磁珠柱提取法抽提病毒RNA操作細(xì)則（上海之江）文件編號(hào)：CXCDC/03-WS-PCR322010年8月第1版第1次修訂第3頁(yè)，共3頁(yè)磁珠柱提取法抽提病毒RNA操作細(xì)則（上海之江，ME-0010）1目的對(duì)磁珠柱提取病毒RNA方法進(jìn)行必要的補(bǔ)充和說(shuō)明。2范圍適用于PCR實(shí)驗(yàn)室磁珠法提取病毒RNA試劑盒，上海之江。3責(zé)任人實(shí)驗(yàn)室工作人員。4樣品收集和準(zhǔn)備4.1樣本的采集應(yīng)符合相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定要求。4.2血清、血漿、含漱液、胸水、腹水、腦脊液、皰疹液、尿液等標(biāo)本可直接進(jìn)行RNA抽提。4.3鼻拭子、咽拭子等標(biāo)本經(jīng)充分振蕩后可直接進(jìn)行RNA抽提。4.4標(biāo)本中應(yīng)無(wú)核酸降解酶源，樣本在2～8℃可保存2d，長(zhǎng)期保存應(yīng)放置-70℃以下。5實(shí)驗(yàn)設(shè)備和材料5.1設(shè)備和耗材5.1.1一次性防護(hù)用品，要求參照生物安全二級(jí)防護(hù)措施；5.1.25.1.35.1.4多規(guī)格Eppendorf微量移液器，覆蓋1uL～1000uL全量程；5.1.5高速冷凍離心機(jī)；5.1.6混勻儀；5.1.7恒溫振蕩型金屬浴；5.1.8一次性帶濾芯盒裝滅菌吸頭（PCR潔凈級(jí)），各規(guī)格若干；5.1.91.5mL離心管(耐沸騰)，2mL圓底管，親和柱（試劑盒提供）。5.2試劑和材料5.2.1磁珠柱提取法RNA抽提試劑盒（上海之江，ME-0010）。5.2.2流感病毒培養(yǎng)物（甲1、甲3、乙型、H5流感毒株各200μL）。5.2.3手足口病毒培養(yǎng)物（EV71型、CoxA16型病毒株各200μL）。5.2.4無(wú)水乙醇：事先應(yīng)按要求加入到洗滌液W試劑瓶中，并顛倒混勻。5.2.5其它試劑：二巰基乙醇（β-2ME）、75％乙醇：－20℃保存；RNase的去離子水。5.2.675%酒精或10%次氯酸鈉溶液：現(xiàn)配。5.3試劑準(zhǔn)備工作5.3.1在RNA助沉劑（CarrierRNA）中加入350μL洗脫液（ElutionSolution）,制成1μg/μLCarrierRNA-ElutionSolution溶液；分裝，-20℃儲(chǔ)存，可反復(fù)凍融3次。5.3.2在洗滌液W（WashSolutionW）加42mL無(wú)水乙醇，混勻；擰緊瓶蓋，以防止乙醇揮發(fā)，并在瓶上做好標(biāo)記。5.3.3配制結(jié)合液：將RNA助沉劑（CarrierRNA）、磁珠加入至結(jié)合緩沖液（BindingBuffer），按下表濃度配制。混勻成制成Buffer-CarrierRNA溶液，即為結(jié)合液。步驟如下：結(jié)合液組成（每人份）1.結(jié)合緩沖液（BindingBuffer）500μL2.RNA助沉劑（CarrierRNA）6μL3.磁珠（使用前震蕩混勻）20μL5.3.4根據(jù)樣本數(shù)計(jì)算每個(gè)樣本結(jié)合液體需要量。n為實(shí)際樣本數(shù)，包括陰性對(duì)照、陽(yáng)性對(duì)照和待檢標(biāo)本。則結(jié)合液總需要量=n×500μL結(jié)合緩沖液+n×6μLRNA助沉劑+n×20μL磁珠。取潔凈試管一支，加入上述需要量制成結(jié)合液總量，顛倒混懸10次，不可渦旋震蕩，以防起泡沫。5.4RNA抽提操作步驟5.4.1吸取526μL結(jié)合液于1.5mLEP管中。5.4.2每個(gè)EP管加入140μL樣本（包括陰性、陽(yáng)性對(duì)照）；用手顛倒5-10次，于室溫放置3min以上。5.4.3吸取以上混勻靜置體系666μL與親和柱中，13,000rpm離心40s；棄去收集管。5.4.4取新的2mL收集管套在柱子下面，在柱子中加入500μL洗滌液A（WashSolutionA），13,000rpm離心40秒；棄去液體，不更換收集管。再重復(fù)洗一次。5.4.5在柱子中加入500μL洗滌液A，13000rpm離心40秒，棄去離心液及收集管。5.4.5取新的2mL收集管套在柱子下面，在柱子中加入洗滌液W（WashSolutionW），13,000rpm離心15秒，棄去液體，不更換收集管。5.4.6在柱子中再加入500μL洗滌液W，13000rpm離心15秒，棄去液體及收集管。5.4.7準(zhǔn)備新的2mL收集管，置親和柱下面，13000rpm離心2分鐘，棄去離心液及收集管。（目的是把殘留的RPE盡量離掉）5.4.8取新的無(wú)RNAnase的1.5mL離心管置柱子下面，加入50μL65℃預(yù)熱洗脫液（ElutionSolution），于柱子中膜的中央，室溫放置2min。13000rpm離心2分鐘，棄去親和柱，EP中即為RNA。5.4.9將提取的病毒RNA置于－70℃保存?zhèn)溆茫蛄⒓催M(jìn)行熒光PCR檢測(cè)。6注意事項(xiàng)6.1實(shí)驗(yàn)前請(qǐng)仔細(xì)閱讀本試劑盒說(shuō)明書(shū)，嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)執(zhí)行操作。6.2實(shí)驗(yàn)前的準(zhǔn)備：洗滌液W試劑瓶中應(yīng)事先按標(biāo)簽上的要求加入無(wú)水乙醇，并顛倒混勻。保存時(shí)注意將瓶蓋擰緊，以防止乙醇揮發(fā)。6.3陰性對(duì)照：核酸提取時(shí)以滅菌雙蒸水或無(wú)RNAnase的去離子水代替標(biāo)本，每次實(shí)驗(yàn)應(yīng)設(shè)立。6.4磁珠在使用前需在旋渦振蕩器上充分混勻。如使用工作站提取，磁珠吸取需在振蕩器上進(jìn)行，或每次吸取前進(jìn)行吹打。且一次吸取的磁珠必須一次放掉，不可對(duì)