第一章蛋白質的結構與功能StructureandFunctionofProtein

1833年

Payen和Persoz分離出淀粉酶。1864年

Hoppe-Seyler從血液分離出血紅蛋白，并將其制成結晶。19世紀末

Fischer證明蛋白質是由氨基酸組成的，并將氨基酸合成了多種短肽

。1938年德國化學家GerardusJ.Mulder引用“Protein”

一詞來描述蛋白質。

大事記1951年Pauling采用X（射）線晶體衍射發現了蛋白質的二級結構——α-螺旋(α-helix)。1953年FrederickSanger完成胰島素一級序列測定1962年

JohnKendrew和MaxPerutz確定了血紅蛋白的四級結構。20世紀90年代以后基因組計劃。第一節蛋白質的重要性和一般組成一、什么是蛋白質?蛋白質(protein)是由許多氨基酸(aminoacids)通過肽鍵(peptidebond)相連形成的高分子含氮化合物。1、蛋白質是生物體重要的組成成分

分布廣——蛋白質分布廣泛，幾乎所有器官、組織都含有蛋白質；

含量高——蛋白質是生物體中含量最豐富的生物大分子。占人體干重的45％，某些組織含量更高，例如脾、肺及橫紋肌等高達80％。二、蛋白質具有重要的生物學功能2、酶的生物催化作用3、調控作用參與基因調控：組蛋白、非組蛋白等參與代謝調控：如激素或生長因子等4、運動與支持機體的結構蛋白：頭發、骨骼、牙齒、肌肉等5、參與運輸貯存的作用血紅蛋白——運輸氧銅藍蛋白——運輸銅運鐵蛋白——貯存鐵6、免疫保護作用抗原抗體反應凝血機制7、參與細胞間信息傳遞信號傳導中的受體、信息分子等8、氧化供能

有些蛋白質還含有少量的P、Fe、Cu、Mn、Zn、Se、I等。

C50~55%H6~7%O19~24%N13~19%S0~4%主要元素組成三、組成蛋白質的元素

各種蛋白質的含氮量很接近，平均為16％。

由于體內的含氮物質以蛋白質為主，因此，只要測定生物樣品中的含氮量，就可以根據以下公式推算出蛋白質的大致含量：100克樣品中蛋白質的含量(g%)=每克樣品含氮克數×6.25×1001/16%蛋白質元素組成的特點凱氏定氮法：第二節

氨基酸Aminoacid一、氨基酸的結構通式

氨基酸——

組成蛋白質的基本單位。在自然界中的氨基酸有300余種，但組成人體蛋白質的基本氨基酸僅有20種。H甘氨酸CH3丙氨酸L-氨基酸的通式R

基本氨基酸中，除脯氨酸和甘氨酸外其余均屬于L-α-氨基酸例外：Pro——

亞氨基酸Gly——

沒有手性非極性疏水性氨基酸極性中性氨基酸酸性氨基酸堿性氨基酸二、氨基酸的分類分類依據：R側鏈基團的結構及理化性質的不同1、非極性疏水性氨基酸2、極性中性氨基酸——側鏈基團在中性溶液中解離后帶負電荷。3、酸性氨基酸天冬氨酸asparticacidAsp2.97谷氨酸glutamicacidGlu3.224.堿性氨基酸——側鏈基團在中性溶液中解離后帶正電荷。組氨酸

His（H）

7.59賴氨酸Lys（K）

9.74精氨酸

Arg（R）

10.76另外：1、蛋白質中的很多氨基酸是經過加工修飾的——修飾氨基酸如：脯氨酸羥基化成羥脯氨酸

賴氨酸羥基化成羥賴氨酸2、半胱氨酸Cys常以胱氨酸的形式存在半胱氨酸+胱氨酸二硫鍵-HHHS-CH2-CH-COO-HS-CH2-C-COO-+NH3-OOC-CH-CH2-S+NH3S-CH2-CH-COO--OOC-CH-CH2-S+NH3S-CH2-CH-COO-+NH31.紫外吸收苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸的最大吸收峰在280nm

