課題３分解纖維素的微生物的分離（一）纖維素與纖維素酶1、纖維素

纖維素是一種由葡萄糖首尾相連而成的高分子化合物，是含量最豐富的多糖類物質。一、基礎知識植物的根、莖、葉等器官都含有大量的纖維素。其中棉花是自然界中纖維素含量最高的天然產物。土壤中某些微生物能夠產生纖維素酶,把纖維素分解為葡萄糖，后再利用。纖維素是地球上含量最豐富的多糖類物質，植物每年產生的纖維素超過70億噸，其中40%-60%能被土壤中能產生纖維素酶的微生物所利用，不會大量積累。

在草食性動物等的消化道內，也共生有分解纖維素的微生物，其原理也是產生纖維素酶而分解纖維素，而人沒有分解纖維素的能力。

人類可應用分解纖維素的微生物將秸稈等廢棄物轉變成酒精，用纖維素酶處理服裝面料等。2、纖維素酶

纖維素酶是一種復合酶，一般認為它至少包括三種組分，即C1酶(外切酶)、CX酶(內切酶)和葡萄糖苷酶，前兩種酶使纖維素分解成纖維二糖，第三種酶將纖維二糖分解成葡萄糖。纖維二糖C1酶、Cx酶葡萄糖苷酶葡萄糖纖維素①取二支20mL的試管②各加入一張濾紙條③各加入pH4.8，物質量為0.1mol/L的醋酸－醋酸鈉緩沖液11ml和10ml④在乙試管中加入1mL纖維素酶⑤兩支試管固定在錐形瓶中，放在140r/min的搖床上振蕩1h⑥結果：乙試管的濾紙條消失實驗：纖維素酶分解纖維素的實驗甲乙

討論：乙試管的濾紙條為什么會消失？甲試管的作用是什么？本實驗的自變量是纖維素酶的有無。自變量的操縱方法是：在一支試管中添加適量（1mL）的纖維素酶溶液，在另一支試管不添加纖維素酶，但需加入等量的緩沖液，不能加入蒸餾水，否則會影響溶液的pH。實驗分析：P27的小實驗是如何構成對照的？剛果紅染色法原理：剛果紅能與纖維素形成紅色復合物，而不與水解后的纖維二糖和葡萄糖發生這種反應。

當我們在含有纖維素的培養基中加入剛果紅時，剛果紅能與培養基中的纖維素形成紅色復合物。當纖維素被纖維素酶分解后，剛果紅-纖維素的復合物就無法形成，培養基中就會出現以纖維素分解菌為中心的透明圈，這樣我們就可以通過是否產生透明圈來篩選纖維素分解菌。（二）纖維素分解菌的篩選哪種纖維素分解菌分解纖維素的能力最強？二、實驗設計

請你根據實驗流程圖和提供的三個資料以及“操作提示”，在思考有關問題的基礎上，設計出一個詳細的實驗方案。土壤取樣選擇培養梯度稀釋將樣品涂布在鑒別纖維素分解菌的培養基上篩選產生透明圈的菌落操作步驟1、土壤取樣：①分布環境：富含纖維素的環境中②原因

生物與環境的互相依存關系，在富含纖維素的環境中纖維素分解菌的含量相對提高，因此從這種土壤中獲得目的微生物的幾率要高于普通環境。③實例：樹林中多年落葉形成的腐殖土，多年積累的枯枝敗葉等。④討論:如果找不到合適的環境，可以將濾紙埋在土壤中，將濾紙埋在土壤中有什么作用？你認為濾紙應該埋在土壤中多深？

將濾紙埋在土壤中能使纖維素分解菌相對集中，實際上是人工設置纖維素分解菌生存的適宜環境。一般應將濾紙埋于深約10cm左右的土壤中。2、選擇培養

①目的：

增加纖維素分解菌的濃度，以確保能夠從樣品中分離所需要的微生物。②制備選擇培養基：③操作：

將土樣加入裝有30ml選擇培養基的錐形瓶中，將錐形瓶固定在搖床上，在一定溫度下震蕩培養1～2天，直至培養液變渾濁。也可重復選擇培養。

培養基成分分析培養基組成提供主要的營養物質纖維素粉5g碳源（能源）NaNO31g氮源、無機鹽KCl0.5gNa2HPO4·7H2O1.2gKH2PO40.9gMgSO4·7H2O0.5g無機鹽酵母膏0.5g生長因子、碳源、氮源水解酪素0.5g氮素、生長因子溶解后，蒸餾水定容至1000mL水P29：回答下列問題1、旁欄中的配方是液體培養基還是固體培養基？為什么？

是液體培養基，原因是配方中無凝固劑（瓊脂）。2、這個培養基對微生物是否具有選擇作用？如果具有，是如何進行選擇的？有選擇作用，本配方中纖維素作為主要碳源，只有能分解纖維素的微生物可以大量繁殖。3、你能否設計一個對照實驗，說明選擇培養基的作用？自變量為培養基的種類，即普通培養基和選擇培養基。可用牛肉膏蛋白胨培養基與之對照，或者將纖維素改為葡萄糖。

