第5章影響生物修復的環境條件

環境條件與生物降解一、非生物因子對生物降解的影響二、生物因子對生物降解的影響物理、化學和生物等環境條件都會影響微生物的生存和活動，即影響微生物的種類、生物化學轉化速率和生物降解產物。如不同地點取樣的微生物對同一個污染物代謝情況有很大差異。第一節、非生物因子對生物降解的影響

物理化學因子礦質元素供應氧氣生長因子多種基質作用一、非生物因子對生物降解的影響1、物理化學因子包括：溫度，pH，土壤水分，鹽分，水壓（深海和深層土壤）每種微生物對環境都有一個耐受范圍。超過了范圍，降解作用就不會發生。

（1）溫度一般是隨溫度增加而增加（2）pH一般用石灰調節酸性土壤（3）水分土壤水分是重要限制因子。最適宜的水分是田間持水量的30-90%。最適水分取決于土壤特性，化合物種類已厭氧還是好氧轉化。含油污泥的生物降解的最適水分為田間持水量的30-90%。

(4)鹽分設計滲透壓（5）壓力海底高壓力不適應微生物降解。盡管調節上述因子有利于提高生物修復的效率，但是，在經濟上是不可行的。不過，在反應器中，或者在可控環境中調節溫度、水分、pH值可以是生物降解反應達到最佳。

2、養分供應（1）碳源碳源對細菌和真菌的生長很重要。有機物污染物在環境界面上的有機碳濃度很高，一般不會成為限制因子，但N、P含量很低，而K，S，Mg，Ca，Fe等通常不缺。這是NP經常成為限制因子，需要添加的原因。由于共代謝等多種原因，向環境基質中加入有機物或單一化合物往往會促進污染物的降解。見表5-1BHC：六六六MCPA：2甲4氯通常，在土壤中加入聯苯可以加速PCBs的礦化。如何促進有機物降解，是研究的重要內容之一。

（2）氮和磷一般，微生物要求C：N<20：1；C：P<50-100：1無論是海水，還是土壤中，加入氮磷肥料是促進石油類污染物降解的有力措施。肥料開發：親油性肥料（oleophilicfertilizers）辛基磷酸鹽，癸基磷酸鹽，石蠟化尿素，十二烷基尿素。在DEHP存在條件下，無NP時，菲根本就不礦化分解通常是同時加入多種養分（NP）促進作用會更大些。

3生長因子營養缺陷型（auxotrophs）:指不能制造某種生長因子（氨基酸、維生素等）海水中90%，沉積物中75-80%的微生物是營養缺乏型。

4氧氣供應原油和烴類的降解需要充足的氧氣。氧氣是僅有的或優先電子供體。在深水、土壤和地下水中由于氧氣的限制，常常導致降解恨慢或不能進行。典型的修復策略是增加供氧，如強制供氣，添加過氧化氫等

5多種基質作用在自然條件或污染條件下，污染物通常是多基質的（multiplesubstrates）。微生物在多種基質存在下的降解行為是有很大差別的。多種機制作用的現象其一、多種有機質可以同時被利用解釋：可能是微生物各自有不同的基質

其二、一種基質可以促進另一種基質的利用解釋：添加一種基質促進了微生物的生長，從而導致對另一種基質的利用；一種基質是共代謝物，因此，添加后，促進另一種降解；添加某種化合物，誘導微生物產生分解酶；兩種化合物中有一種濃度很低，低于生長閾值，另一種化合物可以提供能源，從而促進衡量物質的降解。

其三、一種基質可以減緩另一種基質的利用解釋：一種化合物毒性很高，抑制微生物生長而造成另一種化合物降解變緩一種化合物的產物不利于第二種微生物群體的生長由于某種降解微生物的增加，對營養競爭的結果導致另一微生物生長受到抑制其四、基質可以被順序利用第二節、生物因子對生物降解的影響協同作用捕食作用生物因子對生物降解的影響1協同作用例子：許多生物降解需要多種微生物的合作。單一菌株不能降解，而混合菌株能降解。如節桿菌屬(Arthrobacter)和璉霉菌屬(Streptomyces)在一起時才能礦化二嗪磷。協同作用的機制（1）提供生長因子（2）分解不完全降解物（3）分解有毒物（4）分解共代謝產物

