第六章沉淀反應第六章沉淀反應第一節沉淀反應的特點第二節液體內沉淀試驗一、絮狀沉淀試驗二、免疫濁度測定第三節凝膠內沉淀試驗一、單向擴散試驗二、雙向擴散試驗第四節免疫電泳技術一、對流免疫電泳二、火箭免疫電泳三、免疫電泳四、免疫固定電泳思考題小結形成肉眼可見的大的免疫復合物。沉淀線或沉淀環的觀察以及免疫比濁法中的終點法就是測定此階段形成的復合物

第一階段第二階段沉淀反應分兩個階段抗原抗體特異性結合，快速但不可見。免疫比濁法中的速率法就是利用此階段測定免疫復合物形成的速率。免疫濁度測定絮狀沉淀試驗單向擴散試驗雙向擴散試驗對流免疫電泳火箭免疫電泳免疫電泳免疫固定電泳液體內沉淀試驗凝膠內沉淀試驗凝膠免疫電泳技術沉淀反應可分三類第二節液體內沉淀試驗抗原稀釋法：抗原最適比例抗體稀釋法：抗體最適比例方陣滴定法：抗原抗體最適比例絮狀沉淀試驗表6-1最適比方陣測定法抗體稀釋度抗原稀釋度1/101/201/401/801/1601/3201/640對照1/5++++++++++++±—1/10+++++++++++++—1/20+++++++++++++—1/40—±+++++++++—1/80————+++—當可溶性抗原與相應抗體特異結合，二者比例合適時，在特殊的緩沖液中它們快速形成一定大小的抗原抗體復合物，使反應液體出現濁度。利用現代光學測量儀器對濁度進行測定從而檢測抗原含量。

原理二、免疫濁度測定1.透射免疫比濁法2.散射免疫比濁法3.免疫膠乳比濁法分類免疫濁度測定第三節凝膠內沉淀試驗可溶性抗原和相應抗體在凝膠中擴散，形成濃度梯度，在抗原抗體相遇并且濃度比例適當的位置形成肉眼可見的沉淀線或沉淀環。常用的凝膠有瓊脂、瓊脂糖、葡聚糖或聚丙烯酰胺凝膠。原理抗體+瓊脂沉淀環抗原傾注平板打孔加樣放置37℃24～48h觀察沉淀環

單向擴散試驗（平板法）沉淀環的直徑與待測標本含量兩種計算方法Mancini曲線：大分子抗原（IgM）時間擴散＞48h，常數K＝C∕d2普通坐標紙曲線Fahey曲線：小分子抗原（IgG,IgA）擴散時間24h常數K＝logC∕d半對數坐標紙曲線C為抗原濃度，d為沉淀環直徑單向擴散試驗（平板法）

T1為16～24h；T2為24～48h；T3為48h以上,可見T3為直線，T1為反拋物線

t1為16～24h；t2為24～48h；t3為48h以上,可見t1為直線，t3為反拋物線Mancini曲線Fahey曲線原理：將抗原抗體分別加在瓊脂糖不同的對應孔中，兩者在凝膠中自由擴散，在比例合適處形成白色沉淀線。技術要點：平板玻璃上傾注一層均勻的瓊脂糖薄層，凝固后打孔，孔徑為3mm，孔間距在3～5mm之間，在相對的孔中加入抗原或抗體，放置濕盒37℃18～24h后，觀察孔周圍是否出現沉淀環。鑒定抗原抗體的最基本、最常見的方法之一二、雙向擴散試驗（平板法）應用1.抗原或抗體的存在與否以及相對含量的估計

2.抗原或抗體相對分子量的估計

雙向擴散試驗（平板法）應用3.抗原性質的分析

雙向擴散試驗（平板法）第四節免疫電泳技術優點：1.加快反應的速度。2.提高了靈敏度。3.增加了分辨率。

電泳分析＋沉淀反應抗原抗體反應的高度特異性電泳技術的高分辨率、快速、微量免疫電泳技術結果分析：無沉淀線出現則表明無相應的抗原。沉淀線位于抗原抗體孔中間，說明兩者比例較適合。沉淀線偏向抗原孔一方，表示抗體濃度＞抗原，反之，則是抗體濃度＜抗原濃度。對流免疫電泳電泳時凝膠中抗體不移動，樣品孔中的抗原向正極泳動，隨著抗原量的逐漸減少，抗原泳動的基底區越來越窄，抗原抗體分子復合物形成的沉淀線逐漸變窄，形成一個形狀如火箭的不溶性復合物沉淀峰，抗體濃度固定時，峰的高度與抗原量呈正相關。

