基因工程制藥中第1頁/共59頁1.載體：（1）根據載體的復制序列可分為4類：YEp（酵母附加體質粒）、YRp（酵母復制型質粒）、YCp（酵母著絲粒質粒）、Yip（酵母整合質粒）。YEp：此類載體以酵母的天然2μ質粒為基礎，帶有2μ質粒復制區序列，拷貝數高，轉化頻率高、穩定性好，應用較廣。YRp：復制序列為非2μ來源的自主復制序列，穩定性差，拷貝數少YCp：有ARS、端粒、著絲粒等，類似于染色體的行為，穩定性好，但拷貝數只有1個。YIp：可完全整合到酵母染色體中，穩定性好，但拷貝數只有1個。第2頁/共59頁（2）酵母克隆載體：①含有大腸桿菌的復制原點和抗性基因，可在大腸桿菌中克隆增殖②也可在酵母中進行復制和表型選擇。酵母表型選擇為營養缺陷型（合成氨基酸或核苷酸的酶系突變缺失）或抗性篩選。（3）表達載體：將酵母菌的啟動子和終止子等有關控制序列引入載體的適當位點后，就構成了酵母菌的表達載體。①普通表達載體：只能方便引入外源基因并進行表達，對表達產物的組成，特別是對其N末端氨基酸是否增加并無嚴格要求。②精確表達載體：要求在啟動子或前導肽編碼序列的適當部位有內切酶位點，以利于插入外源基因，并使其在表達加工后N末端氨基酸序列與天然產物相同。如在構建α-因子精確表達載體時，在其Arg85后引入酶切位點，同時Arg也為酵母蛋白酶斷裂位點。第3頁/共59頁第4頁/共59頁2.影響目的基因在酵母菌中表達的因素（1）外源基因的拷貝數：有些酵母質粒導入細胞后在傳代培養中丟失；整合質粒很穩定，但拷貝數低，不能高效表達；高度穩定的高拷貝數的質粒可使外源基因高效表達，但高拷貝數常會引起細胞生長量的降低。（2）外源基因的表達效率：主要與啟動子、分泌信號和終止序列有關。①啟動子：由上游激活序列和保留的近端啟動子組成。近端啟動子含有轉錄必須的TATA序列和mRNA起始轉錄位點ATG。終止子區含有終止轉錄所需信號。組成型啟動子：如果外源基因表達產物對酵母細胞不利，會使細胞生長不良，達不到所需的細胞密度。誘導型啟動子：第5頁/共59頁第6頁/共59頁②分泌信號的效率：分泌信號包括信號肽部分及前導肽部分的編碼序列，可幫助表達產物分泌出酵母細胞并在適當部位由胞內蛋白酶加工切斷表達產物與前導肽之間的肽鍵，產生正確的表達產物。第7頁/共59頁③終止序列的影響：終止序列保證了轉錄產物在適當部位終止和加上polyA尾巴，這樣形成的mRNA才能比較穩定并被高效翻譯。（3）外源蛋白的糖基化：N-糖苷鍵、O-糖苷鍵

（4）宿主菌株的影響：①菌體生長能力強②菌體內源蛋白酶較弱③菌株性能穩定④分泌能力強第8頁/共59頁第9頁/共59頁第10頁/共59頁酵母系統表達的優點：（3）某些酵母表達系統具有外分泌信號序列,能夠將所表達的外源蛋白質分泌到細胞外,因此很容易純化。（1）酵母生長繁殖速度迅速,能夠耐受較高的流體靜壓,用于表達基因工程產品時,可以大規模生產,有效降低了生產成本。（2）酵母表達外源基因具有一定的翻譯后加工能力,收獲的外源蛋白質具有一定程度上的折疊加工和糖基化修飾,性質較原核表達的蛋白質更加穩定,特別適合于表達真核生物基因和制備有功能的表達蛋白質。第11頁/共59頁解決內部降解的方法：（1）在培養基中加入富含氨基酸和多肽的蛋白胨或酪蛋白水解物,通過增加酶作用底物來緩解蛋白水解作用（2）將培養基的pH值調成酸性(酵母可在pH3.0～8.0的范圍內生長),以抑制中性蛋白酶的活性;（3）利用蛋白酶缺失酵母突變體進行外源基因的表達。酵母表達系統的不足之處：（1）產物蛋白質的不均一（2）信號肽加工不完全（3）內部降解（4）多聚體形成等,造成表達蛋白質在結構上的不一致。（5）還時常遇到表達產物的過度糖基化情況。第12頁/共59頁

