生物工程反應姜梅2010.9聯系方式：

Meijiang9@84396989(O)緒論本章重點：生物反應工程生物工程概念與內容；本章難點：生物反應過程與生物反應工程的區別。

1.1生物反應過程概述

1.1.1生物反應過程(bioprocess)

定義：

將生物技術的實驗室成果經工藝及工程開發而成為可供工業生產的工藝過程。實質：利用生物催化劑從事生物技術產品的生產過程。青霉素的生產。抗生素——青霉素羅伯茨（W.Roberts，1874)首次報道微生物的頡頏（xiehang）現象（antagonism）灰綠青霉生長旺盛的液體會使人工感染細菌困難廷德爾（J.Tyndall,1876）青霉菌與細菌液體培養中有頡頏現象巴斯德和朱伯特（J.F.Joubert，1877)用炭疽芽孢桿菌培養物感染動物巴比斯和科尼爾（V.Babes&A.V.Cornil,1885)細菌之間……青霉素的生產1928.9英國Fleming發現青霉素1938英國Flory和Chain重復（實驗室）少量敗血病失敗第二次世界大戰美國D.Elder

液體深層發酵0.001g/L1945青霉素高產菌株——產黃青霉（Penicillium

chrysogenum)

育種技術培養基設計技術攪拌通氣發酵罐為反應器（六葉平板槳）

氧的傳遞技術等等化學家錢恩（E.Chain）獲得精制品，1940在美國產業化當前水平60000～80000U/ml(150m3)空氣凈化工藝流程生物技術

biotechnology側重技術方法

應用自然科學及工程學的原理，依靠生物催化劑的作用將物料進行加工以提供產品或為社會服務的技術。生物科學

bioscience：側重機理研究生命現象和生命活動規律的科學生物工程bioengineering：側重工程（一）描述性生物學1．19世紀30年代，德國植物學家施萊登、動物學家施旺提出細胞學說。2．1859年，英國生物學家達爾文出版《物種起源》。（二）實驗生物學階段：（孟德爾遺傳規律重新提出—1900年）（三）分子生物學階段：

1．1944年，美國生物學家艾弗里首次證明DNA是遺傳物質。

2．1953年，美國沃森，英國克里克提出DNA雙螺旋結構模型。生物科學發展生物工程專業本科授予工學學士學位，生物科學和生物技術專業本科授予理學學士學位。以清華大學為例，生物科學與技術系是培養在生物科技領域從事科學研究、教學和應用開發工作的高水平人才的專門系科。現設有生物科學和生物技術兩個本科專業，為了拓寬人才培養口徑，招生時按生物科學一個專業招生。雖然分為兩個專業，但課程安排和教學內容上并沒有什么區別，只是在寫畢業論文時各有側重。生物科學專業主要涉及生物化學、分子生物學、生物物理學、結構生物學和細胞發育生物學等學科領域。生物技術專業主要包括生物芯片技術、微生物發酵工程、藻類技術、細胞工程及酶工程和生態環境工程。為使學生適應未來生物科技發展的需要，培養學生不僅注重生物學知識的學習和實驗技術的訓練，而且重視學生在數、理、化、計算機等方面的培養和訓練，還需學習無機化學、分析化學、有機化學、物理化學、普通生物學、生物化學、細胞生物學、微生物學、遺傳學、分子生物學、動物生理學、生物物理學及電工與電子技術、計算機軟硬件技術基礎課程。另有神經生物學、發育生物學、免疫學和生物工程學等一系列課程可選修。以上海交大為例，生物技術專業旨在培養具有扎實的現代生命科學理論基礎和熟練的操作技能與工程基礎知識、掌握計算機以及外語的高級專業人才。研究方向為生物大分子的結構與功能、基因分子生物學、人類與動物分子遺傳學、微生物代謝與調控以及植物基因工程等。該專業主要學習與基因工程、蛋白質工程等相關的基礎理論和操作技能。主要課程有：普通生物學、生物化學、神經生物學、微生物學、微生物原理、基因工程原理與方法、細胞工程、生化工程、酶與酶工程、發酵工程、計算機在生命科學中的應用、生命科學信息與情報、生命科學基礎講座等。示意圖

細胞

酶

(游離或固定化)

空氣

能量

提取精制

產品生物催化劑

副產品

滅菌

廢物

原料

基質或培養基生

物

反

應

器檢

測

控

制

系

統組成

原料的預處理——選擇、加工（物理或化學）、培養基的配制和滅菌；生物催化劑的制備——菌種的選擇、擴大培養和接種，酶的純化和固定化等；（核心）生物反應器及反應條件的選擇與監控——反應器的結構、操作方式、操作條件；反應

