第節2基因工程的基本操作程序高中生物選擇性必修3第3章闡明基因工程的原理和基本操作程序。針對人類生產或生活中的某一需求，選取適當的基因工程的技術和方法，嘗試設計獲得某一轉基因產品的方案。嘗試進行PCR的基本操作并用電泳鑒定PCR的產物學習目標一、目的基因的獲取1、目的基因主要是指______________________編碼蛋白質的基因例如，與生物抗逆性、優良品質、生產藥物、毒物降解和工業用酶等相關的基因等。2、獲取目的基因的常用方法有哪些?（一）人工合成（DNA合成儀）（二）利用PCR技術擴增（三）從基因文庫中獲取（一）通過DNA合成儀用化學方法人工合成DNA合成儀蛋白質的氨基酸順序mRAN核苷酸序列基因DNA的核苷酸序列目的基因推測推測合成

當基因比較小、蛋白質的氨基酸序列可以測得或核苷酸序列已知時，可采用此種方法。DNA合成儀1、概念：PCR全稱為_______________，是一項在生物____復制___________的核酸合成技術通過這項技術可在短時間內大量擴增目的基因。

整個過程是在體外進行，故又叫做體外DNA擴增技術。聚合酶鏈式反應體外特定DNA片段2、PCR利用的原理是什么？DNA復制（二）利用PCR獲取和擴增目的基因（常用）3、方式：以_____方式擴增，即____（n為擴增循環的次數）

指數2n（2）4種脫氧核苷酸(dNTP)

（5）一對引物：（3）熱穩定DNA聚合酶(Taq酶）（1）DNA模板(需含有目的基因)

5、條件：引物是一段核苷酸序列，與目的基因的起始段互補。有一段已知目的基因的核苷酸序列，以便根據這一序列合成引物。4、前提：（4）溫度控制IMN變性復性延伸PCR擴增過程是怎樣的？PCR過程（三次）925575℃延伸925575℃變性925575℃退火925575℃3`5`5`3`Taq聚合酶引物1引物2原料模板DNA目的基因925575℃變性3`5`5`3`925575℃退火925575℃延伸925575℃變性925575℃退火925575℃延伸925575℃變性925575℃退火925575℃延伸PCR技術擴增過程a、DNA變性（90℃-95℃）：雙鏈DNA模板在熱作用下，

斷裂，形成_______

b、復性（55℃-60℃）：系統溫度降低，引物與DNA模板結合，形成局部________。c、延伸（70℃-75℃）：在TaqDNA聚合酶的作用下，從引物的___________延伸，合成與模板互補的___________。氫鍵單鏈DNA雙鏈DNA鏈5′端→3′端測一測（三）從基因文庫中直接獲取（拓展）1.什么是基因文庫？2.按外源DNA片段的來源分類基因文庫分為哪幾類？種類基因組文庫：含有一種生物的全部基因部分基因文庫：只包含了一種生物的部分基因，如：cDNA文庫3.建構基因文庫的目的是什么？為了在不知目的基因序列的情況下，便于獲得所需的目的基因。4.怎樣從基因文庫中得到我們所需要的目的基因？★基因文庫的構建（1）基因組文庫的構建提取某生物全部DNA用適當限制酶切割許多DNA片段與載體連接導入受體菌群該生物基因組文庫（每個受體菌含有一段不同的DNA片段）基因組文庫（2）cDNA文庫的構建——mRNA反轉錄形成與載體連接導入受體菌群mRNA逆轉錄酶雜交雙鏈核酸酶H單鏈DNADNA聚合酶雙鏈DNA(cDNA)該生物cDNA文庫第一步，反轉錄酶以RNA為模板合成一條與RNA互補的DNA單鏈，形成RNA-DNA雜交分子。第二步，核酸酶H使RNA-DNA雜交分子中的RNA鏈降解，使之變成單鏈的DNA。第三步，以單鏈DNA為模板，在DNA聚合酶的作用下合成另一條互補的DNA鏈，形成雙鏈DNA分子。

基因組文庫和部分基因文庫質粒目的基因限制酶DNA連接酶重組DNA——核心二、基因表達載體的構建（1）用一定的_________切割質粒，使其出現一個切口，露出_________。（2）用_____________切斷目的基因，使其產生_________________。（3）將切下的目的基因片段插入質粒的______處，再加入適量___________，形成了一個重組DNA分子（重組質粒）。限制酶黏性末端同一種限制酶的黏性末端切口DNA連接酶相同基因表達載體的構建——核心質粒DNA分子一個切口兩個黏性末端兩個切口獲得目的基因DNA連接酶重組DNA分子（重組質粒）同一種限制酶

