免疫檢測常用方法及運用秦偉第1頁/共61頁這些方法所具有的特異性好、敏感性高、簡單、快速和穩定的特點為臨床上確定診斷、分析病情、調整治療方案和判斷預后等提供有效的實驗依據，使它們在臨床的應用進一步普及和推廣。第2頁/共61頁凝集反應(agglutination)顆粒性抗原(細菌、細胞等)與相應的抗體，或可溶性抗原(亦可用抗體)吸附于與免疫無關的載體形成致敏顆粒與相應的抗體(或抗原)，在有適量電解質存在下，形成肉眼可見的凝集小塊。第3頁/共61頁

凝集反應的分類

直接凝集反應間接凝集反應抗人球蛋白試驗（Coombs試驗）第4頁/共61頁直接凝集反應

顆粒性抗原(細菌、細胞等)與相應的抗體在有適量電解質存在下，形成肉眼可見的凝集小塊。常見的應用是血型的鑒定第5頁/共61頁血型鑒定示意圖第6頁/共61頁

間接凝集反應

將可溶性抗原（或抗體）先吸附于適當大小顆粒性載體的表面，然后與相應抗體（或抗原）作用，在適宜的電解質存在的條件下，出現特異性凝集的現象稱間接凝集反應（indirectagglutination）或被動凝集反應（assiveagglutination）。第7頁/共61頁間接凝集反應常用的載體微球有人O型血紅細胞、綿羊或家兔紅細胞、聚苯乙烯乳膠、活性炭/甲苯胺紅、明膠顆粒等第8頁/共61頁間接凝集反應正向間接凝集反應反向間接凝集反應第9頁/共61頁正向間接凝集反應用抗原致敏載體以檢測標本中的相應抗體第10頁/共61頁正向間接凝集反應

—膠乳凝集試驗所用載體顆粒為羧化的聚苯乙烯膠乳，是一種直徑約為0.8μm大小的圓形顆粒，帶有負電荷，可物理性吸附蛋白分子。將溶血素O吸附在羧化的聚苯乙烯膠乳顆粒上檢測抗”O”。將變性IgG包被于羧化的聚苯乙烯膠乳顆粒上檢測RF。第11頁/共61頁正向間接凝集反應

—RPR/TRUST試驗血漿反應素試驗(RPR)

所用載體顆粒為活性炭顆粒甲苯胺紅不加熱血清反應素試驗

（TRUST）所用載體顆粒為甲苯胺紅顆粒第12頁/共61頁正向間接凝集反應

—RPR試驗第13頁/共61頁正向間接凝集反應

—TRUST試驗第14頁/共61頁正向間接凝集反應

—明膠顆粒凝集試驗所用載體為人工合成的惰性明膠顆粒梅毒螺旋體明膠凝集試驗（TPPA）肺炎支原體抗體檢測（MP-Ab）第15頁/共61頁正向間接凝集反應

—TPPA試驗第16頁/共61頁正向間接凝集反應

—TPPA試驗第17頁/共61頁正向間接凝集反應

—MP-Ab試驗第18頁/共61頁正向間接凝集反應

—MP-Ab試驗第19頁/共61頁正向間接凝集反應

—MP-Ab試驗第20頁/共61頁正向間接凝集反應

—MP-Ab試驗檢測肺炎支原體的總抗體（IgM,IgAIgG)以滴度的方式報告檢測結果（<1:801:80、1：160、1:320……)第21頁/共61頁

反向間接凝集反應

用已知特異性抗體致敏載體以檢測標本中的相應抗原。第22頁/共61頁抗人球蛋白試驗

（Coombs試驗）抗人球蛋白抗體參與的間接血凝試驗，用于檢測抗紅細胞不完全抗體分類：

直接Coombs試驗

間接Coombs試驗

第23頁/共61頁

直接Coombs試驗

第24頁/共61頁

間接Coombs試驗

第25頁/共61頁凝集反應總結一、直接凝集反應

血型鑒定二、間接凝集反應

膠乳凝集試驗ASO/RF1正向間接凝集反應RPP/TRUST

明膠顆粒凝集TPPA/MP2反向間接凝集反應三、抗人球蛋白試驗

直接/間接Coombs試驗

第26頁/共61頁酶聯免疫吸附試驗

（ELISA）①

使抗原或抗體結合到某種固相載體表面，并保持其免疫活性。②使抗原或抗體與酶連接成酶標抗原或抗體，且既保留其免疫活性又保留酶的活性。③標本中的抗原或抗體、酶標抗原或抗體按一定的次序與固相載體表面的抗體或抗原反應，并通過底物與酶的反應來反映標本中的抗原或抗體的量。第27頁/共61頁