參數的檢測與控制；產物的分離純化——去除雜質，提高濃度。

以生物反應器為核心，之前反應上游加工；之后反應下游加工1.1.2生物反應過程的特點

一門綜合學科——生物學：生物化學、分子生物學、微生物學

化學：無機、有機、分析、物理

工程學：化學工程、機械工程；采用生物催化劑——酶

Enzyme；采用再生資源為原料——豐富、低廉，危害性小；難控制，質量不穩定；設備簡單，能耗低。1.1.3生物反應過程的分類

(1)

酶反應過程——游離、固定化酶(2)

細胞反應過程——微生物和動植物反應(3)

廢水的生物處理過程廢水的生物處理過程特點：①是由細菌等菌類、原生動物等各種微生物構成的混合培養系統；②幾乎全都采用連續操作；③微生物所處的環境條件波動大；④反應的目的是消除有害物質而不是生成代謝產物和微生物細胞本身；⑤不計成本。1.2生物工程

1.2.1生物工程的定義

人們以現代生命科學為基礎，結合先進的工程技術手段和其他基礎學科的科學原理，按照預先的設計改造生物體或加工生物原料，為人類生產出所需產品或達到某種目的。1.2.2.生物工程的分類：

基因工程(Geneengineering)

細胞工程(Cellengineering)酶工程(Enzymeengineering)發酵工程(Fermentationengineering)蛋白質工程(Proteinengineering)細胞工程微生物工程菌發酵工程產品蛋白質或酶蛋白質或酶工程基因工程優良動、植物品系動、植物個體或細胞基因工程、細胞工程、酶工程、發酵工程、蛋白質工程之間的相互關系

1.2.3.生物工程涉及的學科

學科眾多。分子生物學、微生物生理學、生物化學、免疫生物學等等。使用現代化器和設備——技術手段。

廣闊的應用前景；醫藥林業環境保護能源采礦冶金農業材料畜牧業化工表1-1重要的現代生物技術儀器和設備

名稱用途1DNA自動測序儀自動測定核酸的核苷酸2蛋白/多肽自動測序儀測定蛋白質、多肽的氨基酸序列3半自動DNA測序儀測定核酸的核苷酸序列4DNA自動合成儀合成已知寡核苷酸序列5蛋白/多肽自動合成儀的蛋白質或多肽6生物反應器細胞的連續培養7發酵罐微生物細胞培養8熱循環儀（聚合酶鏈式反應儀、PCR儀）DNA快速擴增9序列分析軟件核酸/蛋白質序列分析10基因轉移設備將外源DNA引進靶細胞11色譜軟件控制色譜儀、收集和處理數據12高效液相色譜儀物質的分離和純化及純度鑒定13電泳設備物質的分離和純化及純度鑒定14凝膠電泳系統蛋白質和核酸的分離和分析15毛細管電泳儀質量控制、組分分析16超速、高速離心機分離生物大分子物質17電子顯微鏡觀察細胞及組織的超微結構圖生物技術樹1.2.4生物工程的研究的內容

運用化學工程的原理與方法將生物技術的實驗室成果進行工業開發的一門學科。既為生物技術服務的化學工程。

化學工程的原理與方法——化學反應、原料的處理和產物的分離、能量的傳遞、設備的設計與放大、過程的控制和優化等一系列工程技術問題。化學工程——傳遞工程、分離工程、反應工程、化工熱力學、化工過程系統工程

工程分類——生物（生化）反應工程和生物分離工程1.3生物反應工程

1.3.1定義：研究生物反應動力學，反應器的結構、設計、放大以及反應器優化的一個重要學科。實質：生物反應過程中帶有共性的工程技術問題的學科。如何從生物現象中抽象出共性的內容從宏觀看

以獲得生物量為目的：

生物合成速率≈影響因素（生物體、基質、環境因素、操作條件等）

以獲得目的產物為目的：從微觀看轉錄與轉譯速率=（基因量、…….等)

調控速率=（表達速率、酶活力、……等）1.3.2反應器——生物反應過程的關鍵設備。

操作方式 產品的質量

操作條件產量

結構能耗

原因——物料的混合與流動傳質與傳熱

三傳一反

氧和基質的供養和傳遞等等1.3.3內容：

以生物反應動力學為基礎，通過運用傳遞過程原理、設備工程學、過程動態學及最優化原理等化學工程學的方法，進行生物反應過程的工程分析與開發，以及生物反應器的設計、放、操作和控制等。1971英國

阿特金遜

B.Atkinson采用生化反應工程術語1974

編寫《生化反應器》1979日本

山根恒夫

編《生物反應工程》1985德國

許蓋爾特Schugerl

專著《生物反應工程》

A.