目的基因與運載體的結合過程，實際上是不同來源的基因重組的過程。

科學家在培育抗蟲棉時，經過了許多復雜的過程和不懈的努力，才獲得成功。起初把蘇云金芽孢桿菌的抗蟲基因插入載體質粒中，然后導入棉花的受精卵中，結果抗蟲基因在棉花體內沒有表達。然后在插入抗蟲基因的質粒中插入啟動子(抗蟲基因首端)，導入棉花受精卵，長成的棉花植株還是沒有抗蟲能力。科學家又在有啟動子、抗蟲基因的質粒中插入終止子(抗蟲基因末端)，導入棉花受精卵，結果成長的植株，有了抗蟲能力。資料:開闊眼界：1.原核細胞的基因結構非編碼區非編碼區編碼區編碼區上游編碼區下游與RNA聚合酶結合位點啟動子終止子啟動子：位于基因首端一段能與RNA聚合酶結合并能起始mRNA合成的序列。沒有啟動子，基因就不能轉錄。RNA聚合酶:能夠識別啟動子上的結合位點并與其結合的一種蛋白質.(以模板轉錄然后脫落)終止子：位于基因的尾端的一段特殊的DNA片斷，它能阻礙RNA聚合酶的移動，并使其從DNA模板鏈上脫離下來，使轉錄終止。編碼區非編碼區非編碼區與RNA聚合酶結合位點內含子外顯子能夠編碼蛋白質的序列叫做外顯子不能夠編碼蛋白質的序列叫做內含子啟動子終止子編碼區上游編碼區下游內含子：外顯子：開闊眼界：2.真核細胞的基因結構1、基因表達載體的組成：2、目的：使目的基因在受體細胞中穩定存在，并且可以遺傳給下一代，同時使目的基因能夠表達和發揮作用。a、目的基因b、啟動子c、終止子d、標記基因三、將目的基因導入受體細胞1、轉化：2、分類（一）將目的基因導入植物細胞（二）將目的基因導入動物細胞

（三）將目的基因導入微生物細胞

目的基因進入_________內，并且在受體細胞內維持_____和_____的過程。受體細胞穩定表達（一）將目的基因導入植物細胞（1）農桿菌轉化法（采用最多）（2）基因槍法（3）花粉管通道法1、方法（1）農桿菌轉化法（采用最多）①農桿菌轉化法的原理是什么？②農桿菌轉化法適用于那些植物？1、方法：顯微注射法（采用最多；最有效）（二）將目的基因導入動物細胞2、操作的程序是怎樣的？1、為什么選用微生物作為受體細胞？（三）將目的基因導入微生物細胞2、操作的程序是怎樣的？3、什么是感受態細胞？用什么處理得到？2023/2/2四、目的基因的檢測與鑒定目的基因進入受體細胞后，是否穩定維持和表達其遺傳特性，只有通過檢測與鑒定才能知道。1.分子水平的檢測（1）PCR等技術檢測受體細胞的染色體DNA上是否插入了目的基因檢測目的基因是否轉錄出了mRNA

在含有目的基因的DNA片段上用放射性同位素等作標記，以此作為探針，使探針與基因組DNA或mRNA雜交，若出現雜交帶，則目的基因插入成功或轉錄出相應的mRNA。2023/2/2（2）抗原—抗體雜交技術檢測目的基因是否翻譯成相應的蛋白質。

從轉基因棉花中提取蛋白質，用相應的抗體進行抗原-抗體雜交，若出現雜交帶，則目的基因成功翻譯出蛋白質。2.個體生物學水平的檢測轉基因生物鑒定方法成功標志抗蟲植物抗病毒（菌）植物抗鹽植物抗除草劑植物獲取目的基因產物的轉基因生物飼喂害蟲（抗蟲接種實驗）害蟲死亡病毒（菌）感染（抗病接種實驗）未出現病斑鹽水澆灌正常生長噴灑除草劑正常生長提取細胞產物與天然產品進行功能活性比較功能、活性正常2023/2/21.在實際種植過程中，棉鈴蟲是否對轉Bt基因的抗蟲棉產生了嚴重的抗性？證據是什么？到社會中去

