大腸桿菌質粒和噬菌體詳解演示文稿當前1頁，總共93頁。優選大腸桿菌質粒和噬菌體當前2頁，總共93頁。大腸桿菌

當前3頁，總共93頁。大腸桿菌中文名稱：大腸桿菌外文名稱：Escherichiacoli(Theodor

Escherich1885)界：原核生物界門：變形菌門(Bacteria)綱：γ-變形菌綱(Proteobacteria)目：腸桿菌目(Enterobacteriales)科：腸桿菌科(Enterobacteriaceae)屬：埃希氏菌屬(Escherichia)種：大腸桿菌種(E.coli)當前4頁，總共93頁。大腸桿菌一般特征◆原核生物，G-棒狀桿菌(紅色)◆有鞭毛，無芽孢，能運動，有的有莢膜◆長度大約2um，寬0.8um◆DNA長度約為體長的1000倍染色體是長約30kb的環狀dsDNA◆兼性厭氧，生長需求非常簡單，在僅含碳水化合物和少量氮源及無機鹽的培養基上即可生長◆主要寄生于大腸內，約占腸道菌1%，正常棲居條件下不致病當前5頁，總共93頁。大腸桿菌水分

70%蛋白質

15%碳水化合物3%RNA 6%DNA 1%礦物離子1%其他成分 4%當前6頁，總共93頁。Escherich在1885年發現E.coli，廣泛存在于人和溫血動物腸道中，44.5℃發酵乳糖產酸產氣。最初認為是非致病菌。20世紀中葉，認識到一些特殊血清型E.coli對人和動物致病，引起嚴重腹瀉和敗血癥。根據不同生物學特性將致病性大腸桿菌分為6類：腸致病性大腸桿菌（EPEC）腸產毒性大腸桿菌（ETEC）腸侵襲性大腸桿菌（EIEC）腸出血性大腸桿菌（EHEC）腸黏附性大腸桿菌（EAEC）彌散粘附性大腸桿菌（DAEC）大腸桿菌當前7頁，總共93頁。大腸桿菌在分子生物學中的應用生物工程用菌株：用基因工程的方法，使外源基因得到高效表達的菌類細胞株系一般稱為“工程菌”。大腸桿菌是應用最廣泛最成功的首選高效表達體系；美國FDA批準為安全的基因工程受體生物。★背景清楚：全基因組測序，共有4405個ORF。遺傳背景清楚，并經過一系列突變篩選，使外源DNA在胞內不易發生重組或修飾，更適于基因操作。★生物安全：生物工程用菌株是在不斷篩選后被挑選出的，在自然條件下無法生長，甚至普通的清潔劑都可以輕易殺滅。即便由于操作不慎導致活菌從實驗室流出，也可避免對自然界造成危害。★菌株基因優化：生物工程用的菌株基因組都被優化過，使之帶有不同基因型（例如β半乳糖苷酶缺陷型），可用于分子克隆實驗。★操作簡便，表達量高：大腸桿菌操作和培養條件簡單，適于大規模發酵。表達的外源基因蛋白量甚至可以達到細菌總蛋白的80%。

當前8頁，總共93頁。大腸桿菌在分子生物學實驗中的應用缺點：★基因結構差異：大多數真核基因含有內含子，細菌中沒有除去內含子機制，外源基因編碼區必須是連續的，刪除真核基因的內含子和5’非編碼區原核：CDNA真核：DNA★轉錄信號不同：真核基因轉錄的mRNA分子不具有結合細菌核糖體所必須的SD序列細菌RNA聚合酶不能識別真核生物啟動子

SD序列（Shine-Dalgarnosequence）：細菌mRNA起始密碼子AUG上游10個堿基處，有一段富含嘌呤的堿基序列，能與細菌16SrRNA3’端識別，結合原核生物核糖體，幫助從起始AUG處開始翻譯。

當前9頁，總共93頁。大腸桿菌在分子生物學實驗中的應用

★

mRNA的分子結構差異：絕大多數真核mRNA分子的3末端有poly(A)尾巴，在5末端有一個帽結構。真核mRNA不能結合到細菌核糖上。★缺乏對真核生物蛋白質的修飾加工系統：表達的蛋白質不能進行糖基化、磷酸化修飾，難以形成正確的二硫鍵配對和空間構想折疊，因而蛋白質沒有足夠的生物學活性（缺乏對真核生物蛋白質的復性功能）。★大腸桿菌中的表達不存在信號肽，產品多為胞內產物，表達的蛋白經常是不溶的，表達蛋白量超過菌體總蛋白10%時，容易形成包涵體。★細胞周質中有種類繁多的內毒素很難除去，細菌的蛋白酶可以識別降解真核生物的蛋白質產物。當前10頁，總共93頁。加拿大人FrederickBanting和CharlesBest于1921年首先發現胰島素，1922年開始用于臨床，1923年或諾貝爾獎。1965年9月17日，中國科學家第一個在實驗室中人工合成了具有全部生物活力的結晶牛胰島素。人的胰島素基因在大腸桿菌里指揮著大腸桿菌生產出了人的胰島素。隨著細菌的繁殖，胰島素基因也一代代傳了下去，后代的大腸桿菌也能生產胰島素。這種帶上了人工給予的新的遺傳性狀的細菌，被稱為基因工程菌。應用實例胰島素由A、B兩個肽鏈組成。A鏈有11種21個氨基酸，B鏈有15種30個氨基酸，共51個氨基酸組成。其中A7-B7、A20-B19四個半胱氨酸中的巰基形成兩個二硫鍵，使A、B鏈連接起來。A鏈中A6與A11之間也存在二硫鍵。