生物反應動力學

動力學——研究工業生產中生物反應速率問題；影響生物反應速率的各種因素以及如何獲得最優的反應結果。

本征動力學（微觀動力學）

反應器動力學（宏觀動力系學）B.生物反應器

傳遞特性——傳質、傳熱和動量傳遞設計與放大——選型、操作方式、計算優化與控制——優化操作與優化設計、反應參數測定與控制。表生物反應過程特征的比較生物反應過程生物反應特征酶反應過程

細胞反應過程

微生物反應過程

動植物細胞培養過程

單一菌體培養系統

多菌體混合培養系統

反應水平分子水平單一群體水平生態系水平細胞或組織水平反應過程的復雜性簡單一般復雜很復雜基質的數量1-2基質

幾種基質

幾種基質幾種基質產物的數量

1-2種

菌體和幾種代謝產物

幾種菌體和二氧化碳，厭氧反應過程、甲烷

細胞或組織或幾種產物和二氧化碳

反應速率或生長速率

快一般慢很慢1.3.4發展歷史

a

釀酒、生產醬油和醋——容器

最簡單、最原始的生物反應器b.

1857Pasteur酵母發酵生產酒——控制——發酵罐c.

第一次世界大戰

深層培養技術、無菌空氣制備技術——分批、連續與流加操作d.

60年代固定化技術——新概念——生物反應器

e.70年代基因工程——特殊生物反應器

龍山文化（距今4000-4200年）已有酒具出現。公元前200年，作豆腐、醬油和釀醋。在我國最早的詩集《詩經》中就提出過采用厭氧進行亞麻浸漬處理。公元10年有了天花的活疫苗。龍山文化泛指中國黃河中、下游地區約當新石器時代晚期的一類文化遺存。因1928年首先在山東省章丘縣龍山鎮城子崖發現而命名。

20世紀中期前后生物化學工程學科的形成。20世紀后期（1970～80年）生物反應工程學科的形成。英國學者阿特金遜（1971）首次提出生化反應工程……。20世紀90年代基因工程與生物反應工程不斷融合、發展。1.3.5發展方向

新型生物反應器的研究與開發；各種描述生物反應過程的數學模型的建立；生產過程參數與控制手段的改進。生物反應工程與相關學科的關系1.4生物反應工程的研究方法

數學模型法——用數學語言表達生物法反應過程中各個變量之間的關系。

不能替代實驗研究。方法——機理模型或結構模型既過程機理出發推倒的。--------可外推使用半經驗模型\

經驗模型經驗法參考資料國外1975年日本學者合葉修一等《生物化學工程---反應動力學》1979年日本學者山根恒夫《生物反應工程》1985年德國學者許蓋特（Schugerl）《生物反應工程》1993年日本學者川瀨義矩《生物反應工程基礎》1994（02）年丹麥學者Nielsen等《生物反應工程原理》國內《生物反應工程原理》（1990和2003天津科技大學賈士儒）《生物工藝學》（1992華東理工大學俞俊棠等）《生化工程》（1993江南大學倫世儀）《生化反應動力學與反應器》（1996北京化工大學戚以政等）《生物反應工程》（2004戚以政等）《生物反應工程》2005浙江大學岑沛林等）《生物反應工程》（2005清華大學邢新會譯）作業：

1.什么是生物工程？它包括哪幾部分？

2.

生物工程對人類社會將產生怎樣的影響？

3.

什么是生物反應工程？其內容包括那些？

4.什么是生物反應過程？其內容包括那些？

預習：

1.

概念：解離常數、平衡常數、速度常數；

2.酶的生物化學知識。

第1章均相酶催化動力學

本章的重點：①米氏方程的兩種假設、兩種推導方式及其參數的物理意義；②實驗法求取米氏方程的動力學參數；③競爭性抑制劑和非競爭抑制劑的動力學方程的推導及判斷；④根據實驗數據，計算出動力學參數并判斷動力學類型。本章的難點：①米氏方程及抑制劑動力學等有關的推導；②酶失活動力學的意義及推導。1.1酶催化反應的基本特征

1.1.1酶的分類與命名

氧化還原酶類、轉移酶類、水解酶類、裂合酶類、異構酶類、合成酶類。1.1.

2酶的活力表示方法酶的催化效率與酶的轉換數是同一概念。催化中心活力酶活力——1kat=6×107U或

1μkat=60U1U=1.7×10-8

比活力——每1mg（1mL）蛋白質所具有的酶的單位數。U/mg或

kat/mg1.1.3酶的特性

生物催化劑，具有一般催化劑所特有的特性——不能改變反應的平衡點，只能改變反應速率，反應條件溫和。高效性；專一性；酶的催化作用需要輔因子——非蛋白質物質共同作用；金屬離子、有機物質——輔酶（緊密）、輔基（疏松）