科研人員對長江流域種植的轉基因抗蟲棉進行了監測，2011年的數據顯示，大部分轉基因抗蟲棉品種的抗蟲性屬于中抗及高抗水平；2013年的數據表明，如果棉田周圍存在大量天然庇護所，靶標害蟲棉鈴蟲、紅鈴蟲等并未對轉Bt基因的抗蟲棉產生明顯抗性。在我國、澳大利亞、印度等國的多個實驗室中，通過毒素的連續抗性篩選，已經培育出多個高抗水平的轉基因抗蟲棉品種。2023/2/22.科研工作者在沒有發現棉鈴蟲出現抗性之前，就應該想辦法應對。他們想出的延緩棉鈴蟲對Bt抗蟲蛋白產生抗性的措施有哪些？這些措施的原理是什么？有效嗎？到社會中去

科研人員想出的延緩棉鈴蟲對Bt抗蟲蛋白產生抗性的措施有很多，主要可以分為以下幾個方面。（1）基因策略。該策略是在分子水平上提高轉基因抗蟲棉的抗蟲性和抗蟲持久性。包括在棉花中轉入多個殺蟲基因、構建組織特異性表達的啟動子、提高殺蟲基因的表達量等。例如，最早種植的抗蟲棉中只轉入了一種Bt基因，抗性比較單一；現在經常將兩種或兩種以上的Bt基因(如CrylAa和CrylAc基因)同時轉入棉花細胞，這樣既可以提高殺蟲活性，又可以延緩害蟲抗性的產生和發展，還可以通過不同基因間的互補作用擴大抗蟲范圍。（2）田間策略。這是在種植時采取的措施，如提供庇護所、與其他作物輪作或套種等。例如，在澳大利亞和美國等地普遍采取的措施是在轉基2023/2/2到社會中去因棉田中，總面積的4%種植不使用任何殺蟲劑的非轉基因棉花，或在轉基因棉田周圍種植20%～30%面積的可使用化學殺蟲劑的非轉基因棉花；在印度，一些地區要求，在轉基因棉田周圍至少種植5行或者20%面積的非轉基因棉花。我國除新疆棉區及大型農場需設計專門的庇護所外，其他棉區如長江、黃河流域棉區多采用多種作物混作的耕作制度(如將轉基因抗蟲棉與番茄、向日葵、高梁、玉米、辣椒等棉鈴蟲寄主作物混作)，這些作物可以構成天然的庇護所，一般無須種植非轉基因棉花作為庇護所。這樣做的原理是為少部分害蟲提供一個正常的取食環境，始終保持一定的敏感目標害蟲種群。這樣，即使目標害蟲對轉基因抗蟲棉產生了抗性，但是因為其與敏感目標害蟲交配，后代抗性基因會發生分離，所以抗性目標害蟲的種群也不至于迅速增加。（3）國家宏觀調控策略。該策略包括實施分區種植管理、加強抗性監測、進行嚴格的安全生評價等。2023/2/2探究·實踐·DNA片段的擴增及電泳鑒定（一）實驗原理1.利用PCR在體外進行DNA片段擴增的原理：（1）PCR利用了DNA的熱變性原理，通過調節溫度來控制DNA雙鏈的解聚與結合，PCR儀實質上就是一臺能夠自動調控溫度的儀器。（2）PCR擴增DNA片段還利用了DNA半保留復制的原理。一次PCR一般要經歷30次循環。2.DNA片段電泳鑒定的原理：（1）DNA分子具有可解離的基團，在一定的pH下，這些基團可以帶上正電荷或負電荷，在電場的作用下，這些帶電分子會向著與它所帶電荷相反的電極移動，這個過程就是電泳。（2）PCR的產物一般通過瓊脂糖凝膠電泳來鑒定。在凝膠中DNA分子的遷移速率與凝膠的濃度、DNA分子的大小和構象（遷移速率與之呈負相關）等有關。（3）凝膠中的DNA分子通過染色，可以在波長為300nm的紫外燈下被檢測出來。10倍濃縮的擴增緩沖液（含Mg2+）5μL20mmol/L的4種脫氧核苷酸的等量混合液（實為dNTP）1μL20μmol/L的引物Ⅰ2.5μL20μmol/L的引物Ⅱ2.5μLH2O28～33μL1-5U/μL的TaqDNA聚合酶（即耐高溫的DNA聚合酶）1～2U模板DNA（用量為1pg-1μg）5～10μL總體積50μL2023/2/2（二）材料用具1.試劑：（1）無菌水、瓊脂糖；（2）電泳緩沖液（TAE或TBE）；（3）凝膠載樣緩沖液（內含指示劑——溴酚藍）；（4）核酸染料（常用核酸染料為EB即溴化乙錠）。（5）PCR反應體系的配方2023/2/22.用具：（1）PCR儀（自動控溫，實現DNA的擴增）；（2）微量離心管（實際上是進行PCR反應的場所）；（3）微量移液器（用于向微量離心管轉移PCR配方中的液體）；（4）一次性吸液槍頭（微量移液器吸取一種試劑更換一次槍頭）；（5）電泳裝置（包括電泳儀、電泳槽等）1.DNA片段的擴增移液用微量移液器按照PCR反應體系配方或PCR試劑盒的說明書，在微量離心管中依次加入各組分離心待所有組分都加入后，蓋嚴離心管的蓋子，將微量離心管放入離心機里，離心約10s，使反應液集中在離心管的底部（提高反應速率）反應參照下表的參數，設置好PCR儀的循環程序。將裝有反應液的微量離心管放入PCR儀中進行反應。循環程序變性復性延伸預變性94℃,5min//30次94℃,30s55℃,30s72℃,1min最后一次94℃,1min55℃,30s72℃,1min可根據目的片段長度適當調整延伸時間2023/2/2（三）方法步驟預變性：使DNA充分變性，以利于引物更好地和模板結合。配制瓊脂糖溶液根據待分離DNA片段的大小，用電泳緩沖液配制瓊脂糖溶液，一般配制質量體積比0.8%～1.2%的瓊脂糖溶液。在沸水浴或微波爐內加熱至瓊脂糖熔化。稍冷卻后，加入適量的核酸染料混勻制備凝膠將溫熱的瓊脂糖溶液迅速倒入模具，并插入合適大小的梳子，以形成加樣孔。待凝膠溶液完全凝固，小心拔出梳子，取出凝膠放入電泳槽內。將電泳緩沖液加入電泳槽中，電泳緩沖液沒過凝膠1mm為宜加樣將擴增得到的PCR產物與凝膠載樣緩沖液（內含指示劑）混合，再用微量移液器將混合液緩慢注入凝膠的加樣孔內。留一個加樣孔加入指示分子大小的標準參照物電泳接通電源，根據電泳槽陽極至陰極之間的距離來設定電壓，一般為1～5V/cm。待指示劑前沿遷移接近凝膠邊緣時，停止電泳觀察記錄取出凝膠置于紫外燈下觀察和照相2023/2/22.DNA片段的電泳鑒定2023/2/2（四）注意1.為避免外源DNA等因素的污染，PCR實驗中使用的微量離心管、槍頭和蒸餾水等在使用前必須進行高壓滅菌處理。2.該實驗所需材料可以直接從公司購買，緩沖液和酶應分裝成小份，并在-20℃儲存。使用前，將所需試劑從冰箱拿出，放在冰塊上緩慢融化。3.在向微量離心管中添加反應組分時，每吸取一種試劑后，移液器上的槍頭都必須更換。4.在進行操作時，一定要戴好一次性手套。5.PCR擴增不能隨意加大試劑用量。2023/2/2結果分析與評價1.你是否成功擴增出DNA片段？判斷的依據是什么？2.你進行電泳鑒定的結果是幾條條帶？如果不止一條條帶，請分析產生這個結果的可能原因。