利用酵母菌表達外源基因的策略（1）增加整合在酵母染色體上的目的基因劑量（2）控制外源基因中的AT含量（3）選擇最為合適的信號肽（4）外源基因在酵母菌表達的影響因素還有很多,如整合位點、mRNA5′和3′非翻譯區(UTR)、宿主菌的Mut表型、蛋白酶、表達蛋白質自身的特點、培養基及培養的環境條件等,有效控制各種影響表達的因素,對于外源基因的高效表達都必不可少。第13頁/共59頁用酵母表達系統(宿主--載體系統)（1）釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)：難于高密度培養,分泌效率低,幾乎不分泌分子量大于30kD的外源蛋白質,也不能使所表達的外源蛋白質正確糖基化,而且表達蛋白質的C端往往被截短。（2）甲醇營養型酵母表達系統：包括漢森酵母屬(Hansenula),畢赤酵母屬

(Pichia),球擬酵母屬(Torulopsis)等,能在以甲醇為唯一能源和碳源的培養基上生長,甲醇可以誘導它們表達甲醇代謝所需的酶,如醇氧化酶Ⅰ(AOX1)等。（3）裂殖酵母(Schizogenesispombe)表達系統：具有許多與高等真核細胞相似的特性,它所表達的外源基因產物具有相應天然蛋白質的構象和活性，但目前研究較少。第14頁/共59頁（1）將目的基因克隆入酵母表達載體（2）用適當的限制性內切酶消化重組質粒,使之線性化（3）將線性化的重組質粒轉化入酵母菌株(如GS115,KM71)（4）將轉化物接種HIS4缺陷平板進行第一輪篩選（5）用不同濃度的G418平板進行第二輪篩選（6）挑選10～20個克隆進行小規模誘導培養,鑒定外源基因的表達量（7）挑選高水平表達菌株進行大規模誘導培養,以制備外源基因的表達蛋白質。用酵母菌表達外源基因的步驟第15頁/共59頁一、釀酒酵母：單細胞真核微生物，被稱為真核生物中的“大腸桿菌”，最早應用于酵母基因克隆和表達的宿主菌。1981年用釀酒酵母表達人干擾素獲得成功后，人們還用釀酒酵母表達了多種原核和真核蛋白。第16頁/共59頁（一）釀酒酵母表達系統組成（1）YIp型載體：整合型載體，不含酵母DNA復制起始區，不能在酵母中進行自主復制，含有整合介導區，此載體整合到染色體上，穩定性高，缺點為拷貝數低。解決措施：用酵母轉座子以產生多個插入拷貝；將re-DNA插入到核糖體rDNA中，在宿主染色體上以150串聯重復序列存在。1、載體（2）YEp型載體：附加型載體，含有釀酒酵母2μ