酶是蛋白質——失活與變性。酶失活的原因與再生的可能性化學修飾（微觀變化）、空間障礙、高級結構的變化（宏觀變化）、多肽鏈的斷裂1.1.4酶的穩定方法

分類穩定化方法穩定的理由水溶性酶低溫（冷凍）保存難以被化學物質和蛋白質破壞添加鹽類

加入高濃度硫銨等后，酶高級結構的穩定性增加添加底物、輔酶等配體

常用

護酶活性中心，有利于酶分子高級結構的穩定性

添加多元醇

理由不明化學修飾，特別是分子架橋

穩定酶的高級結構或保護酶的活性中心

添加強變性劑

若能保護好一級結構，則可隨時再生

大量添加蛋白質

添加清蛋白等用于保護在稀薄狀態下易發生變性、失活的酶類添加有機溶劑

如加入丙酮，理由不明結晶化

有利于高級結構的穩定不溶性酶

固定化

常用能防止蛋白酶間的相互作用，其它理由不明1.2簡單的酶催化反應動力學

1.2.1概念：

反應速率：在均相反應中，一般以單位時間、單位體積中反應組分的改變量。對于恒容反應，V為常數，故

aA+bB

cC+dD

②平衡常數K意義：衡量反應進行程度大小的一個常數。K越大。表示反應進行程度越大，即反應進行的越完全；反之，K越，表示反應進行程度越小，即反應進行的越不完全。K是溫度的函數。③解離常數Ks：

aA+bB

cC+dD

Ks=1/K意義：衡量解離進行程度大小的一個常數。Ks越大。表示解離進行程度越大，即反應進行的越完全；反之，Ks越小，表示反解離進行程度越小，即解離進行的越不完全。Ks是溫度的函數。④（反應）速度常數（比速度）：aA+bB+??????lL+Mm+??????[A]=[B]=1mol?L-1時，則r=k。k與溫度、催化劑有關。物理意義：某在反應一定溫度下，反應物為單位濃度時的反應速度。反應快，k數值大。阿侖尼烏斯公式：

Lnk=(-E/RT)+InA零級反應動力學一級反應動力學

AB二級反應動力學A+BCk1k1連鎖酶反應ABC

k1k2如果A的初始濃度為a0，B和C的初始濃度為0，并且a+b+c=a0，則求得：[例]卵狀假單胞菌（Pseudomonaso

valis)在分批反應中先把葡萄糖轉變為葡萄糖內酯，再轉化為葡萄糖酸。此反應為一級反應，反應如下

GLP

求中間產物（葡萄糖內酯）濃度達到最大時所需要的時間tmax及其最大濃度值[L]max。已知反應常數k和k分別為0.87h-1和0.7h-1。G0(初始葡萄糖濃度）=0.38mg/mL。解：GLPt=0[G0]00t=0[G][L][P]k1k2k1k2當葡萄糖內酯達到最大值時，有所以即在1.28h時，葡萄糖內酯達到最大值15.5g/L1.2.2簡單的酶催化反應特點：

①簡單的酶催化反應動力學——一種反應物（底物）參與的不可逆反應。酶反應動力學基礎。

酶催化的水解反應、異構化反應和大部分裂解反應②對單一底物參與的簡單酶催化反應：

SP反應機理可表示為：

S+EESE+P根據質量作用定律，P的生成速率可表示為

rp=k+2[ES]=k+2XEk+2k+1k-11.2.3米氏方程

假設

在反應過程中，酶的濃度保持恒定，即e0=efree+X與底物濃度[S]相比，酶的濃度是很小的。故可以忽略有于生成中間復合物ES而消耗的底物；產物的濃度是很低的，因而產物的抑制作可以忽略，同時也不考慮P+EES這個逆反應的存在。(反應的初始狀態）

V.Henri于1902年根據轉化酶(invertase)，苦杏仁酶(emulsin)及淀粉酶(amylase)的實驗結果提出了反應速率方程①M——M方程

快速平衡學說（rapidequilibrium)原理:k+1＞＞

k-2

，k-1＞＞

k-2

即ESE+P反應慢，k+2較小，決定整個酶催化反應的速度。推導：

eo=e+Xk+1e[S]=k-1X

rp=k+2X動力學參數：KS為rP=1/2rP,max時的底物濃度，表示酶與底物相互作用的特性；rP,max表示當全部的酶分子都變成[ES]的反應速度；k+2表示單位時間內一個酶分子所催化底物發生反應的分子，即表示酶催化能力大小——轉換系數。（kcat)②B-H方程擬穩態學說原理：中間復合物濃度維持不變，即生成產物速度與分解產物速度相等。推倒：動力學參數：同M——M③兩種方程（學說）比較項目M—M方程B—H方程假設酶和底物生成不穩定復合物[ES]，酶催化反應是經中間復合物完成的。即[ES]在反應開始后與E及S迅速達到動態平衡k+1＞＞k-2，k-1＞＞k-2ES]的生成速率與其解離速率相等，其濃度不隨時間變化。底物濃度遠遠高于酶的濃度。[S]＞＞e0酶量守恒

e0=efree+X產物生成動力學動力學方程Ks與Kmk-1④擴展方程若米氏方程中e數值大（結果見書[例3-5]）存在多個中間復合物是，催化活性中心速率常數S1+ES1EK1有輔因子反應S2+ES2EK2S1E+S2S1S2EK12S2E+S1S1S2EK21S1S2EE+Pk雙底物反應E+CECKCEC+CECSKSECSE+C+Pk[例1]假設單底物S生成產物P的酶促反應機理下式，試建立可逆反應動力學方程。E,[S],X和[P]分別與下式對應的濃度。

