濾紙上培養，用溴甲酚綠作指示劑）的大小，抗生素抑制圈的大小，指示菌生長圈的大小（測定生長因子產生），纖維素酶對纖維素水解圈（用剛果紅染色）的大小，外毒素的沉淀反應圈的大小等，均可為初篩工作中估計某突變株代謝產物量的“形態”指標。第63頁，共101頁，2023年，2月20日，星期四（7）設計高效篩選方案設計簡便、高效的科學篩選方案。初篩篩選工作復篩以量為主（選留較多有生產潛力的菌株）以質為主（對少量潛力大的菌株的代謝產物量作精確測定）第64頁，共101頁，2023年，2月20日，星期四常用的篩選方案第一輪：第二輪：第三輪： 同第二輪第四輪： 同上

... 直至獲得較滿意的結果為止第65頁，共101頁，2023年，2月20日，星期四初篩復篩對產量突變株生產性能的測定方法粗測為主在培養皿平板上在搖瓶中（8）創造新型篩選方法較精確的測定搖瓶培養or臺式自控發酵罐培養第66頁，共101頁，2023年，2月20日，星期四3.3類突變株的篩選方法

（1）產量突變株的篩選1971年，國外有人報道了篩選春日霉素（kasugamycin，即“春雷霉素”）生產菌時所采用的一種瓊脂塊培養法，一年內曾使該抗生素產量提高10倍。第67頁，共101頁，2023年，2月20日，星期四此法的關鍵是用打孔器取出含有一個小菌落的瓊脂塊作分別培養。這樣，各瓊脂塊所含養料和接觸空氣面積基本相同，且產生的抗生素等代謝產物不致擴散出瓊脂塊外。數據精確，效率高第68頁，共101頁，2023年，2月20日，星期四（2）抗藥性突變株的篩選基因突變使菌株對某種或某幾種藥物，特別是抗生素，產生抗性。特點：正選擇標記（突變株可直接從抗性平板上獲得-----在加有相應抗生素的平板上，只有抗性突變能生長。所以很容易分離得到。）第69頁，共101頁，2023年，2月20日，星期四梯度平板法（gradientplate）是定向篩選抗藥性突變株的一種有效方法，通過制備瓊脂表面存在藥物濃度梯度的平板、在其上涂布誘變處理后的細胞懸液、經培養后再從其上選取抗藥性菌落等步驟，就可定向篩選到相應抗藥性突變株。第70頁，共101頁，2023年，2月20日，星期四梯度平板法（gradientplate）是定向篩選抗藥性突變株的一種有效方法。第71頁，共101頁，2023年，2月20日，星期四表示方法：所抗藥物的前三個小寫斜體英文字母加上“r”。strrstrs對鏈霉素的抗性敏感性第72頁，共101頁，2023年，2月20日，星期四（3）營養缺陷型突變株的篩選營養缺陷型突變株（auxotrophicmutant）在生物學基礎理論和應用研究以及生產實踐上都有極其重要的意義。第73頁，共101頁，2023年，2月20日，星期四a.基本培養基（MM，符號為［－］）①

與篩選營養缺陷型突變株有關的3類培養基僅能滿足某微生物的野生型菌株生長所需的最低成分的組合培養基，稱MM。第74頁，共101頁，2023年，2月20日，星期四b.完全培養基（completemedium，CM，符號為［＋］）凡可滿足一切營養缺陷型菌株營養需要的天然或半組合培養基，稱為CM。一般可在基本培養基中加入一些富含氨基酸、維生素、核苷酸和堿基之類的天然物質，如蛋白胨或酵母膏等配制而成。第75頁，共101頁，2023年，2月20日，星期四c.補充培養基（supplementalmedium，SM，符號為［A］或［B］等）凡只能滿足相應的營養缺陷型突變株生長需要的組合或半組合培養基，稱為SM。在基本培養基上再添加對某一營養缺陷型突變株所不能合成的某相應代謝產物所組成，可專門選擇相應的突變株。第76頁，共101頁，2023年，2月20日，星期四原養型（prototroph）②

與營養缺陷型突變有關的3類遺傳型個體野生型（wildtype，wildstrain）營養缺陷型（auxotroph）從自然界分離到的原始菌株（A＋B＋）經誘變劑處理后的突變株（A—B—）經回復突變或重組后產生的菌株（A＋B＋）第77頁，共101頁，2023年，2月20日，星期四③

營養缺陷型的篩選方法第一步，誘變劑處理第二步，淘汰野生型第三步，檢出缺陷型第四步，鑒定缺陷型第78頁，共101頁，2023年，2月20日，星期四淘汰野生型的方法（1）抗菌素法青霉素制霉菌素（2）菌絲過濾法第79頁，共101頁，2023年，2月20日，星期四第三步，檢出缺陷型對照培養法夾層培養法（layerplatingmethod）限量補充培養法逐個檢出法影印平板法第80頁，共101頁，2023年，2月20日，星期四①對照培養法CMMMSM②夾層培養法MMCMMM＋菌液第81頁，共101頁，2023年，2月20日，星期四③影印法CMMM④限量補充培養法⑤逐個檢出法第82頁，共101頁，2023年，2月20日，星期四第四步，鑒定缺陷型借助生長譜法（auxanography）進行。第83頁，共101頁，2023年，2月20日，星期四營養缺陷型的鑒定－生長譜法營養組合編號組合營養因子A1,2,3,4,5B2,6,7,8,9C3,7,10,11,12D4,8,11,13,14E5,9,12,14,15第84頁，共101頁，2023年，2月20日，星期四ABECD缺13ECDBA缺2ABECD單獨A或B均不能滿足BECDA缺1濃度太大第85頁，共101頁，2023年，2月20日，星期四第86頁，共101頁，2023年，2月20日，星期四1.營養缺陷型（auxotroph）

某一野生型菌株因發生基因突變而喪失合成一種或幾種生長因子、堿基或氨基酸的能力，只有從周圍環境或培養基中獲得這些營養或其前體物（precursor）才能正常生長繁殖的變異類型，稱為營養缺陷型。第87頁，共101頁，2023年，2月20日，星期四營養缺陷型突變株在遺傳學、分子生物學、遺傳育種和遺傳工程等研究中——十分重要表型判斷的標準：在基本培養基上能否生長第88頁，共101頁，2023年，2月20日，星期四營養缺陷型的表示方法：基因型：所需營養物的前三個英文小寫斜體字母表示：hisC（組氨酸缺陷型，其中的大寫字母C同一表型中不同基因的突變）表型：同上，但第一個字母大寫，且不用斜體：HisC第89頁，共101頁，2023年，2月20日，星期四hisC－缺陷型hisC＋野生型第90頁，共101頁，2023年，2月20日，星期四2.抗性突變型（resistantmutant）指野生型菌株因發生基因突變，使菌株對對某化學藥物或致死物理因子，特別是抗生素，產生抗性的抗性變異類型