可以在紫外燈下直接觀察到DNA條帶的分布及粗細程度來評價擴增的結果。進行電泳鑒定的結果應該是一條條帶，該片段大小約為750bp。

如果擴增不成功，可能的原因有：漏加了PCR的反應成分，各反應成分的用量不當，PCR程序設置不當等。如果擴增結果不止一條條帶，可能的原因有：引物設計不合理，它們與非目的序列有同源性或容易形成二聚體；退火溫度過低；DNA聚合酶的質量不好等。總結:基因工程的基本操作程序獲取目的基因人工合成利用PCR從基因文庫構建基因表達載體目的基因、啟動子、終止子、標記基因將目的基因導入受體細胞植物細胞、動物細胞、微生物細胞目的基因的檢測與鑒定檢測：是否插入、轉錄、翻譯1.作為基因工程表達載體，只需含有目的基因就可以完成任務嗎？為什么？不可以。因為目的基因在表達載體中得到表達并發揮作用，還需要有其他控制元件，如啟動子、終止子和標記基因等。必須構建上述元件的主要理由是：（1）生物之間進行基因交流，只有使用受體生物自身基因的啟動子才能比較有利于基因的表達；（2）通過cDNA文庫獲得的目的基因沒有啟動子，只將編碼序列導入受體生物中無法轉錄；（3）目的基因是否導入受體生物中需要有篩選標記；（4）為了增強目的基因的表達水平，往往還要增加一些其他調控元件，如增強子等；思考探究2、利用大腸桿菌可以生產出人的胰島素，聯系前面有關細胞器功能的知識，結合基因工程操作程序的基本思路，思考一下，若要生產人的糖蛋白，可以用大腸桿菌嗎？