E+S[ES]E+P

e[S]Xe[P]解：M-M：

rP=k+2X-k-2e[P]e=e+Xk+1[S]e=k-1Xk+2X=k-1e[P]

k+1k+1k--1k--2k+21.2.4動力學特征與參數求解動力學特征A.[S]＜＜Km（[S]＜0.01Km

），r為直線，B.[S]＞＞Km

（[S]＞100Km

），r為直線C.0.01Km

＜[S]＜100Km，r為曲線參數求解參數求解(a)Linewear-Bunk(b)Hane-Woolf

(c)Eadie-Hofstee(d）積分法參數求解L-B法，雙倒數法（常用）特點：濃度小時，誤差大；方便，快速。

H-W法特點：橫坐標均勻，易作圖，誤差小，便于分析E-H法（誤差小）特點：易作圖，誤差小，但不易測量積分法特點：誤差小，不經變量計算，工程上常用例2有一均相酶催化反應，Km值為2×10-3mol/L,當底物的初始濃度[S]0為1×10-5mol/L，若反應進行1min，則有2%的底物轉化為產物。試求：（1）當反應進行3min，底物轉化為產物的百分數是多少？此時底物和產物的濃度分別是多少？（2）當[So]為1×10-6mol/L，也反應了3min，底物轉化為產物的百分數是多少？（3）最大反應速率rmax值為多少？解（1）根據題意：[S]0＜＜0.01Km

ln([S]0/[S]）=（rmax/Km)t=Ktt=1min,Xs=0.02[S]=[S]0(1-XS)=0.98×10-5mol/L,K=0.0202min-1(2)[So]為1×10-6mol/L時，仍是一級反應，

t=3min,求得χ=6%[S]=0.94×10-5mol/L,[P]=6×10-6mol/L（3）K=rmax/Km=0.202min-1

rmax=4.04×10-5mol/(L?min)[例3]常溫下利用蔗糖酶水解蔗糖，蔗糖的初試濃度[S]0=1.0mmol/L，酶的初試濃度e0=0.001mmol/L

在實驗室反應器內進行分批操作，測得如下表中數據。試確定可否用米氏方程來描述反應速率，若可以，求Km和k+2。t/h1234567891011[S]/(mmol/L)0.840.680.530.380.270.160.090.040.0180.0060.005ln([S0]-[S])[S0]-[S]1.0901.2051.3511.5611.7942.1822.6263.3534.0915.1476.006

t[S0]-[S]6.2506.2506.3836.4526.8497.1437.6928.3339.16510.0611.028解：米氏方程轉換為Rmax/Km=1截距=-5.0846-1/Km=-5.0846Km=0.197mmol/Lk2=19.7/h1.3有抑制劑的酶催化動力學不可逆抑制劑——失活可逆抑制劑——競爭、非競爭、反競爭、混合(用透析等物理方法除去抑制劑)定義：凡能減慢或停止酶促反應的化合物稱抑制劑。作用機制：抑制劑的主要作用是直接或間接地影響酶活性中心，改變活性中心的三維構象，占據酶活性中心，從而使酶與底物的結合機率下降。1.3.1競爭性抑制的酶催化動力學概念：競爭性抑制劑和底物結構相似，能和底物分子競爭與酶的活性中心相結合，酶與抑制劑結合后，不能再與底物結合。

