基因工程概述第1頁/共48頁證明DNA是遺傳物質發現DNA雙螺旋結構破譯遺傳密碼限制性核酸內切酶的發現DNA連接酶的發現逆轉錄酶的發現質粒等載體的發現基因工程的誕生1944，艾弗里1953，沃森和克里克1963，尼倫貝格1970，阿爾伯、內森斯、史密斯第2頁/共48頁基因工程的誕生1973年，美國科學家科恩（S.N.Cohen）等將兩種不同來源的DNA分子進行體外重組,并首次實現了在大腸桿菌中的表達,創立了定向改造生物的新技術—基因工程。第3頁/共48頁1973年，科恩和博耶將兩個不同的質粒（一個是抗四環素質粒，另一個是抗鏈霉素質粒）拼接在一起，組成嵌合質粒，并將其導入大腸桿菌，當該重組質粒進入大腸桿菌體內后，這些大腸桿菌能抵抗兩種藥物，而且這種大腸桿菌的后代都具有雙重抗藥性。第4頁/共48頁基因工程大事記1973年，體外重組的基因首次實現在大腸桿菌中的表達1977年，生長激素抑制素在大腸桿菌中成功表達1978年，人胰島素在大腸桿菌中成功合成1979年，人生長激素在大腸桿菌中得以表達1980年，人干擾素在大腸桿菌中成功表達1982年，巨型小鼠培育成功第5頁/共48頁基因工程的工具—酶與載體分子手術刀——限制性核酸內切酶。分子針線（分子縫合針）—DNA連接酶。基因的運輸工具（分子運輸車）—載體。第6頁/共48頁限制性核酸內切酶

限制性內切酶是在生物體(主要是微生物)內的一種酶，能將外來的DNA切斷，由于這種切割作用是在DNA分子內部進行的，故名限制性核酸內切酶。

即每種限制性內切酶只能識別特定的核苷酸序列，并在特定的位點上切割DNA分子。特點：特異性。舉例：EcoR1限制酶、Sma1限制酶第7頁/共48頁不同的限制性核酸內切酶知識海洋平(口)末端回文序列第8頁/共48頁要想獲得某個特定性狀的基因必須要用限制酶切幾個切口？可產生幾個黏性末端？要切兩個切口，產生四個黏性末端。如果把兩種來源不同的DNA用同一種限制酶來切割，會怎樣呢？

會產生相同的黏性末端，然后讓兩者的黏性末端黏合起來，就似乎可以合成重組的DNA分子了。第9頁/共48頁AAT

GAATTC

GATGATTCCGTAAT

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CTTAAG

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第10頁/共48頁DNA連接酶（DNAligase）同一種第11頁/共48頁連接的部位：

用DNA連接酶連接兩個相同的黏性未端要連接幾個磷酸二酯鍵？磷酸二酯鍵，不是氫鍵。第12頁/共48頁連接酶的種類E.coliDNA連接酶T4DNA連接酶第13頁/共48頁14第14頁/共48頁外源基因(如大鼠生長激素基因)怎樣才能導入受體細胞(如小鼠受精卵)？導入過程需要運輸工具——載體。載體的作用有哪些？作用一：作為運載工具，將外源基因轉移到受體細胞中去。作用二：利用載體在受體細胞內，對外源基因進行大量復制。第15頁/共48頁作為載體必須具備哪些條件？1）能夠在宿主細胞中復制并穩定地保存。2）具多個限制酶切點，以便與外源基因連接。3）具有某些標記基因，便于進行篩選。如抗菌素的抗性基因、產物具有顏色反應的基因等。載體第16頁/共48頁常用的載體主要有兩類：

1）細菌細胞質的質粒

2）噬菌體或某些動植物病毒第17頁/共48頁質粒的特點細胞染色體外能自主復制的小型環狀DNA分子；質粒是基因工程中最早應用也是最常用的載體；存在于許多細菌及酵母菌等生物中；質粒的存在對宿主細胞的生存無影響；質粒的復制只能在宿主細胞內完成。第18頁/共48頁

最常用的質粒是大腸桿菌的質粒，其中常含有抗藥基因，如四環素等標記基因。最簡單的質粒載體必需包括3部分：復制區（含復制原點）目的基因插入點遺傳標記基因第19頁/共48頁第20頁/共48頁1.下列有關基因工程中限制性核酸內切酶的描述，錯誤的是（）

A.一種限制性核酸內切酶只能識別一種特定的脫氧核苷酸序列

B.限制性核酸內切酶的活性受溫度的影響

C.限制性核酸內切酶能識別和切割RNAD.限制性核酸內切酶可從原核生物中提取

C反饋練習第21頁/共48頁2.下列關于DNA連接酶作用的敘述，正確的是（）

A.將單個核苷酸加到某DNA片段末端，形成磷酸二酯鍵

B.將斷開的兩個DNA片段的骨架連接起來，重新形成磷酸二酯鍵

C.連接兩條DNA鏈上堿基之間的氫鍵

D.只能將雙鏈DNA片段互補的黏性末端之間連接起來，而不能將雙鏈DNA片段平末端之間進行連接B第22頁/共48頁3.下表關于基因工程中有關基因操作的名詞及對應的內容，正確的組合是（）