當前11頁，總共93頁。大腸桿菌的培養與保存

LB培養基是大腸桿菌最常用的培養基。其它培養基都是在此基礎上有所加減。LB一般被解釋為Luria-Bertani培養基，其發明人GiuseppeBertani認為這個名字來源于英語的lysogenybroth，即溶菌肉湯。

酵母提取物：碳源，能源，磷酸鹽蛋白胨：氮源氯化鈉：無機鹽●液體LB培養基：每升含胰蛋白胨10克，酵母提取物5克，氯化鈉10克，高壓滅菌15磅30分鐘。●固體LB培養基：基本同上，加瓊脂15克/升。高壓滅菌后，冷卻至50℃左右，可根據需要加入適當的抗菌素或其它試劑，混勻后倒入平皿中。●半固體LB培養基：基本同上，瓊脂濃度為6克/升。高壓后室溫保存備用。使用前在水浴或微波爐溶化。常用培養基當前12頁，總共93頁。▲準備：取2-5毫升液體LB培養基，到無菌培養管中；▲挑菌：用接種環從培養板上挑取單個菌落，接種到培養基中。要先蘸取少許液體在管壁將菌落研磨開，再輕搖試管使細菌均勻分散到培養基中；▲培養：蓋上蓋子，保證通氣。37℃搖床60rpm，培養過夜;▲轉接:1:100轉種到培養瓶中，通常250ml培養瓶中加培養液不超過100ml。37℃搖床（250rpm）培養，直至細菌生長到所需密度。大腸桿菌的培養與保存大腸桿菌的液體培養當前13頁，總共93頁。將一定數量的細菌，接種于適宜的液體培養基中，在適溫下培養，定時取樣測數，以菌數的對數為縱坐標，生長時間為橫坐標，作出的曲線稱為生長曲線。該曲線表明細菌在一定的環境條件下群體生長與繁殖的規律。一般分為延緩期、對數期、穩定期、衰亡期四個時期，各時期的長短同菌種本身特征、培養基成分和培養條件不同而異。大腸桿菌生長曲線當前14頁，總共93頁。

用接種環蘸取少許細菌培養液，或從固體培養平板的菌落上蘸取少許細菌，從平板的一側開始劃線；

消毒接種環，從剛劃過的部位帶過并在旁邊繼續劃線；

如上重復3～4次，直至劃滿平板。這樣可以確保分離出單個菌落。在固體培養基上培養大腸桿菌的培養與保存當前15頁，總共93頁。■在小玻璃瓶或試管中加入三分之二體積的LB半固體培養基；■用接種針從固體培養板上挑取單個菌落，反復刺入瓊脂中；■置37℃培養8-12小時，直至可看到細菌生長呈霧狀；■擰緊蓋子，置15-22℃暗處保存。一般可保存數年；■復蘇時用接種環蘸取少許帶菌瓊脂，劃線到LB平板上。菌株的保存與復蘇穿刺保存當前16頁，總共93頁。■取新鮮飽和的或生長到對數生長中期的細菌培養液，加入滅菌的甘油至終濃度15%（或7%DMSO），混合均勻。■分裝到凍存管中，保存在-70℃。如條件所限，亦可保存在-20℃，但保存時間較短。■復蘇時，用接種環從上面刮取少許菌液，注意要避免反復凍融。然后劃線到LB平板上。菌株的保存與復蘇冷凍保存當前17頁，總共93頁。

質粒（plasmid）是染色體以外能自主復制的遺傳因子

不具有胞外期

對寄主細胞來說是非必需的質粒概述符合這三條標準的染色體外DNA或RNA分子都可以稱為質粒。狹義的質粒：一般是指細菌染色體外的環狀DNA分子。質粒的命名：一個小寫字母p加2-3個大寫字母和數字，如pBV220，pET30。當前18頁，總共93頁。

質粒DNA的構型：SC型共價閉合環形DNA（cccDNA）OC型開環DNA（ocDNA）L型線性DNA（LDNA）質粒概述LSCOC當前19頁，總共93頁。

常見質粒種類：細菌質粒真核生物DNA質粒真核生物RNA質粒質粒概述當前20頁，總共93頁。質粒概述細菌質粒定義：細菌染色體以外的共價閉合環狀DNA分子，能獨立于細胞核進行自主復制。大小：1-1700kb之間。攜帶有數個到數十個甚至上百個基因。功能：一些基因可產生毒素、抗藥性、固氮、產生酶類、降解功能等。分類：根據質粒控制的性狀，可以把細菌質粒分成抗性質粒、降解質粒、毒力質粒、共生質粒等類型。重組：在質粒之間、質粒與染色體之間均可發生存在范圍：如E.coli、Shigella、S.aureus、Streptococcuslactis等當前21頁，總共93頁。細菌質粒性質：

1、可以在細胞質中獨立于染色體之外獨立存在（游離態），也可以通過交換摻入染色體上，以附加體（episome）的形式存在；當前22頁，總共93頁。細菌質粒性質：

2、質粒是一種復制子（replicon），根據自我復制能力的不同，可把質粒復制的控制形式分為嚴緊型和松弛型兩種；嚴緊型質粒的復制受細胞核控制，與染色體DNA復制相伴隨，一般一個寄主細胞內只有少數幾個（1-5）個拷貝；松弛型質粒的復制不受細胞核控制，在染色體DNA復制停止的情況下仍可以進行復制，在細胞內的數量可以達到10-200個或更多。如果用一定的藥物處理抑制寄主蛋白質的合成，會使質粒拷貝數增至幾千份。pBR322即屬于松弛型質粒，經過氯霉素處理才能達到更高拷貝數。嚴緊型松弛型當前23頁，總共93頁。細菌質粒性質：3、可以通過轉化（直接吸收攝入）、轉導（噬菌體載體）或接合作用(通過細胞間緊密接觸而實現遺傳物質交換)由一個細胞轉移到另一個細胞，使兩個細胞都帶有質粒；質粒轉移時，可以單獨轉移，也可以攜帶著染色體（片段）一起轉移，所以可成為基因工程載體。當前24頁，總共93頁。細菌質粒性質：4、質粒的不親合性定義：在沒有選擇壓力的情況下，兩種親源關系密切的不同質粒，不能在同一寄主細胞系中穩定共存。分子基礎:主要是由于復制功能之間相互干擾造成。有相似的復制子結構，受到同一拷貝數控制系統的干擾，使兩種質粒最終拷貝數不同，拷貝數多的質粒在以后的分裂中更占優勢。ColE1、pMB1;pSC101、F、RP4；p15A,衍生質粒當前25頁，總共93頁。細菌質粒性質：