2捕食作用環境中有大量的捕食、寄生微生物。主要有：原生動物:有抑制(捕食)和促進（分泌生長因子和提供養分）兩種作用噬菌體真菌病毒蛭狐菌屬(Bdellovibrio)分枝桿菌集胞粘菌能分泌分解細菌真菌細胞壁酶的微生物第三節微生物系統的人工調控一、微生物的馴化二、菌株接種三、基因工程菌一、微生物的馴化1馴化期的概念圖7-12,4,5-T除草劑在不同土壤中的消失情況2,4,5-T2,4,5-trichlorophenoxyaceticacid2,4,5-三氯苯氧乙酸

土壤和水體受到污染后，特別是受到不容易生物降解的有機物污染后，污染物開始不發生降解或降解很慢，但經過一定時間后污染物迅速降解。從污染物進入環境到污染物開始迅速降解這段時間間隔稱為馴化期（acclimationperiod）,或稱適應期（adaptationperiod）、停滯期（lagperiod）。

馴化期長短1小時到幾個月不等。表7-1馴化及其在污染物處理中的應用工業廢水處理：活性污泥的馴化。開始時，用少量工業廢水，一定時間后，增大工業廢水比例。菌種篩選上的應用：通過人工措施是微生物逐步適應某種特定環境，最后獲得由較高耐受力的特定微生物。2馴化的后效應馴化期的結束標志著降解期的開始。經過一段時間后，再加入相同的化學品，可能出現的現象包括：立即降解，沒有停滯期停滯期很短有的化合物沒有馴化效應3農藥加速降解現象農藥的加速降解（acceleratedpesticidedegradation）或促進生物降解(enhancedmicrobialdegradation).具有此現象的農藥：2，4-D；2甲4氯；滅草敵；丁草敵無此現象的農藥：莠去津（atrazine）；西馬津；毒死稗等。在生產上，為了延長農藥的作用期，需要使用延緩劑，主要是抑制降解生物的活性。丁草敵的延緩劑是地蟲硫磷和二乙磷。4影響馴化的因素1）環境因子：溫度，pH，通氣性，NP濃度。2)地點:有些微生物在一個地點可以被馴化，但在另一地點則不然。3）基質的降解性5產生馴化期的原因1）初始群體太小通常在土壤、天然水和污水、廢水中能夠利用合成有機化合物的微生物群體數量是很少的，有時只有幾個。

2）毒物的存在。一是污染品濃度太高，有毒；二是污染品中含有高毒化合物作用方式：單純抑制：僅使降解菌生長受到抑制抑制快生菌：這種快生菌可能就是優勢菌毒性產生：毒物并不存在，但在降解過程中產生毒性消除：存在于污染物中的毒物逐漸揮發降解消失。

3）原生動物的捕食作用：證明:在污泥降解中，加有原生動物抑制劑的馴化期明顯縮短。4）新基因型的出現期間，發生高效降解基因的突變和轉移，然后形成優勢微生物。這個過程需要的時間就是馴化期5）酶的誘導和停滯期二、菌株接種1接種的目的：微生物無處不在，在環境中有各種各樣具有降解能力的微生物群落，如果能充分發揮這種能力，有機物就會迅速降解。那么是否還有必要對污染地點進行接種？答案不能簡單的肯定或否定，而要根據具體情況通過實驗來確定。接種（inoculation）又叫生物強化（bioaugmentation）目的是：1)加速污染物的降解2）克服微生物的不均勻性3）縮短馴化期4）恢復微生物區系

2菌株的富集(enrichment)和分離(isolation)1）一般降解菌的富集和分離富集培養技術：這是一種常用的選擇性培養技術。做法是：①選擇某些因子（炭源、氮源、通氣條件、受氫體，溫度、pH，或光照）造成特殊的環境條件；若要分離特定有機物的降解菌，富集時就要用該有機物作為唯一的碳源和能源。不添加其他有機物，但要添加無機鹽。

②采用含有各種微生物的樣品（如土壤或污泥）油田的污泥和沉積物含有大量的石油降解菌，是很好的材料。因為這些材料是經過自然選擇和富集的。這些材料中特種微生物的數量很高。

③讓最能適應該生長條件的微生物生長速率超過其他微生物并占優勢。

④自同樣條件下反復培養，⑤最后在含有同樣成份的固體平板上進行培養，就很容易地將富集到的株系分離出來。

2）異生素降解菌富集和分離技術異生素往往具有高毒性，非水溶性，高揮發性和不穩定性。A困難與解決辦法①毒性：一些異生素，如低分子溶劑，本身對微生物具有較高的毒性。一般1%就可以殺滅微生物。辦法：==加入土壤，通過吸附降低毒性。微生物的可耐受濃度通常是50-100μg/g==不斷向基質加入低濃度的異生素