琥珀酸脫氫酶受丙二酸及草酰乙酸抑制。此二者競爭酶與底物的結合部位，但不能被酶催化脫氫，故一旦結合在活性中心部位，就抑制了酶與底物的結合

.機理

E+SESE+P

E+IEI推導:M-M：

rP=k+2X-e=e+X+[EI]k+1[S]e=k-1Xk-3[EI]=k+3

e[I]k+2k+3k-3k+1k-1方程圖形討論

A.Km[I]KmI

B.處理方法[S]＞＞

[I]可解除抑制[S]/r[S]無竟-kIm-km1.3.2非競爭性抑制的酶催化動力學

概念：機理推導方程圖形討論

[S]不能解除抑制

無有1/[S]1/rs核苷對霉菌酸性磷酸酯酶1.3.3反競爭性抑制的酶催化動力學

概念：機理E+S[ES]E+P[ES]+I[SEI]推導方程圖形討論

無反

肼對芳香基硫酸酯酶1/[S]1/r競爭性和非競爭性抑制示意圖1.3.4線性競爭性抑制的酶催化動力學

概念：機理E+SESE+PE+IEI

EI+SSEIES+ISEI推導方程圖形討論

A.KIS=KSI時，rSI為非競爭性抑制動力學；

B.KSI∞，

rSI為競爭性抑制動力學；

C.KSI∞，

rSI為反競爭性抑制動力學；

D.KIS=≠KSI，且為常數，rSI為混合競爭性抑制動力學

k+2KsαKsαKIKI1.3.5底物抑制的酶催化動力學

概念：機理E+S[ES]E+P[ES]+S[SES]推導方程圖形討論

1.3.6小結抑制形式最大速率米氏常數抑制百分數競爭性抑制rmax

Km(1+)非競爭性抑制rmax/(1+）Km反競爭性抑制rmax/(1+）Km/(1+)幾種抑制動力學的比較抑制百分數,表示抑制劑對酶催化反應抑制的程度[例]在含有相同酶濃度的五個反應物系中，分別加入不同濃度的底物，并測定其初始速率，然后再在五個反應物系中分別加入濃度為1×10-6mol/L的抑制劑，并測定其初始的反應速率，其數據如下表.試根據上述數據決定其抑制類型及動力學參數。底物初始濃度[S]0mmol/L

無抑制時速率rsommol/(L·min)有抑制時速率rSImmol/(L·min)0.1028180.1536240.2043300.5063510.707463解:由題意作L-B圖,有圖可知-1/Km=-4.16-1/KmI=-0.27，

-1/rmax=1×10-2

rmax=100Km=0.24KmI=0.44102KI=0.27-4.16-0.271.4復雜酶催化動力學A+B+C+???P+Q+R+???

隨機機制順序機制雙底物機制

有序機制乒乓機制

T-C機制1.4.1隨機機制1.4.2有序機制①順序機制②T-C機制③乒乓機制多底物反應可看成是一組反應。類似這樣反應多糖和蛋白質等高分子化合物的酶的水解反應是類似這樣反應。最初底物具有一定的聚合度分布，底物種類很多；一般高分子底物的聚合度越大，酶促的反應速率越大。1.5影響酶催化速率的因素內部酶的結構特性、底物的結構特性外部濃度因素：[E]、[S]、[P]、[I]、[A]等操作因素：T、P、pH、離子強度1.1.5pH對影響酶催化速率的因素pH對酶的影響的兩個方面′pH對酶穩定性影響（臺形）pH對酶活性影響（鐘形）產生的原因：

pH改變酶的活性中心，即改變其解離狀態，從而反應速率。1.5.1pH值的影響

Michaelis假設①假定酶分子有兩個可解離的基團，隨著pH值的變化，分別呈現出EH2、EH-及E2-三種狀態模型，既EH2

EH-E2-酸性條件下，酶呈現EH2狀態；當pH增加，酶以EH-狀態存在；當pH繼續增加，酶以E2-狀態在。②

上述三種解離狀態中，只有EH-型具有催化活性。③底物的解離狀態不變。④速率控制步驟為由EHS-生成產物的速率。

-H++H++H+-H+pH反應機制S推導：

-rs=rp=k+2[EHS-]E0=[EH2]-+[EH-]+[E2-]+[EH2S]+[EHS-]+[ES2-]方程討論：

1.5.2溫度的影響影響：

A.在較低溫度的范圍內，θ、r總

B.在較高溫度的范圍內，θ、r總動力學模型Arrhenius公式：溫度與反應速率的關系Eryring過渡理論：實驗建立模型(a)1.6酶的失活動力學影響酶活力因素：高溫、pH、有機溶劑等；失活模型：雙狀態模型多狀態模型機理

kdND

krDNDN1.6.1失活速率的實驗測定失活曲線：在一定條件下，使酶溶液恒溫保持一定時間，間隔時間定時取樣，在酶的最適pH、溫度條件下測定其活力，以殘存酶活力與失活處理時間作圖，即得失活曲線。分析：

A.均勻時間間隔取樣

B.測定時間一致

C.注意有無底物

D.在最適pH、溫度1.6.2酶的熱穩定動力學熱穩定曲線：在一定條件下，使酶溶液不同的恒溫中保持一定時間，在酶的最適pH、溫度條件下測定其活力，以殘存酶活力與失活處理溫度作圖，即得該活曲線。表示酶的熱穩定性雙模型機理kr推導：

e0=et-[D]

利用初始條件t=0,et=e0，解方程方程：

（可逆）①（不可逆）②討論大多數熱失活模型服從②大多數pH失活模型服從①半衰期t1/2=ln2/kd；表示酶活力衰減的程度，是酶的穩定性參數；若考慮溫度與時間的關系，則1.6.3反應時酶的熱失活動力學