附近。三、氨基酸的物理性質紫外分分光度法：大多數蛋白質含有這三種氨基酸殘基，所以測定蛋白質溶液280nm的光吸收值是分析溶液中蛋白質含量的快速簡便的方法。芳香族氨基酸的紫外吸收1.兩性離子形式氨基酸是兩性電解質，其解離程度取決于所處溶液的酸堿度。氨基酸的兩性離子

四、氨基酸的酸堿性質2、兩性解離和等電點+OH-+H++OH-+H+pH<pI陽離子pH=pI氨基酸的兩性離子

pH>pI陰離子等電點(isoelectricpoint,pI)

在某一pH的溶液中，氨基酸解離成陽離子和陰離子的趨勢及程度相等，使該氨基酸分子上所帶正負電荷相等，凈電荷為零，成為兩性離子，在電場中既不向陽極也不向陰極移動，此時溶液的pH值稱為該氨基酸的等電點。3、以丙氨酸為例計算等電點

氨基酸等電點的計算

可見，氨基酸的pI值等于該氨基酸的兩性離子狀態兩側的基團pK′值之和的二分之一。pI=2pK′1+pK′2一氨基一羧基AA的等電點計算：pI=2pK′2+pK′R二氨基一羧基AA的等電點計算：pI=2pK′1+pK′R一氨基二羧基AA的等電點計算：總結氨基酸帶點狀態的判定

pI－pH<0帶負電

pI－pH>0帶正電

pI－pH＝0不帶電等電點的計算①側鏈為非極性基團或雖為極性基團但不解離的氨基酸：pI=1/2（pK1+pK2）②酸性氨基酸（Glu、Asp）及Cys：

pI=1/2（pK1+pKR）③堿性氨基酸（賴、精、組）：

pI=1/2（pK2+pKR）五、顯色反應

茚三酮反應：氨基酸可與茚三酮縮合產生藍紫色化合物，最大吸收峰在570nm。

Pro與茚三酮反應產物則呈現黃色。該反應可作為蛋白質定性、定量分析的基礎。第三節肽peptide一、肽的結構與命名

肽是由氨基酸通過肽鍵縮合而形成的化合物。+-HOH甘氨酰甘氨酸肽鍵肽鍵(peptidebond)：是由一個氨基酸的-羧基與另一個氨基酸的-氨基脫水縮合而形成的化學鍵，本質為酰胺鍵。氨基酸殘基(residue):肽鏈中的氨基酸分子因為脫水縮合而基團不全，被稱為氨基酸殘基。兩分子氨基酸縮合形成二肽，三分子氨基酸縮合則形成三肽……由十個以內氨基酸相連而成的肽稱為寡肽(oligopeptide)，由更多的氨基酸相連形成的肽稱多肽(polypeptide)多肽鏈(polypeptidechain)是指許多氨基酸之間以肽鍵連接而成的一種結構。

N末端：多肽鏈中有自由氨基的一端C末端：多肽鏈中有自由羧基的一端多肽鏈有方向性：Ala-Tyr-Asp-GlyNCN端C端N末端C末端牛核糖核酸酶二、幾種生物活性肽1.谷胱甘肽(glutathione,GSH)GSH過氧化物酶H2O22GSH2H2OGSSG

GSH還原酶NADPH+H+NADP+GSH有抗氧化劑的作用，可還原細胞內產生的過氧化氫

體內許多激素屬寡肽或多肽

神經肽(neuropeptide)2.多肽類激素及神經肽第四節蛋白質的分類*根據蛋白質組成成分單純蛋白質：如，血清清蛋白結合蛋白質=蛋白質部分+非蛋白質部分

如：糖蛋白、脂蛋白、金屬蛋白等*根據蛋白質形狀纖維狀蛋白質：多為結構蛋白，難溶于水球狀蛋白質：多數具有生理活性，多數可溶如酶、免疫球蛋白等等第五節蛋白質的分子結構