質粒DNA復制有關的部分或全部序列,常以30或更多拷貝存在，但不穩定,能獨立于酵母染色體之外復制，為穿梭質粒。不穩定解決措施：以脆弱的srbl-1突變的宿主株為基礎建立自然選擇系統,這個菌株要求滲透壓穩定，否則會裂解，轉化后帶野生型SRB的自主復制YEp型質粒與此菌株進行互補，可在培養基上保持選擇性。第17頁/共59頁第18頁/共59頁2、宿主菌—釀酒酵母釀酒酵母基因組序列早在1996年就完成，它有16條染色體，約6000個ORF，僅4%的酵母基因有內含子。（二）釀酒酵母基因表達系統研究現狀目前利用釀酒酵母為宿主系統表達了多種外源基因產物，如乙型肝炎疫苗、人胰島素、人粒細胞集落刺激因子、人血管抑制素等。外源基因可在釀酒酵母中分泌表達，通常為將重組蛋白的成熟蛋白形式與結合信息素的pre-pro序列融合，pro序列可用Kex2酶的蛋白水解作用切去，這個步驟是廣泛存在于真核生物中的，表達產物分泌至胞外不僅有利于純化，而且避免了產物在胞內大量蓄積對細胞的不利影響。第一個商品化的重組疫苗來自釀酒酵母。第19頁/共59頁（三）釀酒酵母表達系統高效表達的策略（1）轉錄水平（2）表達載體的拷貝數和穩定性（3）胞內表達產物的加工和修飾（4）分泌表達產物的加工和修飾等等。第20頁/共59頁（四）釀酒酵母表達系統的應用及前景利用釀酒酵母表達系統生產制備外源基因的表達產物已有20余年的歷史，但實踐中仍然發現有很多的外源基因不能在酵母表達系統中表達，具體原因目前還沒有明確。另外，還沒有徹底克服酵母表達系統制備外源蛋白質時發生的不均一現象。第21頁/共59頁第22頁/共59頁二、甲醇營養型酵母（1）能利用甲醇作唯一碳源的一類酵母,其代謝甲醇的第一步是在醇氧化酶的作用下甲醇被氧化成甲醛，調節這種酶的啟動子是強啟動子并嚴格受甲醇誘導,因此可用于調控外源蛋白表達。（2）甲醇酵母能在無機鹽培養基中快速生長,易進行工業化大生產,高密度培養干細胞量可達100g/L以上，外源蛋白的表達量比釀酒酵母增加10-100倍。第23頁/共59頁（3）能對重組蛋白進行翻譯后必要的剪接、正確的折疊和修飾,糖基化也更接近高等真核生物甚至人類。（4）Pichiapastoris、Pichiamethanolical、Hansenulapolymorpha、Candidabiodinii等甲醇酵母已發展成為高效的表達系統,已成功表達了多種重組蛋白并顯示出巨大的優越性，成為目前基因表達優先考慮的表達系統。第24頁/共59頁①具有強有力的、易控制的AOX啟動子,可嚴格調控外源蛋白的表達;②可對表達蛋白進行翻譯后加工和修飾,即二硫鍵的形成、蛋白磷酸化、折疊、信號序列加工、N-糖基化、O-糖基化,從而使表達出的蛋白具有生物活性;③對營養要求低,生長快,培養基廉價,便于工業化生產;④可高密度發酵培養,蛋白產量高;⑤表達量高,如破傷風毒素C片段表達量高達12g/L;⑥甲醇酵母自身分泌的背景蛋白少,表達產物較易純化,表達的蛋白既可存在于胞內,又可分泌至胞外,如表達的重組水蛭素(HIR)僅經過兩步層析純化,純度就高達97%以上;⑦糖基化程度低,和釀酒酵母相比,甲醇酵母中加到翻譯蛋白的糖鏈每條長度為8～14個甘露糖殘基,較之釀酒酵母(50～150甘露糖殘基)短得多。此外,釀酒酵母核心多糖末端存在α-1,3糖苷鍵,使這些蛋白具有高度的抗原性,因而不適宜作治療制劑,而甲醇酵母沒有。甲醇酵母表達系統的優點第25頁/共59頁（1）缺乏葡萄糖、甘油時,