說明：分析“纖維素分解菌的選擇培養基配方”可知，該配方中的酵母膏也能夠提供少量的碳源，因此其他微生物也能在該培養基中生長繁殖。只不過，由于酵母膏的含量極少，因此，只有以纖維素為碳源的微生物才能大量繁殖。P29旁欄思考題：為什么選擇培養能夠“濃縮”所需的微生物？在選擇培養的條件下，可以使那些能夠適應這種營養條件的微生物得到迅速繁殖，而那些不適應這種營養條件的微生物的繁殖被抑制，因此可以起到“濃縮”的作用。比較項目分解尿素的細菌纖維素分解菌選擇培養基原理培養基類型目的鑒定培養基原理現象方法將細菌涂布在只有尿素做氮源的選擇培養基上將細菌涂布在只有纖維素粉做碳源的選擇培養基上固體培養基液體培養基篩選菌株選擇培養纖維素分解菌與分解尿素的細菌選擇和鑒定知識的比較思考：本實驗的流程與課題2中的實驗流程有哪些異同？

本實驗流程與課題2的流程的區別如下：課題2是將土樣制成的菌懸液直接涂布在以尿素為唯一氮源的選擇性培養基上，直接分離得到菌落。本課題通過選擇培養，使纖維素分解菌得到增殖后，再將菌液涂布在選擇培養基上。其他步驟基本一致。按照課題1的稀釋操作方法，將選擇培養后的培養基進行等比稀釋101～107倍。3、梯度稀釋1011021031041051064、將樣品涂布到鑒別纖維素分解菌的培養基上（1）制備鑒別培養基

鑒別纖維素分解菌的培養基（2）涂布平板：將稀釋度為104～106的菌懸液各取0.1ml涂布到平板培養基上，30℃倒置培養。培養基組成提供的主要營養物質CMC-Na5~10g碳源酵母膏1g碳源、氮源、生長因子KH2PO40.25g無機鹽土豆汁100mL碳源、生長因子瓊脂15g凝固劑上述物質溶解后，加蒸餾水定容至1000mL氫元素、氧元素

5、剛果紅染色法挑選產生透明圈的菌落，一般即為分解纖維素的菌落。方法一：先

，再加入剛果紅進行顏色反應。方法二：在

時就加入剛果紅。倒平板培養微生物思考：方法一中NaCl溶液的作用？

漂洗作用，洗去與纖維素結合不牢的剛果紅，以免出現的透明圈不夠清晰。用這方法可以判斷酶活力的大小，實際上剛果紅是結合到培養基的多糖底物，但分解纖維素的細菌可以產生纖維素酶，能分解這個多糖底物成為單糖，這樣剛果紅就不能結合上去了，氯化鈉溶液就可以使結合不牢的剛果紅洗去，這樣就留下大大小小的透明圈，大的透明圈當然分解纖維素的能就強！這兩種染色方法各有哪些優點與不足？（見優化方案P23要點一）染色法優點缺點方法一：先培養微生物，再加入剛果紅方法二：倒平板時加入剛果紅顏色反應基本上是纖維素分解菌的作用操作繁瑣，剛果紅會使菌落之間發生混雜操作簡便，不存在菌落混雜問題1、產生淀粉酶的微生物也產生模糊透明圈2、有些微生物能降解色素，形成明顯的透明圈。比較項目分解尿素的細菌纖維素分解菌選擇培養基原理培養基類型目的鑒定培養基原理現象方法將細菌涂布在只有尿素做氮源的選擇培養基上將細菌涂布在只有纖維素粉做碳源的選擇培養基上固體培養基液體培養基篩選菌株選擇培養纖維素分解菌與分解尿素的細菌選擇和鑒定知識的比較在細菌分解尿素的化學反應中，細菌合成的脲酶將尿素分解成了氨，氨會使培養基的堿性增強，pH升高。在培養基中加入酚紅指示劑，如果pH升高指示劑會變紅。剛果紅可以與纖維素形成紅色復合物，當纖維素被纖維素酶催化分解后紅色復合物無法形成，培養基上就會出現以纖維素分解菌為中心的透明圈。觀察菌落周圍是否有著色的環帶出現來鑒定尿素分解菌觀察菌落周圍是否出現透明圈來篩選纖維素分解菌脲酶檢測法剛果紅染色法

在產生明顯的透明圈的菌落，挑取并接種到纖維素分解菌的選擇培養基上，在300C－370C培養，可獲得純化培養。6、純化培養四、結果分析與評價1、培養基的制作是否合格以及選擇培養基是否篩選出菌落。

對照的培養基在培養過程中沒有菌落生長則說明培養基制作合格。如果觀察到產生透明圈的菌落，則說明可能獲得了分解纖維素的微生物。2、分離的結果是否一致。

由于在土壤中細菌的數量遠遠高于真菌和放線菌的數量，因此最容易分離得到的是細菌。但由于所取土樣的環境不同，不同同學也可能得到真菌和放線菌等不同的分離結果。

為了確定分離得到的是纖維素分解菌，還需要進行_______________實驗，纖維素酶的發酵方法有______發酵和______發酵。纖維素酶測定方法是對纖維素酶分解濾紙等纖維素所產生的________含量進行定量測定。發酵產纖維素酶

液體

固體

葡萄糖

五、課題延伸分解纖維素的微生物的分離纖維素酶種類、作用、催化活力剛果紅染色篩選原理實驗設計土壤取樣選擇培養涂布培養梯度稀釋前置染色法后置染色法富含纖維