供體剪刀針線載體受體A質粒限制性核酸內切酶DNA連接酶提供目的基因的生物大腸桿菌等B提供目的基因的生物DNA連接酶限制性核酸內切酶質粒大腸桿菌等C提供目的基因的生物限制性核酸內切酶DNA連接酶質粒大腸桿菌等D大腸桿菌等DNA連接酶限制性核酸內切酶提供目的基因的生物質粒C第23頁/共48頁4第24頁/共48頁5第25頁/共48頁26第26頁/共48頁第27頁/共48頁基因工程的一般步驟獲得目的基因（目的基因的獲取）制備重組DNA分子（基因表達載體的構建）轉化受體細胞(將目的基因導入受體細胞)（篩選出獲得目的基因的受體細胞、培養重組細胞）4.目的基因的表達（目的基因的檢測和鑒定）第28頁/共48頁第一步：獲取目的基因

方法：將含有某種生物不同基因的許多DNA片段，導入受體菌的群體中儲存，各個受體菌分別含有這種生物的不同基因，稱為基因文庫（genelibrary）基因組文庫cDNA文庫1.從基因文庫中獲取目的基因。第29頁/共48頁第30頁/共48頁2.利用PCR技術擴增目的基因

PCR（polymerasechainreaction）:聚合酶鏈式反應.是以DNA變性、復制的某些特性為原理設計的.1988，K.Mulllis莫里斯發明。前提條件是必須對目的基因有一定的了解，需要設計引物。

3.通過化學方法直接人工合成

高溫變性低溫退火(復性)中溫延伸第31頁/共48頁第二步：制備重組DNA分子

（基因表達載體的構建）核心限制性核酸內切酶需要哪兩種工具？DNA連接酶第32頁/共48頁總結：表達載體需由哪幾部分組成復制原點啟動子目的基因終止子標記基因第33頁/共48頁第三步：轉化受體細胞

（將目的基因導入受體細胞）將目的基因導入植物細胞將目的基因導入動物細胞將目的基因導入微生物細胞目的基因進入受體細胞，并且在受體細胞內維持穩定和表達的過程，稱為轉化（ruansformation）第34頁/共48頁將目的基因導入植物細胞的方法農桿菌轉化法基因槍法花粉管通道法第35頁/共48頁將目的基因導入微生物細胞方法宿主細胞（大腸桿菌）感受態細胞（大腸桿菌）Ca2+第36頁/共48頁基因工程中常用的宿主細胞有大腸桿菌、枯草桿菌、土壤農桿菌、酵母菌、霉菌、植物細胞、昆蟲細胞及哺乳動物細胞等。將目的基因導入受體細胞擴增第37頁/共48頁第四步：目的基因的檢測與鑒定首先：其次：最后：還要：要檢測轉基因生物的DNA上是否插入目的基因DNA分子雜交技術分子探針檢測目的基因是否轉錄出mRNA檢測目的基因是否翻譯出蛋白質個體生物學水平的鑒定第38頁/共48頁DNA分子雜交技術基因探針：核酸分子探針是指特定的已知核酸片段，能與互補核酸序列退火雜交，用于對待測核酸樣品中特定基因順序的探測。滿足：（1）必須是單鏈，（2）帶有容易被檢測出來的標記物。第39頁/共48頁1.下列有關基因工程技術的敘述，正確的是（）

A.重組DNA技術所用的工具酶是限制性核酸內切酶、連接酶和載體

B.所有的限制性核酸內切酶都只能識別同一種特定的核苷酸序列

C.選用細菌作為重組質粒的受體細胞是因為細菌繁殖快

D.只要目的基因進入受體細胞就能實現表達反饋練習第40頁/共48頁2第41頁/共48頁第42頁/共48頁第43頁/共48頁3．（2010江蘇高考，27題，8分）下表中列出了幾種限制酶識別序列及其切割位點，圖l、圖2中箭頭表示相關限制酶的酶切位點。請回答下列問題：（1）一個圖1所示的質粒分子經SmaⅠ切割前后，分別含有

個游離的磷酸基團。0、2

第44頁/共48頁（2）若對圖中質粒進行改造，插入的SmaⅠ酶切位點越多，質粒的熱穩定性越

。（3）用圖中的質粒和外源DNA構建重組質粒，不能使用SmaⅠ切割，原因是

。（4）與只使用EcoRI相比較，使用BamHⅠ和HindⅢ兩種限制酶同時處理質粒、外源DNA的優點在于可以防止

。（5）為了獲取重組質粒，將切割后的質粒與目的基因片段混合，并加入

酶。（6）重組質粒中抗生素抗性基因的作用是為了

。（7）為了從cDNA文庫中分離獲取蔗糖轉運蛋白基因，將重組質粒導入喪失吸收蔗糖能力的大腸桿菌突變體，然后在