利用甲醇為惟一碳源。（2）甲醇在乙醇氧化酶作用下被氧化成甲醛,在過氧化物酶體中氧化成H2O2。（3）乙醇氧化酶對氧的親和力很弱,因此代償性地大量產生該酶,調控這種酶的啟動子是強啟動子,可用來調控異源蛋白的表達。兩種乙醇氧化酶(即AOX1和AOX2),細胞中絕大多數乙醇氧化酶的活力是由AOX1提供。（一）巴斯德畢赤酵母1、生物學特性第26頁/共59頁（4）當aox1基因缺失只存在aox2時,大部分的乙醇氧化酶活力喪失,細胞利用甲醇能力降低,細胞在甲醇培養基上生長很慢,這種菌株被稱為Muts(Methanolutilizationslow);aox1基因存在時,細胞利用甲醇能力正常,在甲醇培養基上生長較快,這種菌株表型被稱為Mut+。（5）aox1基因的表達為轉錄水平調控。aox1基因的調控是一個抑制機制加上誘導機制的過程,在以葡萄糖或甘油為碳源的培養基上生長時抑制轉錄,而在以甲醇為惟一生長碳源時誘導基因轉錄,蛋白質表達。（6)甲醇酵母生長適宜溫度一般為28～30℃。誘導期間如果溫度超過32℃,不利于蛋白表達,甚至會導致細胞死亡。第27頁/共59頁第28頁/共59頁2、載體：主要是可以整合到酵母基因組中的整合型質粒,其主要元件包括啟動子,信號肽,多克隆位點,終止子,選擇標志,以及可以誘導基因發生重組的同源序列和在大腸桿菌中的復制起點及抗藥性基因。第29頁/共59頁含有AOX1基因序列的表達載體既可以在酵母基因組AOXl或HIS4

位點發生單交換,插入到酵母基因組中;也可以發生雙交換而取代AOX1基因,相應的表現型分別為Mut+和Muts。AOX1區的整合包括同源雙交換引起的基因置換和位點特異性單交換引起的基因插入。前者使染色體AOX1基因被外源基因表達盒替換,Mut+表型菌株會轉變為MutS或Mut-,而MutS和Mut-菌株表型不變;后者不改變宿主原有的AOX1基因,故各種菌株的Mut表型不變。HIS4區的整合方式為位點特異性單交換。表達載體向HIS4區或AOX1區的整合賦予宿主菌野生型組氨醇脫氫酶基因,使其表型由HIS-變為HIS+,可以此篩選轉化子。第30頁/共59頁（1）啟動子AOXl啟動子(PAOX1)和甘油醛三磷酸脫氫酶(GAP)啟動子。PAOX1：受甲醇的嚴格調控,在碳源為非甲醇的條件下,AOX1基因轉錄的mRNA檢測不到,但在甲醇為唯一碳源的培養基中,AOX1基因編碼的mRNA可達到總RNA的5%。在PAOX1調控下表達外源基因時可通過調節甲醇而適時地控制表達過程,這樣可以有效地減輕選擇壓力,保證外源基因的穩定存在。PGAP：發酵過程操作簡便,可以連續表達,無需誘導。利用PGAP表達外源基因主要的限制是目的蛋白不能對宿主菌有毒性,否則在長期的發酵過程中將限制其生長。第31頁/共59頁（2）信號肽釀酒酵母的交配因子