②憎水性解決辦法是通過分散作用或使用惰性親水載體增加界面。使用兩相（水-有機溶劑）系統對難降解有機物降解菌的富集、篩選十分有效。水相為無機鹽溶液，有機相為惰性溶劑如正十六烷、環庚烷和硅油。難降解的污染物溶解在有機相中。微生物在兩相界面或水相中利用污染物。

③揮發性辦法：不斷添加或在密閉系統中進行④熱穩定性有的異生素熱穩定性差，造成消毒困難。采用過濾法消毒。

B常用分離技術分離注意：異生素分解菌生長很慢，不容易將它們和噬寡碳營養菌區分開；異生素不能做唯一碳源時，必須補充加入少量復雜有機物如酵母膏或土壤浸液，增加了復雜性異生素的不溶性使培養液混濁，增加了判斷的復雜性

①殘留分析和生長情況的判斷將異生素分離提取后，用GC，HPLC，和化學方法測定，如生物呼吸儀也可用同位素14C標記技術測定②降解菌落的選擇從固體培養基上挑選所需菌落，一般需要利用菌落的生理特征區別菌落。例如，降解菌菌落會溶解培養基周圍的不溶物而在菌落邊緣形成透明帶。雙層瓊脂技術顯色技術

3）共代謝基質降解菌的富集與分離由于共代謝是不與微生物生長相聯系的基質降解過程，使用降解基質作為唯一碳源行不通。通常采用的辦法有：①類似物富集技術選擇與基質類似的物質加入到體系中，獲得的純培養物能共代謝該化合物。類似物與共代謝物具有相同的碳骨架，但不會阻斷生物降解和基質利用②相關酶的測定4）同生菌的富集和分離具有協同共棲關系的兩個或多個微生物種群叫同生菌。兩種微生物只能協同降解同一種污染物。即使加入生長因子或滿足其他條件也不能使同生菌中的每個菌團獨立存在。

systemsarewidelyusedinwastewatertreatmentandhavebeenusedinthelargescalecontinuouscultureofbacteria.恒化器是研究微生物生長動力學的有力工具。同時，也是微生物種群分離的有效手段。向恒化器中接種土壤或其他環境樣品，并不斷地提供試驗有機物溶液作為唯一碳源和能源，在這種條件下生長快的微生物就保留下來，其他微生物被逐漸淘汰出恒化器系統。恒化器是一種設法使培養液流速保持不變，并使微生物始終在低于其最高生長速率條件下進行生長繁殖的一種連續培養裝置。這是一種通過控制某一種營養物的濃度，使其始終成為生長限制因子的條件下達到的，因而可稱為外控制式的連續培養裝置。可以設想，在恒化器中，一方面菌體密度會隨時間的增長而增高，另一方面，限制生長因子的濃度又會隨時間的增長而降低，兩者互相作用的結果，出現微生物的生長速率正好與恒速流入的新鮮培養基流速相平衡。這樣，既可獲得一定生長速率的均一菌體，又可獲得雖低于最高菌體產量，卻能保持穩定菌體密度的菌體。

恒化器主要用于實驗室科學研究中，尤其用于與生長速率相關的各種理論研究中。6）“加速進化”與富集分離活體的遺傳工程（invivogeneticengineering）又稱“質粒協助分子育種(plasmid-assistedmolecularbreeding)”它利用環境中存在的微生物在選擇性壓力下于恒化器中長期培養，通過各種微生物間質粒的自然傳遞和相互作用來完成構建新菌株的目的，加速了新的異生素降解菌自然進化的過程。3接種成功的案例在反應器中、固體床反應器中、砂濾池處理的地下水中，接種微生物一般會取得成功。但在自然土壤、含水層及地表水中接種不易成功。土壤：加入假單胞菌菌株和聯苯可以使土壤中的PCBs消失。4接種失敗的原因在實驗室培養得到的微生物，接種到環境中后并不具有優勢，導致接種失敗。營養限制捕食者和寄生物的限制移動能力其他（基質濃度太低，pH，毒物等）三、基因工程菌利用遺傳工程技術可以構建新的微生物。這些新的微生物具有現有微生物不具備的分解代謝能力，或者能在現有微生物不適合的條件下進行分解活動。應用：構建新的微生物創造新的代謝途徑增加微生物某個代謝酶的數量和活性創造能降解多種污染物的超細菌創造某種特定性質的細菌基本概念染色體（chromosome）質粒（plasmid）質粒的特點：1）自我復制（self-replication）2)共價閉合環狀結構(covalentclosedcircularDNA)3)質粒的相容性(compatibility)與不相容性(incompatibility)

