第3章

發酵原料中粗蛋白質的測定

發酵原料中粗蛋白質的測定教學重點:掌握方法的原理、測定步驟；掌握消化．蒸餾、滴定操作技術;學會使用凱氏定氮儀.教學難點:消化．蒸餾、滴定操作技術及測定過程的注意事項。CompanyLogo發酵原料中粗蛋白質的測定一、目的和意義食物中蛋白質含量是了解人體蛋白質攝入量的基礎資料。蛋白質含量的高低對產品質量影響重大，是評價原料及成品質量的重要指標之一。CompanyLogo發酵原料中粗蛋白質的測定一類：利用蛋白質的共性即含氮量、肽鍵和折射率等測定蛋白質含量；蛋白質的測定方法另一類：利用蛋白質中的氨基酸殘基、酸性和堿性基因以及芳香基團等測定蛋白質含量。CompanyLogo5.紅外檢測儀4.酚試劑法2.雙縮脲分光光度比色法凱氏定氮法蛋白質的測定方法3.染料結合分光光度比色法CompanyLogo發酵原料中粗蛋白質的測定一般食品蛋白質含氮量為10％左右，動植物原料中蛋白質的含氮量一般為15%~17.6%，有的上下浮動,可以測出總氮：蛋白質含量=N/16%=N×6.25肉、蛋、豌豆、玉米等，其換算系數為6.25，小麥取5.70，大米5.95、乳制品6.38、大豆5.17，動物膠5.55。含有的元素：C、H、O、NCompanyLogo加堿NaOH蒸餾，使NH3游離樣品與濃硫酸和催化劑共熱消化，使蛋白質分解有機氮轉化為NH3，并與H2SO4結合成（NH4)2SO4；再用標準鹽酸接s收，過量酸用標準NaOH滴定。或者用硼酸吸收形成硼酸銨，再以標準鹽酸滴定，根據標準鹽酸消耗量可計算出粗蛋白質的含量。常量凱氏定氮法消化蒸餾滴定一、原理CompanyLogo（1）濃H2S04使試樣中的有機物脫水炭化、氧化。濃H2S04在338℃分解產生氧氣、破壞有機物，生成CO2和

H2O2。

2H2S04=2S02+2H2O+O2C+O2=CO2

2H2+O2=2H2O蛋白質

RCH（NH2）COOH

NH3+CO2+SO2+H2O2NH3+H2S04

（過量）

（

NH4）2S04在消化過程中，反應生成的（NH4）2S04留在溶液中，其他的產物CO2、SO2及H2O都揮發逸出。濃H2S04濃H2S04常量凱氏定氮法CompanyLogo（2）CuSO4作為催化劑，加快反應速度。

2CuSO4=Cu2SO4+SO2+2[O]2CuSO4+C=Cu2SO4+SO2+2CO2Cu2SO4+2H2S04=2CuSO4+2H2O+SO2此反應反復循環地進行，反應中產生的新生態氧使有機物加快降解。（3）K2SO4使反應液沸點提高，可達400℃。

K2SO4+H2SO4=2KHSO42KHSO4=K2SO4+SO3+H2O（4）H2O2可加速有機物分解。

H2O2+2H+=2H2OE0=1.77VO2+4H+=2H2OE0=10299V常量凱氏定氮法CompanyLogo（5）30%NaOH溶液使消化液中的NH3通過蒸餾游離出來。（NH4）S04+2NaOH=Na2SO4+2H2O+2NH3蒸餾出來的NH3被H3BO3吸收：

2NH3+4H3BO3=（NH4）B4O7+5H2O(6)生成的（NH4）B4O7用HCl滴定：（NH4）B4O7+2HCl+5H2O=2NH4Cl+4H3BO3試樣中的總氮（粗蛋白）=蛋白質中的氮+氨基酸、酰胺、核酸等中的氮常量凱氏定氮法CompanyLogo二、試劑與器材1、消化液：H2O2：H2S04：H2O=3：2：12、粉末硫酸鉀―硫酸銅混合物

K2S04與CuS04.5H20以3：1混合3、30％氫氧化鈉溶液4、2％硼酸溶液5、標準鹽酸溶液(約0.01mol／L)6、混合指示劑(田氏指示劑)

由50mL0.1％甲烯藍乙醇溶液與200mL0.1％甲基紅乙醇溶液混合配成，棕色瓶貯存。酸性時為紫紅色，堿性時為綠色。變色范圍很窄且靈敏。7、待測樣品1.凱氏燒瓶2.凱氏定氮儀3.分析天平4.酸式滴定管5.烘箱6.消化爐7.容量瓶等等CompanyLogo三、操作方法結果計算滴定接收蒸餾消化CompanyLogo三、操作方法1.消化前樣品處理

固體樣品105℃烘干至恒重。若樣品為液體(如血清等)，可取一定體積樣品直接消化測定。？CompanyLogo2、消化取凱氏燒瓶標號。各加幾顆玻璃珠;1及2號瓶中各加樣品0.1g，催化劑200mg，消化液5mL。3及4號瓶中各加相同量的催化劑和消化液-----對照，以測定試劑中可能含有的微量含氮物質。

1、加樣時應直接送人瓶底，不要沾在瓶口和瓶頸上。2、火力控制，先小后大。3、消化完全。注意事項CompanyLogo（2）蒸餾

3、蒸餾吸收CompanyLogo

3、蒸餾吸收特點：將蒸汽發生器、蒸餾器和冷凝器組成一個整體，體積小，安裝容易，操作簡便。

1)水蒸汽發生器和反應室2)冷凝器和通氣室3)排水柱關鍵：搞清水管系統CompanyLogo3、蒸餾吸收1、消化液加蒸餾水稀釋后,應及時蒸餾,2、蒸餾時，加入氫氧化鈉要過量，溶液應呈褐色,若是呈藍色,則說明堿不夠.

并且動作還要迅速以防止氨的流失3、蒸氣發生瓶內的水裝至三分之二體積并且保持酸性以防止在堿性條件水中游離氨蒸出,使結果偏大。4、蒸餾時蒸氣要發生均勻,充足,蒸餾中不得停火斷氣,否則會發生倒吸。5、停止蒸餾時防止倒吸,應先將冷凝管下端提高液面并清洗管口,再蒸1min后關掉熱源。6、蒸餾是否完全,可用精密pH試紙測冷凝管口的冷凝液來測定,中性則說明已蒸餾完全。注意事項CompanyLogo4、滴定全部蒸餾完畢后，用標準鹽酸溶液滴定各錐形瓶中收集的氨量，硼酸指示劑溶液由綠變淡紫色為滴定終點。使用前檢查酸式滴定管漏不漏？漏的話，涂凡士林。滴定時一邊滴一邊搖，防止滴定過頭！及時記錄讀數要求：空白液1次，樣品消化液2次注意事項CompanyLogo5、計算總氮量(％)

=c為標準鹽酸溶液摩爾濃度(0.0098M)；V1為滴定樣品消化液用去的鹽酸溶液平均mL數；V2為滴定空白液用去的鹽酸溶液mL數；w為樣品重量(1g)。14為氮的相對量子質量。

消化液總量500ml,蒸餾時消化液用量3ml樣品蛋