(α-matingfactor,α-MF)的信號肽pre-pro或前導部分pre：可以介導蛋白質沿分泌通路分泌到細胞外,在分泌過程中可以被自身的膜蛋白酶Kex-2自動切割去除,Kex-2的切割位點是其C末端連續兩個堿性氨基酸的氨基端。可使用外源蛋白自身信號肽,如不能利用自身信號肽,可選擇酵母α因子的前導序列，該序列可非常有效地引導體積稍小的產物出胞。兩種產物形式：在α因子信號的引導下,通過高爾基體,分泌到胞外的可溶性蛋白或以包涵體形式存在。第32頁/共59頁真核生物內許多細胞因子、淋巴因子、酶、激素等在翻譯后加工過程中,蛋白前體經酶切變為成熟蛋白時的切割位點也是在連續兩個堿性氨基酸的C末端,因此用畢赤酵母表達系統可以對真核蛋白進行正確的翻譯后酶切加工。Kex-2：位于細胞膜上，專一性水解α因子前體中羧基端的肽鍵，位點為連續兩個堿性氨基酸殘基,如α因子的Glu-Lys–Arg*Glu-Ala-Glu-Ala(*表示水解位點)。STE13：識別和水解的是α因子的Glu–Ala*Glu-Ala重復序列,從而保證了蛋白加工過程中的信號肽的切除。第33頁/共59頁解決方法：采用氨基末端間隔序列解決,在α-因子的前導肽序列和產物之間加1個間隔序列,這個間隔序列肽可在體外或體內用特異蛋白酶或酵母天冬氨酰蛋白酶切除。缺點：信號肽加工、切割不完全酵母表達基因工程產物時,往往是Kex-2蛋白酶除去α-因子的前導肽序列常不夠完全,導致分泌蛋白有一個過長的氨基酸末端。在采用pGAPZα作為表達載體時,由于信號肽加工不完全,可使表達的外源蛋白的分子量大小增加9KDa,但一般不影響其生物活性。第34頁/共59頁（3）選擇標記營養缺陷型標記：通常所用的酵母菌是組氨酸脫氫酶缺陷型的(HIS4)菌株,如GS115、KM71,只有轉化了含HIS4載體的菌株才可以在組氨酸缺陷的選擇性培養基上生長注意：能在選擇性培養基中生長的菌株并不一定含有目的基因,HIS4+的轉化子中約10%～50%根本不含有其它表達載體成分,這主要是因為載體上的HIS4基因與基因組中的his4位點發生重組導致回復突變所致,利用電轉化時該比例更高。抗性基因：含有細菌卡那霉素耐藥基因的載體對抗生素G418產生抗性。含有Shble基因表達產物可以對抗生素Zeocin產生抗性,而且在大腸桿菌與畢赤酵母中均可用作選擇標記。第35頁/共59頁第36頁/共59頁第37頁/共59頁3、菌株GS115：含有AOX1和AOX2基因,在含有甲醇的培養基中生長迅速(Mut+);KM71

：AOX1基因被釀酒酵母的SARG4取代,在甲醇中只能使用AOX2來代謝甲醇,因此生長緩慢(Muts);MC10023：AOX1和AOX2基因均被取代,因而在甲醇為碳源的培養基中不能生長,其表型為Mut-蛋白酶基因缺陷的菌株：SMD1163、SMD1165、SMD1168。蛋白酶缺陷型菌株的活力較差,轉化率低且生長緩慢,所獲外源目的蛋白產量較低。因此,只有在其他降低蛋白酶解方法均不理想時,才使用蛋白酶缺陷型菌株。第38頁/共59頁4、轉化轉化巴斯德畢赤酵母的常見方法有四種:原生質體轉化法、電轉化法、聚乙二醇(PEG)法和氯化鋰(LiCl)法。原生質球和電轉化法效率較高(約103

～104

轉化子/μgDNA)。電轉化簡單,原生質球方法復雜。PEG方法和LiCl方法很簡單,但這兩種方法轉化效率較低,且不易形成多拷貝。第39頁/共59頁(1)目的基因的克隆(2)重組載體線性化(3)轉化(4)篩選：利用載體和營養缺陷型菌株的互補性或對抗生素的抗性來進行初篩,復篩可用PCR。(5)外源蛋白的表達：組成型啟動子,

醇誘導型啟動子。(6)放大：表達的條件(如通氣狀況,pH值,培養基的組成等),經優化以后就可以按比例放大,從搖瓶培養轉至大規模發酵。5、巴斯德畢赤酵母中表達蛋白的步驟第40頁/共59頁6、外源蛋白的糖基化（1）N–糖基化：寡糖鏈與外源蛋白肽鏈糖基化識別位點(Asn-X–Ser/Thr)天冬酰胺上的氮原子(N)共價結合;（2）O–糖基化：寡糖鏈與外源蛋白肽鏈絲氨酸/蘇氨酸上的羥基(OH)共價結合。（3）高等真核細胞糖基化寡糖鏈含N-乙酰半乳糖胺、半乳糖和唾液酸;而低等真核細胞如巴斯德畢赤酵母在其分泌的外源蛋白上所添加的寡糖鏈只含甘露糖。（4）