5、質粒對于細菌的生長不是必須的當前26頁，總共93頁。代表性細菌質粒（1）F因子，又稱致育因子或性因子，62×106Dalton，94.5kb，環狀雙鏈DNA，編碼94個中等大小多肽，其中1/3基因（tra區）與接合作用有關。存在于腸細菌屬、假單胞菌屬、嗜血桿菌、奈瑟氏球菌、鏈球菌等細菌中，決定性別。F質粒的整個基因組結構由三個主要區段組成：（1）轉移區（2）復制區（3）重組區，通過和宿主染色體上的IS同源重組或通過轉座，F因子可以整合到宿主不同位點上。由于宿主染色體上IS方向不同，所以整合的方向也隨之不同。F因子（fertilityfactor）當前27頁，總共93頁。根據大腸桿菌細胞內有無F質粒及其在細胞內存在狀態可將細胞分為四種類型：●F+菌株：F因子獨立存在，細胞表面有性菌毛，為帶有F質粒的雄性細胞●F-菌株：無F因子，無性菌毛，但可以通過接合作用接收F因子而變成雄性菌株（F+）。●Hfr菌株(高頻重組菌株)：F因子插入到染色體DNA上，細胞表面有性菌毛●F′菌株：F質粒從Hfr菌染色體上脫落時，會出現一定概率的錯誤，使F質粒帶上宿主染色體，這種特殊的F質粒稱為F′質粒。代表性細菌質粒（1）當前28頁，總共93頁。代表性細菌質粒（2）：R因子（resistance），抗藥因子，帶R因子的細菌有大腸桿菌、沙門氏菌、志賀氏菌、綠膿桿菌等G-菌，60-90%的G-菌耐藥性由R因子轉移。

R因子是細胞質粒，使寄主菌對鏈霉素、氯霉素、四環素等抗菌素或磺胺劑產生抗藥性的基因群。和F因子一樣，通過接合進行轉移，獲得該因子的細菌獲得對多種藥劑的抗性，給治療帶來很大麻煩。環狀dsDNA，包括抗性轉移因子和抗性決定因子，R因子在細胞內的copy數從1-2個到幾十個，分為嚴緊型和松弛型，經氯霉素處理，松弛型質粒可達2000-3000個/細胞。R因子（resistencefactor）當前29頁，總共93頁。代表性細菌質粒（3）：Col因子，產大腸桿菌素因子，編碼合成大腸桿菌素,通過抑制復制、轉錄、轉譯或能量代謝而專一性地殺死不含Col因子的其他腸道細菌。Col因子可分為兩類：ColE1：無接合作用，松弛型多copy；用于重組DNA研究和體外復制系統。ColIb：與F因子相似，通過接合作用轉移，嚴緊型控制，只有1-2個copy。Col因子（colicinogenicfactor）當前30頁，總共93頁。真核生物DNA質粒環狀DNA質粒：酵母質粒，植物線粒體中的環狀DNA質粒，人和動物的核DNA質粒等，都是不知其功能的隱蔽質粒。線狀DNA質粒：乳酸克魯維酵母的嗜殺線狀DNA質粒，植物線粒體中與雄性不育有關的線狀DNA質粒。真核生物RNA質粒有殼體的dsRNA質粒：由蛋白質殼體包裹，存在于某些真菌和植物細胞中，由于它們酷似病毒，所以也常被稱作真菌病毒和植物隱蔽病毒，或稱類病毒顆粒，典型代表是釀酒酵母的嗜殺dsRNA質粒。與RNA病毒的主要區別是它們不具有感染性．無殼體的dsRNA質粒：存在于脂質小囊中的栗疫菌減毒dsRNA質粒，玉米線粒體中與雄性不育有關的dsRNA質粒。

當前31頁，總共93頁。把目的基因通過基因工程手段送到生物細胞（受體細胞），需要運載工具攜帶外源基因進入受體細胞，這種運載工具就叫做載體（vector）。基因工程所用的vector實際上是DNA分子，攜帶目的基因片段進入受體細胞的DNA。

作為載體的質粒大多是由天然質粒經人工適當改造而成的，目前已有多種經改造的良好的質粒載體。分子生物學實驗中常用質粒載體當前32頁，總共93頁。多克隆位點是含有多個內切酶識別位點的一段DNA序列，便于外源DNA片段的插入，而且不會影響質粒本身的穩定。復制子是含有DNA復制起始位點的一段DNA序列，也包括復制必需的RNA和蛋白質的編碼基因。復制子決定質粒復制是嚴緊型還是松弛型。原核生物DNA有一個ori，真核生物DNA有多個ori。選擇標記通常為抗生素耐藥基因，如Amp+，Kan+抗性基因；或產生易于辨認的顏色，如半乳糖苷酶、熒光素酶等基因。當前33頁，總共93頁。◆按功能分成：（1）克隆載體：都有一個松弛的復制子，能帶動外源基因，在宿主細胞中復制擴增。它是用來克隆和擴增DNA片段（基因）的載體。（2）表達載體：具有克隆載體的基本元件（如ori，Ampr，Mcs等）還具有轉錄/翻譯所必需的DNA順序的載體。

