實驗六葉綠體的分離與熒光觀察授課人：齊云峰實驗?zāi)康?、通過植物細(xì)胞葉綠體的分離,了解細(xì)胞器分離的一般原理和方法。2、觀察葉綠體的自發(fā)熒光和次生熒光,并熟悉熒光顯微鏡的使用方法。實驗原理細(xì)胞器分離過程包括兩個階段：破碎細(xì)胞和細(xì)胞組分的分離在等滲溶液中進(jìn)行組織勻漿、分離

葉綠體的分離在等滲溶液（0.35mol/L氯化鈉或0.4mol/L蔗糖溶液）中進(jìn)行葉綠體的分離采用差速離心或密度梯度離心利用熒光顯微鏡觀察葉綠體的自發(fā)熒光和間接熒光（次生熒光）常用的細(xì)胞破碎方法離心分離技術(shù)離心是分離細(xì)胞組分和生物大分子最常用的分離方法不同的細(xì)胞器和分子有不同的體積和密度，可在不同離心力、不同介質(zhì)中沉降分離。分離各種細(xì)胞組分的方法主要有：差速離心密度梯度離心速率-區(qū)帶梯度離心等密度離心差速離心采用逐漸提高離心速度或低速和高速交替進(jìn)行離心，使各種沉降系數(shù)不同的顆粒在不同的離心速度及不同的離心時間下分批分離的方法。操作過程中一般是起始離心速度較低，讓沉降系數(shù)較大的顆粒沉降到管底，小的顆粒仍懸浮在上清中。收集上清，改用較高轉(zhuǎn)速離心，將較小顆粒沉淀。以此類推，達(dá)到分離不同大小顆粒的目的。方法較簡單，但分辨率不高。沉降系數(shù)在同一個數(shù)量級內(nèi)的各種粒子不容易分開。密度梯度離心用一定的介質(zhì)在離心管內(nèi)形成一連續(xù)或不連續(xù)的密度梯度，將細(xì)胞勻漿液混懸或置于介質(zhì)的頂部，通過重力或離心力場的作用使細(xì)胞器分層、分離的方法。分為速率-區(qū)帶梯度離心和等密度梯度離心。一次離心可分離提純樣品中幾種組分，用于較精細(xì)的分離。兩種密度梯度離心方法的異同差速離心與密度梯度離心的區(qū)別差速離心是用不同強度的離心力使具有不同質(zhì)量的物質(zhì)分級分離；密度梯度離心中單一樣品組分的分離是借助于混合樣品穿過梯度層的沉降或上浮來達(dá)到的；差速離心要用兩個甚至更多的轉(zhuǎn)速，而密度梯度離心只有一個離心轉(zhuǎn)速；差速離心適用于分離混合樣品中各沉降系數(shù)差別較大的組分，而密度梯度離心可分離的物質(zhì)密度差異較小。實際操作中，差速離心和密度梯度離心相結(jié)合可以達(dá)到更精確的分離。熒光顯微鏡觀察熒光現(xiàn)象某些物質(zhì)在一定短波長的光（如紫外光）的照射下吸收光能進(jìn)入激發(fā)態(tài)，從激發(fā)態(tài)回到基態(tài)時，就能在極短的時間內(nèi)放射出比照射光波長更長的光（如可見光），這種光就稱為熒光。若停止供能熒光現(xiàn)象立即停止。有些生物體內(nèi)的物質(zhì)受激發(fā)光照射后直接發(fā)出熒光，稱為自發(fā)熒光，如葉綠體的火紅色熒光。有的生物材料本身不發(fā)熒光，但它吸收熒光染料后同樣也能發(fā)出熒光，這種熒光稱為間接熒光，如葉綠體吸附吖啶橙后可發(fā)桔紅色熒光。熒光染料：吖啶橙吖啶橙是一種與DNA和RNA都能結(jié)合的熒光染料在紫外光或藍(lán)光（330-485nm）激發(fā)下，DNA可被激發(fā)出530nm的發(fā)射熒光（細(xì)胞核發(fā)亮綠色熒光），RNA可被激發(fā)出640nm的發(fā)射熒光（核仁和胞質(zhì)RNA發(fā)橘紅色熒光）產(chǎn)生兩種不同熒光是由于吖啶橙與雙鏈DNA和單鏈RNA的結(jié)合方式和結(jié)合量不同決定的。