原理單向免疫擴散＋電泳,定量檢測技術二、火箭免疫電泳1.2%巴比妥瓊脂糖約55℃，加入適量抗血清，混勻后制板，打孔，孔內加待測樣品，樣品孔放負極側，6h后觀察瓊脂板上沉淀峰，繪制標準曲線，求出待測樣品濃度。技術要點火箭免疫電泳1.瓊脂（無電滲或電滲很小的）影響火箭形狀不規則。2.電泳終點時間的確定。

3.標本數量多時應先通電后加樣,防止寬底峰形.4.IgG定量時，可用甲醛與IgG上的氨基結合（甲酰化），抵消了電滲作用。影響因素火箭免疫電泳火箭免疫電泳圖①②③④為標準抗原；⑤⑥為標本-+火箭免疫電泳示意圖原理：區帶電泳＋雙向擴散1、將蛋白質抗原在凝膠中電泳分成肉眼不可見的若干區帶2、沿電泳方向挖一與之平行的抗體槽，加入相應抗血清進行雙向擴散。技術要點：制備瓊脂板打孔，加樣于孔內，電泳2～3mA/cm，0.5～1h后，槽內加入相應抗血清作雙向擴散。三、免疫電泳純化抗原和抗體成分的分析及正常和異常免疫球蛋白的識別與鑒定影響因素抗原抗體比例不當,需測抗原抗體最適比

抗血清的的抗體譜，混合抗血清的使用電泳條件直接影響分辨率應用免疫電泳-+免疫電泳示意圖免疫電泳原理，不同之處是將抗血清直接加于電泳后的蛋白質區帶表面，抗原抗體在凝膠中直接發生沉淀反應，在適當位置形成抗原抗體復合物，經染色后，可對各類免疫球蛋白及其輕鏈進行分型原理區帶電泳＋沉淀反應四、免疫固定電泳先將患者血清或血漿在醋纖膜或瓊脂上作區帶電泳，根據血清蛋白質的電荷不同將其分開，然后將IgG、IgA、IgM、κ輕鏈和λ輕鏈的抗血清加于分離的蛋白質泳道，參考泳道則加蛋白質固定劑，用于區帶對照，作用一定時間后洗去游離蛋白質，染色后則可見被固定的相應M蛋白成分。技術要點免疫固定電泳

左圖為IgGκ型,

中圖為IgGλ型，右為正常

SPGAMκλSPGAMκλSPGAMκλ免疫固定電泳示意圖分辨率強，敏感度高，操作周期短，僅需數小時，結果易于分析。應用最常用于M蛋白的鑒定與分型，也用于尿中本周氏蛋白質的檢測與κ、λ分型，腦脊液中寡克隆蛋白的檢測與分型。優點免疫固定電泳1.主要用于血液、體液中蛋白質的測定。2.優點：穩定性好，敏感度高，精確度高，簡便快速，易于自動化，無放射性核素污染，適合大批量標本檢測。

3.對流免疫電泳與火箭免疫電泳技術由于電滲的緣故已不推薦使用。4.免疫電泳擴散時間長，影響因素多，結果不易分析。5.免疫固定電泳分辨力強，敏感度高，結果易于分析，常用于M蛋白的鑒定與分型。沉淀反應在醫學檢驗中的應用1.什么是沉淀反應？2.沉淀反應的特點？3.免疫濁度法的原理、方法與分類？4.單向擴散試驗的原理和應用？5.免疫固定電泳的原理及臨床應用價值？6.何謂Mancini曲線？7.何謂Fahey曲線？8.影響免疫比濁測定的因素有哪些？9.抗原性質分析出現哪三種結果現象？結果解釋？10.自動化免疫比濁法發展趨勢和應用前景？思考題沉淀反應是指可溶性抗原與相應抗體在