TheMolecularStructureofProtein蛋白質是由許多氨基酸單位通過肽鍵連接起來的，具有特定分子結構的高分子化合物。構象是由于有機分子中單鍵的旋轉所形成的。蛋白質的構象通常由非共價鍵（次級鍵）來維系。蛋白質的分子結構包括一級結構(primarystructure)二級結構(secondarystructure)三級結構(tertiarystructure)四級結構(quaternarystructure)高級結構定義：蛋白質的一級結構指多肽鏈中氨基酸的排列順序。(包括蛋白質分子中所有的二硫鍵的位置）主要的維系鍵：肽鍵，有些蛋白質還包括二硫鍵。一、蛋白質的一級結構蛋白質一級結構的測定分析已純化蛋白質的氨基酸殘基組成測定多肽鏈的氨基末端與羧基末端為何種氨基酸殘基裂解多肽鏈為較小的片段測定各肽段的氨基酸排列順序，一般采用Edman降解法一般需用數種水解法，并分析出各肽段中的氨基酸順序，然后經過組合排列對比，最終得出完整肽鏈中氨基酸順序的結果，并確定二硫鍵的位置。（一）蛋白質測序的策略（二）氨基酸組成的分析酸水解法：一般采用鹽酸或硫酸進行水解。優點是不消旋，缺點是色氨酸完全破壞，同時天冬酰胺和谷氨酰胺的酰胺基被水解下來。堿水解法：采用氫氧化鈉進行水解。但是多數氨基酸被不同程度的破壞，并產生消旋現象。但是堿性條件下，色氨酸穩定。（三）N末端和C末端氨基酸殘基的鑒定1、N末端分析二硝基氟苯DNFB法丹磺酰氯DNS苯異硫氰酯PITC法氨肽酶法：從多肽鏈的N末端逐個向里切。氨基酸與2,4一二硝基氟苯(DNFB)的反應

（sanger反應）DNFB（dinitrofiuorobenzene）DNP-AA(黃色)++HF弱堿中氨基酸

丹磺酰氯法:在堿性條件下，丹磺酰氯（二甲氨基萘磺酰氯）可以與N-端氨基酸的游離氨基作用，得到丹磺酰-氨基酸。氨基酸與苯異硫氰酯（PITC）的反應（Edman反應）PITC（phenylisothiocyanate）+苯乙內酰硫脲衍生物(PTH-AA)（phenylisothiohydantion-AA）弱堿中(400C)(硝基甲烷400C)H+2、C末端分析肼解法羧肽酶法肼解法：此法是多肽鏈C-端氨基酸分析法羧肽酶羧肽酶A：釋放除Pro、Arg、Lys之外的所有C末端殘基羧肽酶B：只水解以堿性氨基酸Arg、Lys為C末端殘基的肽鍵羧肽酶A和B的混合物（四）二硫鍵的斷裂使用最普遍的方法是用過量的巰基乙醇處理，使S—S轉變為—SH，同時還需要8mol/L尿素同時存在，使蛋白質變性。（五）多肽鏈的裂解1、酶裂解法胰蛋白酶胰凝乳蛋白酶嗜熱菌蛋白酶胃蛋白酶（Phe.Tyr.Trp）（Arg.Lys）（脂肪族）胰凝乳蛋白酶胃蛋白酶彈性蛋白酶羧肽酶胰蛋白酶氨肽酶羧肽酶（Phe.Trp）2、化學裂解法溴化氰斷裂：專一性斷裂由甲硫氨酸殘基的羧基參與形成的肽鍵。羥胺斷裂：在pH9.0情況下專一性斷裂Asn—Gly之間的肽鍵。（六）肽段氨基酸序列的測定Edman化學降解法①—②—③—④—⑤