它與DNA結(jié)合是嵌入雙鏈之間，結(jié)合量相對少而與RNA的結(jié)合則由靜電吸引堆積在磷酸根上，結(jié)合量相對較多。推測：葉綠體次生熒光的由來，大部分來自葉綠體的吸附作用，極少部分來自葉綠體中的RNA。加入吖啶橙后葉綠體的自發(fā)熒光（火紅色）消失了？原因：熒光淬滅現(xiàn)象所致。吖啶橙是一種芳香雜環(huán)離子型染料，可透過細(xì)胞膜。推測吖啶橙陽離子是進(jìn)入葉綠體膜內(nèi)通過影響葉綠素分子結(jié)構(gòu)或所處的化學(xué)環(huán)境使自發(fā)熒光淬滅的。熒光淬滅現(xiàn)象產(chǎn)生的原因：分子結(jié)構(gòu)和化學(xué)環(huán)境使影響物質(zhì)發(fā)射熒光和熒光強度的重要因素（pH、溫度、光、淬滅劑）熒光染料：吖啶橙實驗用品材料：新鮮菠菜試劑：0.35mol/L氯化鈉溶液，0.01%吖啶橙(acridineorange)儀器：普通離心機、組織搗碎機、粗天平、熒光顯微鏡、燒杯、量筒、滴管、離心管、試管架、紗布、無熒光載片和蓋片等實驗步驟新鮮菠菜葉片（去葉脈）30g0.35MNaCl150ml，組織搗碎機低速勻漿（5000rpm）3~5min（破碎細(xì)胞）勻漿液6層紗布過濾濾液1000rpm離心2min棄沉淀，上清液3000rpm離心5min棄上清液，沉淀為葉綠體（混有部分細(xì)胞核）0.35M氯化鈉溶液懸浮滴片觀察取1滴葉綠體懸液置于載玻片上，加蓋玻片后分別用普通光學(xué)顯微鏡觀察葉綠體的形態(tài)結(jié)構(gòu)和熒光顯微鏡觀察自發(fā)熒光取1滴葉綠體懸液，滴加1滴0.01%吖啶橙熒光染料，加蓋玻片后熒光顯微鏡觀察間接熒光葉綠體的分離與熒光觀察菠菜葉手切片觀察新鮮菠菜葉，刀片切出一斜面置于載玻片上滴加1~2滴NaCl溶液蓋上蓋片顯微鏡下觀察

注意事項葉綠體的分離應(yīng)在等滲溶液（0.35MNaCl）中進(jìn)行，以免滲透壓的改變使葉綠體受到損傷。分離過程最好在0-5℃的條件下進(jìn)行；如果在室溫下，要迅速分離和觀察，控制好離心速度和時間。離心機使用：離心管要平衡棄上清時不要把沉淀蕩起，再加NaCl溶液時（少加，以免葉綠體太稀不易觀察）用滴管吹勻混合液，力氣不能過大，以免造成葉綠體破碎。熒光顯微鏡使用熒光顯微鏡檢要在光線盡量暗的環(huán)境下進(jìn)行不要直接觀察激發(fā)光源，保護(hù)眼睛熒光染料有一定得毒性，要做好防護(hù)觀察熒光受多種因素的影響，如溫度、光、淬滅劑等在熒光觀察時應(yīng)抓緊時間，有必要時立即拍照制作熒光裝片最好使用無熒光載片、蓋片和無熒光油汞燈開啟后15min內(nèi)不要關(guān)閉實驗結(jié)果普通光鏡下，可看到葉綠體為綠色橄欖型，高倍鏡下可看到葉綠體內(nèi)部含有較深的綠色顆粒，即基粒。菠菜葉手切片在普通光鏡下可以看到三種細(xì)胞：表皮細(xì)胞、保衛(wèi)細(xì)胞、葉肉細(xì)胞。葉肉細(xì)胞呈長方形或類方形，內(nèi)含大量帶有綠色的葉綠體顆粒，后者呈單一或多個排列。另外，視野下還可見到大量散在的點狀或類圓狀葉綠體顆粒。熒光顯微鏡下，選用藍(lán)色激發(fā)濾光片，葉綠體自發(fā)熒光為火紅色；吖啶橙染色后間接熒光為橘紅色，細(xì)胞核呈綠色，氣孔