有些蛋白質肽鏈上有共價結合的糖鏈，這些糖鏈是在內質網和高爾基復合體上加工完成的，內質網和高爾基復合體存在于真核細胞中，大腸桿菌不存在這兩種細胞器，因此，在大腸桿菌中生產這種糖蛋白是不可能的。（5）有時需要確定目的基因表達的產物存在于細胞的什么部位，往往要加上可以標識存在部位的基因，如綠色熒光蛋白基因等3、β-珠蛋白是動物血紅蛋白的重要組成成分。當它的成分異常時，動物有可能患某種疾病，如鐮刀形細胞貧血癥。假如讓你用基因工程的方法，使大腸桿菌生產出鼠的β-珠蛋白，想一想，應如何進行設計？（1）從小鼠中克隆出β-珠蛋白基因的編碼序列（cDNA）。（2）將cDNA前接上在大腸桿菌中可以適用的啟動子，另外加上抗四環素的基因，構建成一個表達載體。（3）將表達載體導入無四環素抗性的大腸桿菌中，然后在含有四環素的培養基上培養大腸桿菌腸桿菌。如果表達載體未進入大腸桿菌中，大腸桿菌會因不含有抗四環素基因而死掉；如果培養基上長出大腸桿菌菌落，則表明β-珠蛋白基因已進入其中。（4）培養進入了β-珠蛋白基因的大腸桿菌，收集菌體，破碎后從中提取β-珠蛋白。當堂檢測1.

下列不屬于獲得目的基因的方法的是（）從基因文庫中獲取B.利用人工合成法獲得C.利用PCR技術大量獲得D.利用農桿菌轉化法獲得 【答案】D【解析】基因工程中獲取目的基因的方法有三種：從基因文庫中獲取目的基因、利用PCR技術擴增目的基因、人工合成法（包括反轉錄法和化學合成法）獲得目的基因。2.聚合酶鏈式反應（PCR）是一種體外迅速擴增DNA片段的技術。PCR過程一般經歷下述若干次循環：90℃以上使模板DNA解聚為單鏈→50℃左右下復性（引物與DNA模板鏈結合）→72℃下引物鏈延伸（形成新的脫氧核苷酸鏈）。下列有關PCR反應過程的敘述中，不正確的是（）A.變性過程中破壞的是DNA分子內堿基對之間的氫鍵，也可利用解旋酶實現B.復性過程中引物與DNA模板鏈的結合依靠堿基互補配對原則完成C.延伸過程中需要DNA聚合酶、ATP、四種核糖核苷酸D.PCR技術與細胞內DNA復制相比，所需要酶的最適溫度較高【答案】C【解析】聚合酶鏈式反應（PCR）是一種體外迅速擴增DNA片段的技術，相當于DNA的大量復制。所以在形成新的DNA過程中，所需要的原料是四種脫氧核苷酸。A.基因工程的核心步驟是基因表達載體的構建B.基因表達載體的構建并不一定相同C.圖中啟動子位于目的基因的首端，是核糖體識別和結合的部位D.抗生素抗性基因的作用是作為標記基因，用于鑒別受體細胞中是否導入了目的基因 【答案】C【解析】由于受體細胞有植物、動物、微生物之分，以及目的基因導入受體細胞的方法不同，因此基因表達載體的構建也會有所差別，不可能是千篇一律的；啟動子是一段有特殊序列結構的DNA片段，位于目的基因的上游，它是RNA聚合酶識別和結合的部位，有了它才能驅動基因轉錄出mRNA。3.

下圖為基因表達載體的模式圖，下列有關基因工程中載體的說法，錯誤的是（）4.下圖是利用基因工程培育抗蟲植物的示意圖。以下相關敘述，正確的是（）A.⑤只要表現出抗蟲性狀就表明植株發生了可遺傳變異B.③侵染植物細胞后，重組Ti質粒整合到④的染色體上C.④的染色體上若含抗蟲基因，則⑤就表現出抗蟲性狀D.②的構建需要限制性內切核酸酶和DNA聚合酶參與 【答案】A【解析】⑤為轉基因植物，只要表現出抗蟲性狀就說明轉入的目的基因成功表達了，基因工程的原理是基因重組，屬于可遺傳變異，A項正確；③侵染植物細胞后，重組Ti質粒上的T-DN