—①—②—③—④—⑤

—①+②—③—④—⑤

—②—③—④—⑤

—②+③—④—⑤（七）肽段在多肽鏈中次序的決定第一套：Arg—Cys—Glu；His—Lys—Trp；

Met—Phe第二套：Arg—Cys；Glu—His；Lys—Trp—MetPheArg—Cys—Glu—His—Lys—Trp—Met—Phe例題有人純化了一個未知肽，其氨基酸組成為：Asp1，Ser1，Gly1，Ala1，Met1，Phe1和Lys2，又做了一系列分析，其結果如下：（1）DNFB與該肽反應再用酸水解得DNP-Ala；（2）胰凝乳蛋白酶CT消化后，從產物中分離出一個純四肽，其組成為：Asp1，Gly1，Lys1，Met1，此四肽的DNFB反應降解產物為DNP-Gly；（3）胰蛋白酶T消化該肽后又可以得到組分分別為Lys1，Ala1，Ser1及Phe1，Lys1，Gly1的兩個三肽，以及一個二肽，此二肽被CNBr處理后游離出自由天冬氨酸。請列出八肽的全順序并簡述推導過程Ala—Ser—Lys—Phe—Gly—Lys——Met—Asp通過核酸來推演蛋白質中的氨基酸序列按照三聯密碼的原則推演出氨基酸的序列分離編碼蛋白質的基因測定DNA序列排列出mRNA序列二、蛋白質的二級結構蛋白質分子中某一段肽鏈的局部空間結構，即該段肽鏈主鏈骨架原子的相對空間位置，并不涉及氨基酸殘基側鏈的構象

。定義

主要的維系鍵：氫鍵

由于C=O雙鍵中的π電子云與N原子上的未共用電子對發生“電子共振”，使肽鍵具有部分雙鍵的性質，不能自由旋轉。蛋白質立體結構原則

肽鍵平面——由于肽鍵具有部分雙鍵的性質，使參與肽鍵構成的六個原子被束縛在同一平面上，這一平面稱為肽鍵平面或肽單元。（一）肽單元

由于α-碳原子與其他原子之間均形成單鍵，因此兩相鄰的肽鍵平面可以作相對旋轉

(二）蛋白質二級結構的主要形式

-螺旋(-helix)

-折疊(-pleatedsheet)

-轉角(-turn)

無規卷曲(randomcoil)1.α-螺旋：α-螺旋是多肽鏈的主鏈原子沿一中心軸盤繞所形成的有規律的螺旋構象

結構特征：⑴為一右手螺旋，側鏈伸向螺旋外側⑵螺旋每圈包含3.6個氨基酸殘基,螺距0.54nm；⑶螺旋以氫鍵維系（氨基酸的N-H和相鄰第四個氨基酸的羰基氧C=O之間。氫鍵方向與螺旋軸基本平行）

影響α－螺旋形成穩定的因素（1）側鏈基團（R）（2）在有脯氨酸、羥脯氨酸存在（3）氫鍵的穩定性2.-折疊β-折疊是由若干肽段或肽鏈排列起來所形成的扇面狀片層構象β-折疊包括平行式和反平行式兩種類型結構特征：⑴由若干條肽段或肽鏈平行或反平行排列組成

片狀結構；⑵主鏈骨架伸展呈鋸齒狀；⑶兩個氨基酸殘基之間的軸心距是0.35nm；⑷借相鄰主鏈之間的氫鍵維系。3.-轉角

多肽鏈中氨基酸殘基n的氮原上的氫與殘基（n+3）羰基上的氧的之間形成氫鍵，肽鍵回折180度。無規卷曲是用來闡述沒有確定規律性的那部分肽鏈結構。無規卷曲與其他二級結構一樣，也是明確而穩定的結構。

