免疫磁珠分離技術及其應用前言免疫磁珠分離技術介紹免疫磁分離技術的應用一、前言免疫磁珠分離技術(Immunomagneticbeadssep—arationtechniques，IMB)是將免疫學反應的高度特異性與磁珠特有的磁響應性相結合的一種新的免疫學技術；是一種特異性強、靈質純化敏度高的免疫學檢測方法和抗原純化手段。是近年來國內外研究較多的一種新的免疫學技術。目前該項技術在細胞分離、蛋白、免疫學及微生物學檢測等方面均取得了較大的進展，是目前最有推廣價值的技術之一。二、免疫磁珠分離技術1、免疫磁珠分離技術原理利用人工合成的內含鐵成分，可被磁鐵磁力所吸引，外有功能基團，可結合活性蛋白質(抗體)的磁珠，作為抗體的載體。當磁珠上的抗體與相應的微生物或特異性抗原物質結合后，則形成抗原-抗體-磁珠免疫復合物，這種復合物具有較高的磁響應性，在磁鐵磁力的作用下定向移動，使復合物與其他物質分離，而達到分離、濃縮、純化微生物或特異性抗原物質的目的。2、免疫磁珠法分類⑴、陽性分離法磁珠結合的細胞就是所要分離獲得的細胞⑵、陰性分離法磁珠結合不需要的細胞，游離于磁場的細胞為所需細胞

一般而言，陰性分離法的磁珠用量比陽性分離法的大，陽性分離法用的更多。3、磁性微珠(magneticbeads):磁性微珠是以金屬離子為核心，外層均勻包裹高分子聚合體的固相顆粒。磁性微珠上既可標記針對某種細胞表面抗原的特異性抗體（直接法）;也可標記羊抗鼠IgG抗體(間接法），使分離細胞的范圍大大擴大4、免疫磁性微球的制備磁性微載體的制備：

包埋法：將磁性粒子分散于高分子溶液中，通過霧化、絮凝、沉積、蒸發等手段得到磁性高分子微球。

單體聚合法：在磁性粒子和單體存在下，加入引發劑、穩定劑等聚合而成的核/殼式磁性高分子微球。基本技術路線：制成磁性材料的微球，再在微球表面引入活性基團，通過載體表面偶聯反應可將抗體結合到載體上，形成免疫磁性微球。優質微載體的性能：合適且均一的磁響應強度,

較小且均一的粒徑,

穩定均一、特異吸附的表面性能。抗體與磁性載體的結合：磁性微載體表面的高分子層活化后懸于抗體溶液中，在室溫或低溫(冰水浴)下搖動一段時間即可將抗體連接到微球表面上，得到免疫磁性微球。5、該技術的主要優點⑴、細小而均一的微球為配基與受體的反應提供了較大的接觸面積⑵、磁珠的磁性使其可以用磁力收集器方便快速地獲得分離，且對被分離物無損傷⑶、檢測復雜的生物樣本和食品樣本等時受到顆粒性雜質等的影響較小⑷、作為一種流動性的固相支持物，其洗滌和反應都進行得更加充分三、免疫磁性微球的應用1、用于細胞分離和提純使用IMB進行分離細胞有兩種方式；直接從細胞混合液中分離出靶細胞的方法，稱為陽性分離；用免疫磁珠去除無關細胞，使靶細胞得以純化的方法稱為陰性分離。免疫磁珠技術可用來分離人類各種細胞如紅細胞、外周血嗜酸/堿性粒細胞，神經干細胞、造血細胞、T淋巴細胞、γδT淋巴細胞，人類關節滑膜細胞，樹突狀細胞，內皮細胞、及多種腫瘤細胞等。2、體外細胞擴增樹突狀細胞(Dendriticcells，DC)、造血干、祖細胞等細胞在科研及臨床上都具有巨大的應用價值，但是在體內含量較少而且分布廣泛，難以獲得大量高純度的細胞，限制了該領域的發展。體外擴增輔以免疫磁珠技術有望解決這一難題。在這一過程中，用免疫磁性微球分離純化出待擴增的細胞，用特定的因子組合培養，許多研究者用這樣的方法尋找擴增的最佳細胞因子組合和移植的最佳時機。3、免疫檢測免疫磁性微球可以簡單快速地從血液或者骨髓中富集、清除癌細胞，廣泛地應用于疾病檢測、癌癥治療和自身骨髓移植中，還被用于從母體外周血中分離胎兒細胞進行無創性產前診斷。免疫磁珠分離技術用在微生物檢測方面能準確快速地檢測出樣品中的ColiO157，這對于食品衛生和預防疾病的傳播具有重要的意義。PCR技術與免疫磁珠技術結合在分子生物學、醫學診斷學等方面有非常重要的作用，這方面的研究在醫學檢測方面的應用，可以簡便快速地診斷膀胱癌、乳腺癌、前列腺癌、腹膜胃癌、上皮腫瘤細胞等，使免疫磁性分離技術的應用更加廣泛。4、在核酸與基因工程上的應用免疫磁球可以看作是親合層析技術中的微型配基裁體，借助親合素-生物素（Biotin-Avidin）系統免疫磁球可與非蛋白質結合，生物素和親合素間有著高度的親和力，兩者的結合迅速、專一、穩定，在分子生物學、醫學、免疫組織化學等領域中的應用也越來越廣泛，與生物磁珠技術結合后，更是產生了誘人的發展前景，并廣泛地應用于分離純化RNA、mRNA、核酸片段等及相關研究。5、用于分型免疫磁珠法可被應用于臨床器官移植供受者的快速選配。在高梯度磁場下,用免疫磁珠法分離靜脈或腹腔血中T、B淋巴細胞，并利用分離的淋巴細胞進行HLA-ⅠⅡ類抗原分型。如采用磁珠技術和單抗試劑建立起可在1.5h完成HLA-ⅠⅡ類抗原一類分型的新方法，還可應用免疫磁珠分離技術進行腎移植供受體的HLA分型、探討血液病患者反復血小板輸注的治療效果與HLA之間的相關性。6、