——操作穩定性

操作穩定性

：

酶在反應中的穩定性；機理：

E+S[ES]E+P

DD+S方程：

δkdk+1k-1k+2kdet=ef

+X分析

A.δ=1時，底物對酶失活沒影響。B.δ=0時，酶完全被底物所保護，復合物[ES]完全不失活，此時只有游離酶失活。C．0<δ<1時，底物對酶有部分保護作用，能在一定程度上抑制酶的失活。D．δ>1時，底物加速酶的失活。E．若只有游離酶失活時，其分批反應的動力學方程F．如果還要考慮到在反應時溫度對酶失活的影響。顯然其速率方程更加復雜。這里只討論零級不可逆酶催化反應的情況。對零級不可逆反應，[S]值趨于無窮大，因此有

對該式積分，得到當[s]足夠大時，上式可簡化為

進行積分得到

復習題：復雜酶催化動力學模型有哪幾類型？Michaelis假設怎樣描述pH對酶催化反應速率的影響？酶失活速率測定的方法？產物很高時，反應機制為

E+S[ES]E+PE+P[EP]試推導其反應速率方程。k-3k+3k-1k+1k+2第2章

固定化酶催化反應過程動力學

本章重點：①影響固定化酶性質動力學因素；

②Da準數與φ準數的意義；本章難點：①內擴散動力學模型建立原理；②外擴散動力學模型建立原理

酶與細胞的應用：

①

cheese生產：牛奶+凝乳蛋白酶；②

淀粉糖生產：大米（玉米）+α-淀粉酶+β-淀粉酶+異淀粉酶；③

原料處理：酒精、甘油、乳糖、氨基酸；④

生絲脫膠：絲蛋白（絲膠包裹著）——胰蛋白酶、木瓜蛋白酶處理脫膠；⑤

醫藥生產：L-氨基酸⑥

有機酸生產：L-蘋果酸

固定化黃色短桿菌⑦

如用固定化氨基酸酰化酶生產L—氨基酸；⑧

固定化青霉素酰胺酶水解青霉素G生產6—氨基青霉烷酸；⑨

固定化葡萄糖異構酶生產高果糖漿；⑩

固定化糖化酶生產葡萄糖固定化酶定義定義：固定化酶亦稱固相酶或水不溶酶。它是通過物理或化學的方法使溶液酶轉變為在一定的空間內其運動受到完全約束、或受到局部約束的一種不溶于水，但仍具活性的酶。它能以固相狀態作用于底物進行催化反應。優點：不僅固定化酶可以反復使用，而且產物不受污染容易精制；固定化后的酶大多數情況下其穩定性增加，僅有少數的穩定性下降；固定化酶有一定的形狀和一定的機械強度，可以裝填在反應器中長期使用，便于實現生產連續化和自動化。固定化酶方法：

載體結合法、交聯法、包埋法

1.載體結合法：將酶結合于水不溶性載體的一種固定化方法。根據結合的形式不同，又可分為物理吸附法、離子結合法和共價結合法等。A.物理吸附法：指酶被物理吸附于不溶性載體的一種固定化方法。載體有活性炭、多孔玻璃、氧化鋁、硅膠、淀粉、合成樹脂等。

特點：酶活性中心不易被破壞，酶結構變化少的優點，但它有酶與載體相互作用力弱，酶易脫落的缺點。

1.載體結合法：B.離子結合法：酶通過離子鍵結合于具有離子交換基的水不溶性載體的固定化方法。此法的載體有多糖類離子交換劑和合成高分子離子交換樹脂。例如DEAE—纖維素、GM—纖維素等特點：操作簡單，條件溫和，酶的高級結構和活性中心的氨基酸殘基不易被破壞，能得到酶活回收率較高的固定化酶。但是載體與酶的結合力較弱，容易受緩沖液種類或pH的影響，在離子強度高的條件下反應時，酶易從載體上脫落。1.載體結合法：C共價結合法：酶以共價結合于載體的固定化方法，它是載體結合法中應用最多的一種。此法或是將載體有關基團活化，然后與酶有關基團發生偶聯反應；或是在載體上接一個雙功能試劑，然后將酶偶聯上去。可與載體結合的酶的功能團有氨基、羧基、羥基、酚基等。特點：共價結合法反應條件比較苛刻，操作復雜，并且易引起酶高級結構產生變化，破壞了部分活性中心，酶活回收率一般為30％左右。代表性的方法有重氮法、溴化氰法等。2.交聯法雙功能或多功能試劑使酶與酶之間交聯的固定化方法。此法與共價結合法一樣也是利用共價鍵固定酶的，不同的是它不使用載體。做為交聯劑的有形成希夫堿的戊二醛、形成肽鍵的異氰酸酯、發生重氮偶合反應的雙重氮聯苯胺等。特點：應用條件較激烈、酶活回收率低。3.包埋法