4.無規卷曲（三）二級結構測定

通常采用圓二色光譜(circulardichroism，CD)測定溶液狀態下的蛋白質二級結構含量。-螺旋的CD峰有222nm處的負峰、208nm處的負峰和198nm處的正峰三個成分；而-折疊的CD譜不很固定。三、蛋白質的超二級結構及結構域蛋白質中相鄰的二級結構單位（即單個α－螺旋或β－折疊或β－轉角）組合在一起，形成有規則的、在空間上能辯認的二級結構組合體稱為蛋白質的超二級結構基本組合方式：αα；ββ；βαβ1、超二級結構定義（supersecondarystructure）超二級結構類型ααβββαβ2、結構域大分子蛋白質的三級結構常可分割成一個或數個球狀或纖維狀的區域，折疊得較為緊密，各行使其功能，稱為結構域(domain)。三、蛋白質的三級結構疏水鍵、離子鍵、氫鍵和范德華力等。主要的維系鍵：整條肽鏈中全部氨基酸殘基的相對空間位置。即肽鏈中所有原子在三維空間的排布位置。1、定義

肌紅蛋白(Mb)N端C端

為單肽蛋白質，含有153個氨基酸，有8個螺旋區對于單一多肽鏈的蛋白質，三級結構是它的最高級結構，只有具有完整的三級結構，才具有全部的生物學功能。*三級結構測定X射線衍射法(X-raydiffraction)和核磁共振技術(nuclearmagneticresonance,NMR)是研究蛋白質三維空間結構最準確的方法。*用分子力學、分子動力學的方法，根據物理化學的基本原理，從理論上計算蛋白質分子的空間結構。根據蛋白質的氨基酸序列預測其三維空間結構*通過對已知空間結構的蛋白質進行分析，找出一級結構與空間結構的關系，總結出規律，用于新的蛋白質空間結構的預測。四、蛋白質的四級結構

亞基(subunit)：有些蛋白質分子含有二條或多條多肽鏈，每一條多肽鏈都有完整的三級結構，稱為蛋白質的亞基

。蛋白質分子中各亞基的空間排布及亞基接觸部位的布局和相互作用，稱為蛋白質的四級結構。亞基之間的結合力主要是氫鍵和離子鍵。血紅蛋白的四級結構

血紅蛋白的四個亞基緊密結合，亞基之間的維系鍵是亞基之間的8個鹽鍵第六節蛋白質結構與功能的關系TheRelationofStructureandFunctionofProtein一、蛋白質一級結構是空間構象的基礎牛核糖核酸酶的一級結構二硫鍵

天然狀態，有催化活性

尿素、β-巰基乙醇

去除尿素、β-巰基乙醇非折疊狀態，無活性（二）一級結構是功能的基礎1、一級結構相似的多肽或蛋白質，其功能也相似。ThrIle牛胰島素的一級結構人胰島素的一級結構ValAla2、一級結構與分子進化生物與人不同的AA數目黑猩猩0恒河猴1兔9袋鼠10牛、豬、羊、狗11馬12雞、火雞13響尾蛇14海龜15金槍魚21角餃23小蠅25蛾31小麥35粗早鏈孢霉43酵母44

細胞色素C

從細胞色素c的一級結構看生物進化。物種進化過程中越接近的生物，細胞色素的一級結構越相似。例：鐮刀形紅細胞貧血N-val·his·leu·thr·pro·glu·glu·····C(146)血紅蛋白Sβ肽鏈血紅蛋白Aβ肽鏈N-val·his·leu·thr·pro·val

·glu·····C(146)鐮刀形紅細胞正常紅細胞（三）一級結構改變與分子病二、蛋白質空間結構與功能的關系肌紅蛋白Mb的結構血紅素的結構（一）肌紅蛋白的結構與功能○肌紅蛋白與氧結合

肌紅蛋白的氧飽和曲線1008060402002.65.38.010.613.3kPa靜脈血動脈血氧飽和度(%)（二）血紅蛋白的結構與功能肌紅蛋白Hb血紅蛋白Mb血紅蛋白T態與R態互變