有些天然分泌時不被糖基化的蛋白,由巴斯德畢赤酵母表達時卻可能發生糖基化。如人體內合成的胰島素樣生長因子I為非糖基化蛋白,而由巴斯德畢赤酵母表達時,卻有15%發生了糖基化作用。（5）

巴斯德畢赤酵母為其外源蛋白添加寡糖鏈時,所選擇的絲氨酸和蘇氨酸有時也與天然宿主細胞不一致。第41頁/共59頁（6）巴斯德酵母表達的糖蛋白多為8～14個甘露糖,

產物穩定,蛋白質分子量較接近;而釀酒酵母表達的糖蛋白甘露糖殘基多達50～150個,蛋白質分子量差異較大。（7）雖然糖基化對某些外源蛋白的活性沒有太大影響,但卻可能在蛋白折疊和抗蛋白酶降解中起重要作用。（8）從藥物應用的觀點來看,不合適的糖基化和寡聚體可能會在機體內產生免疫反應或毒副作用,并且會明顯影響純化過程中產率的提高。N-糖基化對于很多蛋白的正確折疊、藥物動力學的穩定性和功效非常重要

。第42頁/共59頁7、分泌表達（3）分泌信號肽：包括異源蛋白自身的信號肽序列，釀酒酵母

的α-MF分泌信號肽序列，畢赤酵母

的PHOI(酸性磷酸酶)分泌信號肽等。（2）優點：利于外源蛋白的純化。（1）意義：分泌蛋白可進行翻譯后加工,例如蛋白裂解成熟、糖基化、二硫鍵的形成。第43頁/共59頁8、影響外源蛋白表達的因素及提高蛋白表達量的策略密碼子的使用頻率：密碼子的偏愛性（1）外源基因的內在特性mRNA5′端非翻譯區(5′UTR)：酵母中AOX1的表達量極高,可使外源基因mRNA5′UTR和AOX1相似或一致。A+T含量：含量高，偶爾會造成轉錄提前終止，對AT含量豐富的基因重新設計序列,使其A+T含量在30%～55%范圍內。起始密碼子AUG的旁側序列：起始密碼子不可處于其周圍序列形成的RNA二級結構中。必要的Kozak共有序列(ACCAUGG)也有助于翻譯的正確起始。第44頁/共59頁在不改變表達載體及宿主菌的前提下,通過從Muts中分離Mut+自發突變體來使外源蛋白的表達量增加。（2）載體和宿主菌宿主菌蛋白酶對外源蛋白的影響。轉化子的表型對外源蛋白的表達有影響：蛋白胞內表達時,優先考慮用Muts表型;對于分泌表達,Mut+和Muts都可使用。在高生物量發酵中,Mut+生長更快,較之Muts對于提高外源蛋白的表達量更有效。有時Muts菌株雖然在誘導階段生長緩慢,但外源蛋白的表達反而更高,更有利于蛋白的正確折疊。第45頁/共59頁④在極少數情況下拷貝數的增加反而會導致蛋白產量的下降。（3）基因拷貝數①一般來說，外源基因整合的拷貝數愈高,蛋白表達量愈大。②并非所有高拷貝的轉化子都能產生高的表達量,特別在分泌表達時,這可能是由于高水平表達阻斷分泌途徑所致。③有時有意增加拷貝數對表達量并沒有什么效果第46頁/共59頁④甲醇：利用甲醇誘導外源蛋白表達,在誘導期間每天應往培養基中補加甲醇,以彌補甲醇的消耗和蒸發，一般每天添加到培養基中的甲醇含量為培養基體積0.5%。（4）培養條件①通氣：充足的通氣量對于誘導階段外源蛋白的表達極其重要。②培養基：主要對生物量和誘導表達有影響。③培養時間：培養時間長,也會產生比較大的生物量,在表達某些蛋白時發現,培養時間過長會發生蛋白質的過量水解。第47頁/共59頁（3）連續灌注培養：9、發酵培養的工藝（1）兩步發酵：生物量擴增階段,加少量抑制物(通常為甘油)就能滿足細胞快速生長,AOX的表達被抑制;在表達階段,只需讓細胞耗盡剩余的甘油,然后加入甲醇,外源蛋白就能得到誘導表達,這時酵母生長及其緩慢。甲醇誘導后長達150～200h外源蛋白的表達達到高峰值，可獲得高產量的重組蛋白。（2）混合發酵：在擴增與表達階段加入一個過渡階段,在過渡期內按生長限制的比例添加甘油,并在甲醇誘導階段加入甘油。這種甲醇-甘油共存的方法可使有些表達菌株更活躍,合成蛋白更迅速，縮短表達時間。第48頁/共59頁10、局限性（1）發酵周期較長,易污染,且長時間的發酵不利于外源蛋白的表達;（2）利用易燃的甲醇,表達產物的衛生安全性需要考慮;（3）篩選藥物價格昂貴也給生產應用帶來局限;（4）低表達或不表達的例子也在增多。（5）分泌表達的蛋白在培養基中被自身分泌的蛋白酶降解,由于甲醇酵母多采用高密度發酵，蛋白酶也會隨著細胞密度的增高而增高。（6）有些蛋白在畢赤酵母中分泌表達時會發生過度糖基化,過度糖基化會帶來一系列問題。第49頁/共59頁③利用基因工程去掉N-糖基化位點。如何解決酵母過度糖基化的問題？①將分泌性表達改變為細胞內表達;②用N-糖苷酶或其它酶去掉糖基;第50頁/共59頁第51頁/共59頁為什么純化后的結果是質量相近的兩條帶而非一條帶？第52頁/共59頁1、生物學特性：（1）甲醇代謝與Pichiapastoris相似，有兩個乙醇氧化酶基因AUG1和AUG2,在甲醇代謝中的作用與畢赤酵母相似。AUG1的啟動子受甲醇專一誘導且高水平表達,用作調控外源基因的表達。（2）AUG1基因的表達被葡萄糖抑制,但能被甲醇作唯一碳源誘導迅速表達,與Pichiapastoris不同,葡萄糖對AUX1啟動子的阻遏,轉換為甲醇為唯一碳源的培養基不能迅速解除抑制,因此,可以讓Pichiamethanolica在葡萄糖培養基上良好生長,待葡萄糖消耗完后再用甲醇進行誘導。（二）甲醇畢赤酵母