在大腸桿菌生產外源蛋白的表達載體

要含有適當的原核啟動子，轉錄終止信號。

在真核細胞生產外源蛋白的表達載體

除含有適當的真核啟動子，轉錄終止信號外，還應含有內含子剪切序列和polyA加尾信號。載體分類當前34頁，總共93頁。載體分類◆按進入受體細胞類型分：（1）原核載體（2）真核載體（3）穿梭載體（shuttlevector）指在兩種宿主生物體內復制的載體分子，要含有不同系統可識別的復制起點，因而可以運載目的基因。

當前35頁，總共93頁。質粒載體的選擇◆構建重組DNA的目的：克隆擴增：選擇合適的克隆載體pGEM-T,pBluescript蛋白表達：原核細胞表達載體如pBV220,pET等；真核細胞表達載體pcDNA3,pSV2等。研究基因功能：overexpression,knockdown,knockout基因治療：逆轉錄病毒載體，腺病毒載體◆載體的類型：

（1）克隆載體的克隆能力：理想的克隆質粒本身要盡可能小，這樣轉化效率較高，同時質粒的容量較大，可以插入較大的DNA片段。（2）表達載體受體細胞類型：原核/真核/穿梭，E.coli/哺乳類細胞表達載體。

◆注意事項：

載體MCS中的酶切位點數與組成方向因載體不同而異，目的基因與載體應易于連接，不產生閱讀框架錯位。當前36頁，總共93頁。質粒載體的選擇

選用質粒做載體的4點要求：

①選分子量小的質粒，小載體不易損壞，在細菌里拷貝數多；②一般使用松弛型質粒在細菌里擴增不受約束；③必需具備一個以上的酶切位點，有選擇的余地；④必需有易檢測的標記，多是抗生素的抗性基因。當前37頁，總共93頁。常見質粒1：pBR322優點：1、具有較小的分子量；分子量為4363bp，克隆載體的分子量大小不要超過10kb。2、具有兩種抗菌素抗性基因可供作轉化子的選擇記號。有24種內切酶單一酶切識別位點

其中7種內切酶的識別位點在四環素抗性基因內部，2種識別位點在于這個基因的啟動區內，所以9個限制酶切位點插入外源片斷可以導致tetr基因的失活；另外有3種限制酶在氨芐青霉素抗性基因有單一的識別位點。3、具有較高的拷貝數，而且經過氯霉素擴增之后每個細胞中可積累1000-3000個拷貝（氯霉素抑制宿主菌蛋白質合成,阻止細胞染色體復制,而質粒本身復制不受影響,增加質粒的拷貝數）。“P”表示是一種質粒“BR”表示兩位主要構建者姓氏的頭一個字母“F.Bilivar”“322”表示實驗編號當前38頁，總共93頁。Example:在pBR322質粒的BamHⅠ或SalⅠ位點插入外源DNA片斷，切斷了tetr基因編碼序列的連續性，使之失去活性，產生出AmprTets表型的重組pBR322質粒，轉化入AmpsTets的大腸桿菌。涂布在含青霉素的選擇培養基上，可生長涂布于含四環素的選擇培養基上，不能生長。當前39頁，總共93頁。常見質粒2：pGEM-T藍白斑篩選原理：LacZ基因編碼-半乳糖苷酶，催化乳糖水解載體帶有LacZ基因的調控序列和N端146個氨基酸的編碼信息，編碼-互補肽宿主編碼的-半乳糖苷酶C端當這種載體轉入可編碼-半乳糖苷酶C端部分序列的宿主細胞中時，在異丙基--D硫代半乳糖苷（IPTG）誘導下，宿主可同時合成這兩種肽段，雖然各自都沒有酶活性，但它們可融為一體形成具有酶活性的蛋白質，稱這種現象為-互補。由α-互補產生-半乳糖苷酶可使底物X-Gal產生藍色菌落，因而易于識別。當外源DNA插入到質粒的MCS后，導致無α-互補能力的N端片段，37℃溫箱倒置培養12-16hr后，細菌形成白色菌落。-互補當前40頁，總共93頁。α互補的檢測PUC18/19由pBR322和M13噬菌體改造當前41頁，總共93頁。常用表達質粒：當前42頁，總共93頁。質粒DNA的分離與純化

1、氯化銫密度梯度離心法2、堿變性法3、微量堿變性法

當前43頁，總共93頁。1.氯化銫密度梯度離心法原理

◆質粒DNA占總DNA的1%～2%；

◆在細胞裂解及DNA分離過程中，大分子量的細菌染色體易斷裂成線性片斷，而質粒DNA分子量小，結構緊密仍保持完整的狀態；

◆染色劑溴化乙錠（EB，吖啶類染料）能摻入到DNA鏈的堿基中，使DNA體積增大，浮力密度變小。EB容易插入線狀的DNA，而與環狀質粒DNA的結合量小于線狀DNA，使浮力密度出現懸殊的差別；而且形成的EB-DNA復合物中，EB含量越高，密度會越低。當前44頁，總共93頁。離心流程