分網格型和微囊型網格型：埋在高分子凝膠細微網格中的方法。微囊型：包埋在高分子半透膜中的方法。特點：包埋法一般很少改變酶的高級結構，酶活回收率較高，因此可用于許多酶的固定化，但必須巧妙地設計反應條件。適合范圍：小分子底物和產物的酶，因為只有小分子才可以通過高分子凝膠的網格進行擴散。

固定化酶的模式(5)疏水作用；（6）脂質體包埋；（7）微膠囊2.1固定化酶催化的動力學特征

酶固定化后性質的變化評價固定化酶指標：酶活力表現率和酶活力收率影響固定化酶動力學的因素固定化酶反應動力學2.1固定化酶催化的動力學特征

酶固定化后性質的變化：①

底物專一性的改變：②

pH的改變③

穩定性——熱的穩定性、貯藏穩定性、操作穩定性④

動力學的改變。原因：①酶自身的變化——主要由于活性中心氨基酸殘基、空間結構和電荷狀態變化；②載體的物理和化學性質的變化。大多數酶在固定化后，其Km值增加，表示

催化反應活性將下降。也有少數酶固定化后活性無變化，甚至有所增大。評價這種活性變化可用下述兩種指標來衡量：酶活力表現率和酶活力收率。酶活力表現率（相對活力）：實際測定的固定化酶的總活力與被固定化了的酶在溶液狀態時的總活力之比。酶活力收率（活力回收）：實際測定的固定化酶的總活力與固定化時所用的全部游離酶的活力之比。上述兩種指標之差別在于是否考慮了所剩余的未被固定化的酶。

影響固定化酶動力學的因素分子構象的改變位阻效應微擾效應分配效應擴散效應固定化酶反應歷程①底物從液相主體傳向固定化酶周圍的滯流液層（外表面）；②底物擴散通過這一滯流液層到載體外表面；③進行酶促反應；④底物由載體外表面向載體內擴散；⑤產物由內部擴散到載體外表面；⑥產物由載體外表面到滯流液層；⑦產物由滯流液層傳遞到主體溶液當酶固定化于載體的外表面時，沒有④和⑤兩個階段。①和②、⑥和⑦是屬于外擴散過程，④、⑤則為內擴散過程。可以看出，固定化酶的催化反應受到了物質傳遞和酶促反應兩個方面的影響。固定化酶反應歷程影響固定化酶動力學的因素

（1）分子構象的改變：指固定化過程中酶和載體的相互作用引起酶的活性中心或調節中心的構象發生了變化，導致酶與底物的結合活力下降的一種效應。特點：難以定量描述與預測。多出現于吸附法和共價偶聯法的固定化酶中。（2）位阻效應：載體的遮蔽作用(如載體的空隙太小，或者固定化位置或方法不當，給酶的活性中心或調節中心造成空間障礙，使底物和效應物無法與酶接觸等)引起的。特點：選擇適宜的載體與固定化方法，可消除這種不利因素的影響，但這種效應難以定量描述與預測。（3）微擾效應由于載體的親水性、疏水性及介質的介電常數等，使緊鄰固定化酶的環境區域(微環境)發生變化，改變了酶的催化能力及酶對效應物做出調節反應的能力。特點：這種效應難以定量描述和預見，但可以通過改變載體與介質的性質而做出判斷與調節。空間效應模擬圖（4）分配效應

分配效應是由于固定化載體與底物或效應物之間的疏水性，親水性及靜電作用所引起微環境(固定化酶緊鄰的微觀局部環境)和宏觀環境之間物質的不等分配，改變了酶反應系統的組成平衡，從而影響酶反應速率的一種效應。

（4）分配效應分配效應可以通過分配系數Kp來定量描述。Kp的定義是載體內外底物(或其他物質)濃度之比。測定Kp方法：在已知濃度和體積的底物溶液中，放人不含底物的一定體積的載體，并保持適宜條件，當達到平衡時，測定載體外溶液中的底物濃度。（5）擴散限制指底物、產物及其他效應物的遷移和傳遞速度所受到的一種限制。

物質的傳遞過程包括分子擴散和對流擴散。這種擴散過程的速率在某些情況下可能會對反應速率產生限制作用。

擴散限制效應可分為外擴散限制效應和內擴散限制效應。

分配效應與擴散效應分配效應擴散效應分配和擴散效應同時作用固定化酶剖面圖及濃度分布圖固定化酶反應動力學本征動力學

指酶的真實動力學行為，包括溶液酶和固定化酶在內。對后者，它僅將空間效應的影響考慮在內。從這個意義上講，固定化酶的本征動力學與溶液酶的本征動力學是有差別的。固有動力學

在本征動力學的基礎上，僅僅考慮由于這種分配效應而造成的濃度差異對動力學產生的影響，所建立的動力學稱為固有動力學

表觀動力學表觀動力學不論分配效應是否存在，固定化酶受到擴散限制時