4)質粒的消除（curing）、整合(integration)和重組(recombination)5)質粒的轉移性轉化(transformation)：在細胞之間不接觸或沒有載體介入的情況下的基因轉移。受體菌直接吸收了來自供體菌的DNA片段，通過交換，把它整合到自己的基因組中，受體菌獲得部分新的遺傳性狀。轉導(transduction)：有噬菌體為媒介，把供體細胞的一小段DNA片段攜帶給受體細胞。接合(conjugation）：供體菌(F因子菌株，F+)通過性纖毛與受體菌（不含F因子，F-）相接觸，F+傳遞不同長度的單鏈DNA給F-。接合和轉導可以在自然環境中發生，轉化這一般需要在人工條件下進行。1多質粒菌株的構建美國構建“多質粒超級菌”(multplasmidsuperbug)消除海上石油污染。將不同假單胞菌的不同菌株的四種降解性質粒接合轉移到一個菌株中，構建成一株能同時降解芳香烴、多環芳烴、萜烴、和脂肪烴的超級細菌。

基因重組2基因工程菌的構建

Thestructureofnucleotides.Thesugarinthiscaseisribonucleicacid

AschematicofthebondingofoneDNAstrandtoanother胞嘧啶尿嘧啶StructureofATPandConversionofATPtoADP+7.3kcalpermole3原生質體融合技術

應用實例1揚子石化與南京大學、香港大學、國家環保總局南京環境科學研究所聯合承擔的國家863計劃項目“跨界融合構建基因工程菌處理石化廢水的研究”。運用了基因工程，融合了3個跨界親株微生物，構建出特效菌株。該菌株兼具了各種傳統菌株的高降解性、高適應性和高絮凝性等特點。經過合作各方4年的努力，逐步建立起基因表達、營養條件、工藝操作3項優化調控技術，對二甲苯、苯甲酸、鄰苯二甲酸、4－羧基苯甲醛和對苯二甲酸5種有機污染物的降解率分別高達86％、94％、99％、97％和94％，總有機碳去除率達到94％；2南京農業大學李順鵬組用原生質體融合法構建了能將就甲胺磷、敵敵畏、和對硫磷的降解菌。應用實例第四節影響植物修復的環境因子與微生物一樣，影響植物修復的因子包括pH，Eh,共存物質，污染物交互作用，生物因子等。以重金屬植物修復為例。一、pH1改變重金屬的生物有效性。（1）降低pH,重金屬溶解度增加，反之，亦然。（2）土壤pH影響離子活度。（3）土壤溶液pH降低，大多數重金屬元素在土壤固相的吸附能力和吸附量下降。如，酸性沙土中，pH每降低0.5,Cd的吸附降低1倍，植物的吸收量增加。有些元素相反，如As以陰離子存在，提高pH反而降低其吸附。二、EhS的氧化還原電位：Eh=-0.139+0.07xlg([SO42-]/[

H2S])隨著Eh降低，硫化物大量形成，土壤中的重金屬離子就減少。如Eh為416mV時，糙米含Cd是Eh165mV時的2.5倍。Eh對Cd結合形態轉化的影響1）在還原條件下，有機結合態鎘最穩定；2）在氧化條件下，有機結合態的鎘則被轉化為生物可利用的水溶態、可交換態或溶解絡合態而釋放到水體中，并隨Eh增大，釋放量增加。Eh/mVCd釋放％可交換態不溶性有機結合態50350三、共存物質1絡合-螯合劑：主要代表是EDTA、DTPA作用機理：與溶液中可溶性離子結合，防止被土壤吸附或沉淀。應用例子：加入EDTA后，玉米、豌豆對Pb的吸收增加20倍。同時，增加Pb向地上部運轉120倍。因此，使用螯合劑使普通植物變成了重金屬的超積累植物。三、共存物質2表面活性劑：主要代表是LAS、CTAB、Tween－80等三類。表面活性劑可促進植物對重金屬的吸收。例子：在含Cd、Cu、Zn分別為2、530、700mg/Kg的土壤上種植萵苣和黑麥草，使用表面活性劑次氮基三乙酸酯，發現植株地上部三種元素吸收量增加了4－24倍。機理：表面活性劑對土壤重金屬陽離子具有增溶作用