◆離心收集菌體，加入溶菌酶或SDS，促進大腸桿菌細胞裂解，離心收集含質粒DNA的上清。

◆將EB的CsCl溶液加到清亮的大腸桿菌裂解液中，EB會嵌入到DNA鏈堿基中。

◆EB達到飽和時，CsCl密度梯度離心。當前45頁，總共93頁。2.堿變性法原理：原理：cccDNA與線性染色體DNA片斷之間，拓撲學上存在差異

◆在pH12.0～12.5范圍內：

線性的DNA雙螺旋結構解開而被變性；共價閉環質粒DNA的氫鍵會被斷裂，但兩條互補鏈彼此相互盤繞，仍會緊密地結合在一起。

◆恢復pH值中性時：

共價閉合環狀的質粒DNA的兩條互補鏈仍保持在一起，因此復性迅速而準確，恢復原來構型，保持可溶性狀態。

線性染色體DNA的兩條互補鏈彼此已完全分開，復性就不迅速準確，它們相互纏繞形成不溶性網狀結構。◆通過離心，去除線性染色體DNA與不穩定的大分子RNA，蛋白質-SDS復合物等，最后用酚氯仿抽提純化上清液中的質粒DNA。當前46頁，總共93頁。當前47頁，總共93頁。挑取單個菌落接種到5ml含適當抗菌素的LB培養基中，37℃搖床培養過夜。取1.5ml菌液加入Eppendorf管中，5000rpm離心1min，棄上清，沉淀懸浮于150μl溶液Ⅰ（500mmol/L葡萄糖，25mmol/LTris-HCl，10mmol/LEDTA，pH8.0）冰浴5分鐘；此步驟菌體一定要懸浮均勻，不能有結塊，否則會降低抽提得率。

加入新配置的200μl溶液Ⅱ（0.2mol/LNaOH，1%SDS），混勻，冰浴10分鐘。這一步操作要注意兩點：第一，時間不能過長，因為在這樣的堿性條件下基因組DNA片斷會慢慢斷裂；第二，必須溫柔混合，不然基因組DNA也會斷裂。加入150μl溶液Ⅲ（3mol/L乙酸鉀，pH4.8），冰浴5分鐘；堿處理的時間要短，而且不得激烈振蕩，否則最后得到的質粒上會有大量的基因組DNA污染。

12000rpm離心3分鐘，轉移上清至新的離心管；加入等體積酚/氯仿抽提一次；轉移上層水相至新的離心管；等體積氯仿抽提一次。取上清，加入2倍體積無水乙醇，混勻，-20℃沉淀30分鐘；12000rpm離心5分鐘。70%乙醇洗滌沉淀一次；干燥后加入50μl含RNA酶（20ug/ml）的TE（10mmol/LTris-HCL，1mmol/LEDTA，pH8.0），37℃水浴30分鐘。-20℃保存備用。質粒的小量提取堿裂解法當前48頁，總共93頁。

自Qiagen公司推出快速小量提取質粒DNA試劑盒以來，很多公司都開發出類似產品，其原理及實驗步驟大同小異。具體步驟如下(天為時代)：挑取單菌落接種于5ml含適當抗菌素的LB培養基中，37℃振蕩培養過夜；取1.5ml菌液加入Eppendorf管中，13000rpm離心1min，棄上清，加入250ul

S1Buffer,最大速度旋渦震蕩；加入250ulS2Buffer，輕輕顛倒混勻4-6次；加入350ulS3Buffer，立即迅速顛倒混勻，可見白色絮狀沉淀；將上清加入純化柱中，5000rpm離心10min；棄去收集管中液體，加入500ul除蛋白液PDBuffer，13000rpm離心1min；棄去收集管中液體；加入700ulPEBuffer，13000rpm離心1min；棄去收集管中液體；加入500ulPEBuffer，13000rpm離心1min；棄去收集管中液體；13000rpm離心3min，以徹底去除乙醇；將柱子放到一只干凈的1.5mlEppendorf管中，加入50μlddH2O；靜止放置2min,13000rpm離心1min,收集離心液，-20℃保存。

質粒的小量提取堿裂解法（試劑盒）當前49頁，總共93頁。挑取單菌落接種5毫升含適當抗菌素的LB培養基中，37℃震蕩培養過夜。將培養物轉接200ml含同樣抗菌素的LB培養基中，37℃劇烈振蕩培養12-16小時，細菌密度(OD600nm)達到1.0；5000rpm離心15分鐘，棄上清；重懸細菌于100ml冰預冷STE（0.1mol/LNaCl，10mmol/LTris-HCl，1mmol/LEDTA，pH8.0）。5000rpm離心15分鐘，棄上清；加10ml溶液1（50mmol/L葡萄糖，25mmol/LTris-HCl，10mmol/LEDTA，pH8.0）重懸，混勻，冰浴10分鐘；加入20ml新配置的溶液2（0.2mol/LNaOH,1%SDS），混勻，冰浴10分鐘；加入15ml預冷的溶液3（3.0mol/LKCl，pH4.8），混勻，冰浴10分鐘；10000rpm離心15分鐘，棄沉淀；加入等體積的預冷異丙醇，混勻，-20℃沉淀1小時；10000rpm離心15分鐘，棄上清，將沉淀置室溫干燥；用3mlTE（10mmol/LTris-HCl，1mmol/LEDTA，pH8.0）溶解沉淀；加入3ml冰預冷的5mol/LLiCl溶液，充分混勻，10000rpm離心15分鐘，棄沉淀；上清中加入等體積冰預冷的異丙醇，充分混勻，10000rpm離心15分鐘，棄上清，將沉淀置室溫干燥；500μl含RNA酶（20ug/ml）TE（10mmol/LEDTA，pH8.0）溶解沉淀，轉移到Eppendorf管中，室溫放置30分鐘；加入500μl含13%聚乙二醇8000的1.6mol/LNaCl，充分混勻，-20℃沉淀2小時；于臺式離心機上12000rpm離心10分鐘，棄上清；加入400μlTE（pH8.0）溶解沉淀，用酚、酚氯仿、氯仿各抽提一次；轉移水相至新的Eppendorf管，加100μl10M乙酸銨，充分混勻；加2倍體積無水乙醇，-20℃沉淀1小時；12000rpm離心10分。用冰預冷的70%乙醇洗滌沉淀一次，晾干；50μlTE（pH8.0）溶解沉淀，儲存于-20℃冰箱。質粒的大量提取聚乙二醇沉淀法