Pichiamethanolical第53頁/共59頁2、表達載體：美國的Invitrogen公司推出了兩種表達質粒pMET、pMETα。（1）pMET用于胞內表達（2）pMETα用于分泌表達,與Pichiapastoris一樣利用釀酒酵母

的α-MF信號肽序將表達產物分泌到胞外（3）與Pichiapastoris不同的是,在轉化子中以可產生1-10%的多拷貝重組子,表達質粒沒有卡那霉素基因用于篩選多拷貝重組子,可以通過southern雜交來檢測重組子的拷貝數。（4）在轉化子中篩選高產表達菌株,因為不是拷貝數越多表達量就越高,特別對分泌表達來說,有時單拷貝能獲得最高表達。第54頁/共59頁3、宿主菌（1）兩種宿主菌，為PMAD11和PMAD16，都是ADE2(磷酸核糖酰氨基咪唑羧化酶)缺陷型。（2）PMAD16是由PMAD11進一步突變而來,缺失了蛋白酶基因,因此MAD16適合于表達對蛋白酶敏感的外源蛋白質,但在基本培養基上PMAD16慢于PMAD11。（3）PMAD11和PMAD16原始菌株是粉紅色菌落,而轉化子為白色,可以通過顏色的改變篩選轉化子。（4）表達載體通過同源重組以AUG1作為整合位點將表達質粒的外源基因整合到染色體上,轉化子的表型可能是Mut+也可能是Muts,與Pichiapastoris一樣需要鑒定轉化子表型。第55頁/共59頁（3）漢遜酵母和其它酵母一樣可以分泌表達,利用高效分泌表達載體,將水蛭素基因(hirudin)與MF-α

的信號肽進行融合，表達后能高效分泌且先導肽能被正確切除,