酶聯免疫吸附劑試驗

第28頁/共61頁酶聯免疫吸附試驗雙抗體夾心法雙抗原夾心法間接法競爭法捕獲法測

IgM抗體第29頁/共61頁

ELISA—雙抗體夾心法

用特異性抗體進行包被和制備酶標抗體，以檢測相應的抗原。乙肝標志物中HBsAg、HBeAg的檢測常采用本法第30頁/共61頁

ELISA—雙抗體夾心法

第31頁/共61頁ELISA—雙抗體夾心法第32頁/共61頁

ELISA—雙抗原夾心法

用特異性抗原進行包被和制備酶結合物，以檢測相應的抗體。抗HBs的檢測抗HCV的檢測抗HIV的檢測第33頁/共61頁

ELISA—雙抗原夾心法

第34頁/共61頁

ELISA—競爭法標本中的抗體和一定量的酶標抗體競爭與固相抗原結合。如受檢標本中無抗體，則酶標抗體能順利地與固相抗原結合。加入酶標抗原后就顯色深。如受檢標本中含有抗體，則與酶標抗體以同樣的機會與固相抗原結合，競爭性地占去了酶標抗體與固相抗原結合的機會，使酶標抗原與固相載體的結合量減少。加入酶標抗原后就顯色淺或不顯色。第35頁/共61頁

ELISA—競爭法第36頁/共61頁

ELISA—競爭法最常見的應用：乙肝HBeAb、HBcAb檢測第37頁/共61頁ELISA—捕獲法（1）將抗人

IgM抗體（抗人

IgMμ鏈抗體）連接在固相載體上，形成固相抗人

IgM。（2）加入標本，

IgM抗體被固相抗體捕獲。洗滌除去其他抗體。（3）加入特異性抗原試劑，它只與固相上的特異性

IgM結合，洗滌。（4）加入針對特異性抗原的酶標抗體，形成固相二抗—IgM抗體—抗原—酶標抗體復合物。（5）加底物顯色，如有顏色顯示，則表示血清標本中的特異性

IgM抗體存在，是為陽性反應。第38頁/共61頁ELISA—捕獲法以優生四項IgM抗體檢測為例第39頁/共61頁ELISA—捕獲法甲肝IgM抗體測定第40頁/共61頁ELISA總結酶免疫測定具有高度的敏感性和特異性，幾乎所有的可溶性抗原抗體系統均可用以檢測。它的最小可測值達ng甚至pg水平。酶免疫測定標記試劑比較穩定，且無放射性危害。因此，酶免疫測定的應用日新月異，酶免疫測定的新方法、新技術不斷發展。第41頁/共61頁固相膜免疫測定利用微孔膜（主要是醋酸纖維素膜）作為固相進行免疫檢測的方法根據標記物的不同分為兩類：

酶標固相膜免疫測定：

酶免疫斑點法

酶免疫印跡法

金標法：

膠體金斑點滲濾試驗

膠體金免疫層析試驗第42頁/共61頁酶標固相膜免疫測定原理第43頁/共61頁酶免疫斑點法常應用于自身抗體的檢測第44頁/共61頁

酶免疫印跡法

第45頁/共61頁

膠體金斑點滲濾試驗

第46頁/共61頁

膠體金斑點滲濾試驗

第47頁/共61頁膠體金免疫層析試驗金標雙抗體夾心法測抗原將試紙條下端浸入液體標本中，下端吸水材料即吸取液體向上端移動，流經C處時使干片上的免疫金復合物復溶，并帶動其向膜條滲移。若標本中有待測特異抗原，其時可與免疫金復合物之抗體結合，此抗原抗體復合物流至測試區即被固相抗體所獲，在膜上顯出紅色反應線條（T）。過剩的免疫金復合物繼續前行，至參照區與固相小鼠IgG結合（免疫金復合物中的單克隆抗體為小鼠IgG），而顯出紅色質控線條（R）。反之，陰性標本則無反應線條，而僅顯示質控線條。第48頁/共61頁膠體金免疫層析試驗第49頁/共61頁膠體金免疫層析試驗檢測HIV－Ab的雙抗原夾心法第50頁/共61頁金標法的應用HCG的檢測第51頁/共61頁金標法的應用HBs-Ag的檢測第52頁/共61頁金標法的應用大便潛血試驗（FOB）第53頁/共61頁金標法的應用輪狀病毒和腺病毒抗原檢測第54頁/共61頁金標法的應用幽門螺桿菌（HP）抗原檢測第55頁/共61頁金標法的應用O1群霍亂弧菌檢測第56頁/共61頁金標法的應用HCV-Ab檢測第57頁/共61頁金標法的應用艾滋病抗體金標檢測第58頁/共61頁金標法總結上述兩種試驗的共同特點是：簡便、快速、單