當前50頁，總共93頁。分子克隆步驟當前51頁，總共93頁。轉化（transformation）◆重組分子導入適宜的宿主細胞的過程就是轉化。

◆宿主細胞也稱為受體細胞，分為原核細胞和真核細胞兩類。◆原核細胞以大腸桿菌為主，真核細胞包括酵母及動物細胞等。◆在基因克隆技術中，轉化特指質粒DNA或以它為載體構建的重組子導入宿主細胞的過程。通過宿主細胞的復制而使目的基因得到大量的擴增。

當前52頁，總共93頁。轉化及感受態細胞★目前常用的原核細胞轉化方法有兩類：電穿孔轉化法、化學轉化法★電穿孔轉化法屬于物理方法，但由于受到儀器的限制，實驗室更常用的是化學轉化法。★化學轉化法原理：（1）低溫（0℃）和CaCl2低滲溶液處理，使宿主細胞處于容易吸收外源DNA的狀態，即感受態。菌體膨脹成球形，細胞壁和膜通透性增強。（2）DNA與Ca2+形成的羥基-磷酸鈣復合物黏附于菌體表面，42℃短暫熱沖擊處理（熱休克）后，黏附表面的重組DNA被吸收進入宿主細胞。（3）在營養豐富的培養基上生長1小時左右，細胞形態復原，進入增殖分裂期。當前53頁，總共93頁。挑取單菌落，接種無抗菌素的LB培養基，37℃搖床培養過夜。次日按1：100轉種新鮮LB培養基，繼續搖床培養2小時左右，至菌液OD600nm值為0.4-0.6時停止培養。置冰上預冷10分鐘，然后4℃、5000rpm離心10分鐘，棄上清；以10ml冰預冷的0.1mol/LCaCl2重懸細胞，放置于冰浴中20分鐘；4℃、5000rpm離心10min，棄上清；按每50ml培養物加入2ml冰預冷的0.1mol/LCaCl2的比例重懸細胞沉淀，再加入15%體積滅菌甘油，混勻，然后分裝于Eppendorf管中，-70℃低溫冰箱中保存。感受態宿主菌的制備氯化鈣法

當前54頁，總共93頁。

1．前夜接種受體菌（DH5、DH10B），挑取單菌落于LB培養基中37℃搖床培養過夜；2．取2ml過夜培養物轉接于200mlLB培養基中，在37℃搖床上劇烈振蕩培養至OD600=0.6；3．將菌液迅速置于冰上。以下步驟務必在超凈工作臺和冰上操作；4．吸取1.5ml培養好的菌液至1.5ml離心管中，在冰上冷卻10分鐘；5．4℃下3000g冷凍離心5分鐘；6．棄去上清，加入1500l冰冷的10%甘油，用移液槍輕輕上下吸動打勻，使細胞重新懸浮；7．4℃下3000g冷凍離心5分鐘8．棄去上清，加入750l冰冷的10%甘油，用移液槍輕輕上下吸動打勻，使細胞重新懸浮；9．4℃下3000g冷凍離心5分鐘10．加入20l冰冷10%的甘油，用移液器輕輕上下吸動打勻，使細胞重新懸浮；11．立即使用或迅速置于-70oC超低溫保存。感受態宿主菌的制備電轉化法

當前55頁，總共93頁。感受態宿主菌的制備注意事項

1．細菌的生長狀態：實驗中應密切注視細菌的生長狀態和密度，盡量使用對數生長期的細胞（一般通過檢測OD600來控制。DH5菌株OD600為0.5時細胞密度是5×107/ml）；2．所有操作均應在無菌條件和冰上進行；3．經CaCl2處理的細胞，在低溫條件下，一定的時間內轉化率隨時間的推移而增加，24小時達到最高，之后轉化率再下降（這是由于總的活菌數隨時間延長而減少造成的）；4．化合物及無機離子的影響：在Ca2+的基礎上聯合其他二價金屬離子（如Mn2+或Co2+）、DMSO或還原劑等物質處理細菌，可使轉化效率大大提高（100-1000倍）；5．所使用的器皿必須干凈。去污劑或其它化學物質的存在可能大大降低細菌的轉化效率；6．質粒的大小及構型的影響：用于轉化的應主要是超螺旋的DNA；7．一定范圍內，轉化效率與外源DNA的濃度呈正比；當前56頁，總共93頁。●取100μl感受態細胞懸液(化凍后馬上進行下面的操作)，加入適量質粒DNA。●輕輕搖勻，冰上放置30min[（1）抑制細胞的旺盛生理代謝；（2）有助于DNA-Ca2+吸附于細胞表面；（3）防止DNAase降解DNA]，42℃水浴中保溫1-2min[使細胞攝入吸附于其表面的DNA]，然后迅速冰上冷卻2min。立即向管中分別加入0.4mlLB液體培養基（不需在冰上操作），使總體積到0.5ml，該溶液稱為轉化反應原液，搖勻后于37℃振蕩培養約60min，使受體菌恢復正常生長狀態。●培養液0.1ml，接種于含抗菌素LB平板培養基上，涂勻。●菌液完全被培養基吸收后，倒置培養皿，37℃恒溫培養箱內培養過夜(12-16小時)，待菌落生長良好而又未互相重疊時停止培養，對于可以藍白斑篩選的質粒和菌株來說，此時應該能清楚地看到藍色和白色菌落。轉化步驟當前57頁，總共93頁。轉化結果分析當前58頁，總共93頁。噬菌體當前59頁，總共93頁。噬菌體概述當前60頁，總共93頁。噬菌體概述噬菌體：感染細菌、真菌、放線菌或螺旋體等微生物的細菌病毒總稱結構：無尾部結構的二十面體型具尾部結構的二十面體型線狀體型核酸類型：雙鏈線性DNA雙鏈環形DNA單鏈環形DNA單鏈線形DNA雙鏈RNA單鏈RNA當前61頁，總共93頁。當前62頁，總共93頁。分子量：不同的噬菌體之間的核酸分子量的差異比較大大分子量的噬菌體生命周期比較復雜，對寄主的依賴性較低堿基組成：有些噬菌體的DNA堿基不是由標準的A/T/C/G組成的T4噬菌體DNA沒有C，取代的是5-羥甲基胞嘧啶（HMC）SP01噬菌體DNA中沒有T，取代的是5-羥甲基尿嘧啶（HMU）噬菌體概述當前63頁，總共93頁。噬菌體的一般生物特性