氧牽引亞鐵離子接近卟啉平面變構效應變構效應：由于小分子（O2）與大分子（血紅蛋白Hb）亞基結合，導致蛋白質分子構象改變及功能變化的現象稱為變構效應。小分子物質，稱為變構效應劑肌紅蛋白(Mb)和血紅蛋白(Hb)的氧解離曲線肌紅蛋白與血紅蛋白的氧合曲線有何不同？2.65.38.010.613.3kPa*協同效應(cooperativity)一個寡聚體蛋白質的一個亞基與其配體結合后，能影響此寡聚體中另一個亞基與配體結合能力的現象，稱為協同效應。如果是促進作用則稱為正協同效應(positivecooperativity)如果是抑制作用則稱為負協同效應

(negativecooperativity)

不同空間結構的蛋白質執行不同的功能。蛋白質執行功能時依賴于正確空間構象的形成。PrPcα-螺旋PrPscβ-折疊正常瘋牛病三、蛋白質構象改變與疾病這類疾病包括：人紋狀體脊髓變性病、老年癡呆癥、亨停頓舞蹈病、瘋牛病等。蛋白質構象疾病：若蛋白質的折疊發生錯誤，盡管其一級結構不變，但蛋白質的構象發生改變，仍可影響其功能，嚴重時可導致疾病發生。第七節蛋白質的理化性質ThePhysicalandChemicalCharactersofProtein一、蛋白質的膠體性質蛋白質屬于生物大分子之一，分子量可自1萬至100萬之巨，其分子的直徑可達1～100nm，為膠粒范圍之內。*蛋白質膠體穩定的因素：顆粒表面電荷(電荷層）水化膜+++++++帶正電荷的蛋白質－－－－－－－－帶負電荷的蛋白質在等電點的蛋白質水化膜++++++++帶正電荷的蛋白質－－－－－－－－帶負電荷的蛋白質不穩定的蛋白質顆粒酸堿酸堿酸堿脫水作用脫水作用脫水作用溶液中蛋白質的聚沉蛋白質的兩性電離二、酸堿性質蛋白質分子除兩端的氨基和羧基可解離外，氨基酸殘基側鏈中某些基團，在一定的溶液pH條件下都可解離成帶負電荷或正電荷的基團。*蛋白質的等電點(isoelectricpoint,pI)

當蛋白質溶液處于某一pH時，蛋白質解離成正、負離子的趨勢相等，即成為兼性離子，凈電荷為零，此時溶液的pH稱為蛋白質的等電點（三）蛋白質的變性、沉淀和凝固*蛋白質的變性(denaturation)在某些物理和化學因素作用下，其特定的空間構象被破壞，也即有序的空間結構變成無序的空間結構，從而導致其理化性質改變和生物活性的喪失。

造成變性的因素如加熱、乙醇等有機溶劑、強酸、強堿、重金屬離子及生物堿試劑等。

變性的本質——

破壞非共價鍵和二硫鍵，不改變蛋白質的一級結構。

變性蛋白質的性質改變：①物理性質：旋光性改變，溶解度下降，沉降率升高，粘度升高，光吸收度增加等；②化學性質：官能團反應性增加，易被蛋白酶水解。③生物學性質：原有生物學活性喪失，抗原性改變。

應用舉例臨床醫學上，變性因素常被應用來消毒及滅菌。此外,防止蛋白質變性也是有效保存蛋白質制劑（如疫苗等）的必要條件。

若蛋白質變性程度較輕，去除變性因素后，蛋白質仍可恢復或部分恢復其原有的構象和功能，稱為復性(renaturation)。

天然狀態，有催化活性

尿素、β-巰基乙醇

去除尿素、β-巰基乙醇非折疊狀態，無活性*蛋白質的凝固作用(proteincoagulation)

蛋白質變性后的絮狀物加熱可變成比較堅固的凝塊，此凝塊不易再溶于強酸和強堿中。

四、蛋白質沉淀在一定條件下，蛋白疏水側鏈暴露在外，肽鏈融會相互纏繞繼而聚集，因而從溶液中析出。變性的蛋白質易于沉淀，有時蛋白質發生沉淀，但并不變性。鹽析有機溶劑沉淀重金屬鹽沉淀生物堿制劑或某些酸類沉淀加熱變性沉淀