可脫離寄主細胞生存，但不能進行復制。除了對寄主的依賴性，還可保護自己的核苷酸分子（DNA/RNA）免遭環境化學物質的破壞當前64頁，總共93頁。λ噬菌體：基因組長尾噬菌體科，溫和噬菌體◆一般結構：48,502bp，線狀dsDNA。◆46個基因，分為四類：調控基因：CⅢ、N、CI、Cro、CⅡ，決定進入溶源化或裂解狀態DNA復制：O、P、Qλ重組：int、xis、redβ和gam噬菌體顆粒形成與細胞裂解：頭(A-F)、尾(E-J)、S&R（細胞裂解）、λ中部約1/3的DNA(b2)與λ存活無關。當前65頁，總共93頁。

線狀ds-DNA兩端具有12nt5’-突起，稱為cos位點，被λ編碼的末端酶所識別，通過粘性末端的互補作用形成雙鏈環形DNA。當前66頁，總共93頁。DNAProteincoatcoscosNonessentialregionLong(left)armshort(right)armExogenousDNA(~20-23kb)λphage12bp當前67頁，總共93頁。

溶菌階段(復制和釋放)λ噬菌體溶源階段溶源性（lysogeny）：λ噬菌體在大腸桿菌體內可以呈環行分子存在于細胞質中，也可通過整合酶的作用而整合到寄主染色體上成為原噬菌體狀態，并與寄主染色體一起復制并隨細菌的分裂而傳代，這種現象稱為λ噬菌體的溶源性。只有雙鏈DNA的噬菌體才具有溶源周期。在某種刺激下會從宿主DNA中剪接出來，利用宿主細胞內的酶系和蛋白進行自我復制，產生許多子代噬菌體，裂解并從宿主細胞中釋放的過程稱裂解性循環。當前68頁，總共93頁。

λ噬菌體載體的構建構建λ噬菌體載體的基本原理：野生型λ噬菌體不適于做載體：（1）λ噬菌體基因組大，有多個常用的核酸內切酶的識別位點。（2）λ噬菌體有包裝限制，λ頭部只能容納自身DNA的78-105%，即39-52.5Kb的DNA分子，天然λ僅可插入3Kb外源DNA。對野生型λ噬菌體的改造：（1）除去λ噬菌體DNA中的限制性識別位點，在非必須區引入合適的限制酶位點。（2）除去λ噬菌體DNA的非必須區段。（3）引入適當的選擇性標記。當前69頁，總共93頁。λ噬菌體載體Lyticphase(Replicateandrelease)Lysogenic

phase(integrateintohostgenome)當前70頁，總共93頁。●λ噬菌體載體的優點：◆λ噬菌體DNA體外重組后，先要在體外包裝成噬菌體顆粒，然后以噬菌體感染的方式將重組DNA導入細胞內。感染方式導入細胞的頻率可達106-108/μgDNA，轉染方式導入的頻率僅為103-105/μgDNA。◆裝載外源能力為25kb，大于質粒◆篩選方便◆重組λ-DNA分子提取容易●

用途克隆載體；構建基因組或cDNA文庫；構建抗體庫或隨機肽庫λ噬菌體載體當前71頁，總共93頁。

λ噬菌體載體的主要類型

1.插入式載體一種只具有一個可供外源DNA插入的克隆位點，克隆容量較小，一般在10kb以內，用于cDNA及小片段DNA的克隆。

2.替換型載體（取代型載體）具有成對的克隆位點，在這兩個位點之間的λDNA區段可以被外源插入的DNA片段所取代。克隆容量較大，一般在20kb左右，常用于構建高等真核生物的基因組文庫。當前72頁，總共93頁。插入式載體

cI基因插入失活：如λgt10、λNM1149等載體，在cI基因上有EcoRI及HindIII的酶切位點。外源基因插入后將導致cI基因的失活。

若不插入外源基因溶源混濁斑若CI插入外源基因溶菌透明噬斑

cIEcoR

I

LA32.7RA10.6

λgt10當前73頁，總共93頁。

lacZLA19.9RA21.9EcoRI

Charon

16A插入式載體LacZ基因插入失活：charon16A載體，非必須區段引入lacZ基因，在lacZ基因上有EcoRI位點，插入失活后利用X-gal法篩選（蘭白篩選）。

當前74頁，總共93頁。外源DNA取代噬菌體中對于噬菌體感染和復制非必要的片段(小于20kb)高感染效率(109轉化株/ug載體DNA,比質粒高100倍)替換型載體（取代型載體）當前75頁，總共93頁。替換型載體克隆外源DNA的步驟1.應用適當的核酸內切酶消化λ載體，除去可取代的DNA片段；2.將上述所得的λDNA載體臂同外源DNA片段的連接；3.對重組體的λDNA分子進行包裝和增殖，以得到有感染性的λ重組噬菌體當前76頁，總共93頁。λ噬菌體的空斑試驗培養基λ肉湯培養基：每升含胰蛋白胨10克，氯化鈉2.5克，高壓滅菌15磅30分鐘；λ肉湯平板：基本同上，每升加瓊脂10克；λ頂層培養基：基本同上，每升加瓊脂7克。高壓后室溫保存備用。使用前在水浴或微波爐溶化，然后冷卻至45-50℃，并維持在該溫度，可保持溶化狀態。當前77頁，總共93頁。λ噬菌體的空斑試驗步驟1、在含2%麥芽糖和10mmol/L硫酸鎂的λ肉湯培養基中培養大腸桿菌至飽和。在微波爐或沸水浴中溶化頂層瓊脂培養基，冷卻并維持在45-50℃水浴。2、取5個小試管，每管加入0.3毫升大腸桿菌培養液。將噬菌體溶菌液在λ肉湯培養基中1：1000連續稀釋，然后每個稀釋度取0.1毫升分別加到含0.3毫升大腸桿菌的試管中，與大腸桿菌培養液混勻，在室溫孵育20分鐘。3、將上述試管移到37℃水浴中保溫10分鐘。4、每管中加入2.5毫升頂層培養基，輕搖混合，然后小心地倒在λ肉湯平板上。輕輕地傾斜平板使頂層瓊脂均勻地鋪到整個平板。整個過程要避免產生氣泡。5、置37℃孵箱培養。一般6-8小時即可看到噬斑，12小時后即可清楚地計數和挑選噬斑。當前78頁，總共93頁。λ噬菌體的空斑試驗制備噬菌體裂解液1、可用毛細吸管或牙簽從上述噬菌體平板上挑取單個噬斑，置0.4毫升λ肉湯培養基中，放振蕩器上劇烈振蕩以釋放出噬菌體；2、取0.1毫升噬菌體，與0.1毫升過夜培養的大腸桿菌培養液和0.1毫升鈣鎂溶液（10mmol/LMgCl2,10mmol/LCaCl2）混合，置37℃水浴孵育15分鐘。然后轉移到50毫升NZC肉湯培養基（每升含NZ胺A10克，氯化鈉5克，MgCl2.6H2O2克），置37℃搖床培養。一般6-8小時會出現裂解，一旦培養液變清亮，就立即收獲。3、加幾滴氯仿裂解仍存在的菌體。將裂解液轉移到離心管內，于4℃離心10,000r/min(12000g)10分鐘以去除細胞碎片。將上清轉移到干凈管中，加幾滴氯仿，混勻后放4℃保存。當前79頁，總共93頁。λ噬菌體的空斑試驗提取噬菌體DNA酚/氯仿抽提1、加等體積的飽和酚至噬菌體液中，溫和地攪拌或振搖20分鐘。離心5000r/min10分鐘。將上清移到新的管中，再加等體積飽和酚混合。共抽提三次。2、加入1/10體積的5mol/LNaCl，2倍體積的無水乙醇（或0.6體積的異丙醇），室溫放置20分鐘。3、離心1,500g15分鐘，棄上清。將沉淀用70%乙醇洗1-2次。低溫干燥。4、重溶于TE緩沖液中。甲酰胺抽提（更快捷溫和）1、加1/10體積的2mol/LTris.Cl(pH8.5)/0.2mol/LEDTA,混勻后加入等體積的甲酰胺，混勻，室溫放置30分鐘。2、加兩倍體積的無水乙醇。室溫放置20分鐘。3、離心1,500g15分鐘，棄上清。將沉淀用70%乙醇洗1-2次。低溫干燥。4、重溶于TE緩沖液中。當前80頁，總共93頁。M13噬菌體

M13是一種含ssDNA的絲狀噬菌體，感染含F因子的大腸桿菌。感染宿主后不裂解細菌細胞，只利用細胞內物質完成自身增殖，組裝成完整病毒顆粒后被宿主細胞分泌而出，宿主細胞仍能繼續生長分裂。為分子生物學中理想的質粒載體。

當前81頁，總共93頁。M13噬菌體基因組為6.4kb，90%以上序列編碼蛋白質，11個編碼基因，基因之間間隔區多為幾個堿基。較大間隔位于基因Ⅷ和Ⅲ以及基因Ⅱ和Ⅳ之間，有調節基因表達和DNA合成的元件。DNA為正鏈，按基因Ⅱ至Ⅳ方向合成。編碼3類蛋白質:復制蛋白（Ⅱ、Ⅴ、Ⅹ）形態發生蛋白（Ⅰ，Ⅳ、Ⅺ）結構蛋白（Ⅲ、Ⅵ、Ⅶ、Ⅷ、Ⅸ）當前82頁，總共93頁。M13單鏈DNA噬菌體的生命周期成熟的噬菌體顆粒僅能感染E.coli的F+細胞，因為這種噬菌體的感染位點在性散毛上。但是無論是RFDNA或ssDNA都能轉染E.coli的F+或F-細胞。M13噬菌體特點（1）當前83頁，總共93頁。RF

DNA感染Ecoli后，在宿主細胞內會形成雙鏈復制型ＤＮＡ，可以象質粒ＤＮＡ那樣在體外進行純化和操作。M13噬菌體特點（2）當前84頁，總共93頁。M13噬菌體特點（3）單鏈DNA噬菌體顆粒的大小，是受其DNA的制約的，不存在包裝限制問題，能包裝6倍基因組長的DNA分子，這一點正好與λ噬菌體相反。當前85頁，總共93頁。以M13噬菌體構建出一系列含有單鏈噬菌體（M13）復制起點的質粒載體

優點

1、LacZ片段，密