用作靶向釋藥系統的載體免疫磁性微球作為靶向釋藥系統的載體可使免疫磁性微球上的抗癌藥物更易與癌細胞接觸，服用這種制劑后，在體外適當部位用一適宜強度的磁鐵，將磁性微球引導到體內特定靶區，提高了殺傷癌細胞的效果。很多研究者使用不同的方法制成了針對不同癌細胞的免疫磁性微球，作為靶向釋藥系統的載體并在實驗中證實這種釋藥載體具有良好的功效。斑點免疫層析、免疫磁分離技術在E．coli0157：H7檢測中的應用1、E．coli0157：H7

是大腸桿菌的其中一個類型，該種病菌常見于牛羊等溫血動物的腸內。這一型的大腸桿菌會釋放一種強烈的毒素，并可能導致腸管出現嚴重癥狀。已被世界衛生組織確定為新發現的28種傳染病病原體之一,成為各國食品安全和公共衛生監控的重點。

⑴病征：患者可能出現各種癥狀，包括嚴重的腹瀉、帶血腹瀉、發燒、腹絞痛及嘔吐。情況嚴重時，更可能并發急性腎病。5歲以下的兒童出現該等并發癥的風險較高。若治療不當，可能會致命。

⑵傳播途徑：該種疾病可通過飲用受污染的水或進食未熟透的食物(特別是免治牛肉、漢堡扒及烤牛肉)而感染。飲用或進食未經消毒的奶類、芝士、蔬菜、果汁及乳酪而染病的個案亦有發現。此外，若個人衛生欠佳，亦可能會通過人傳人的途徑，或經進食受糞便污染的食物而感染該種病菌。

⑶潛伏期：通常為3至4日，但亦會長達9日。

⑷治理方法：感染大腸桿菌O157:H7的臨床治理方法主要屬支持性治療。若患者出現腹瀉，補充失去的水份及電解質十分重要。約50%有腎并發癥的患者在出現急性癥狀時需要特別治療或輸血。2、斑點免疫層析法（DICA)又稱免疫膠體金標記法．是利用免疫色層技術來檢測樣品中E.ColiO157在E．Coli檢測卡上，將膠體金標記的兔抗O157，抗體和兔抗羊IgG抗體分別固定在膜上下，做為測試帶和質控帶。樣品增菌液滴加到加樣孔膜上并展開．若含有E.ColiO157就會結合到檢測帶處形成抗原—抗體復合物而星現可見的紅色帶，而羊IgG結臺到質控帶星現紅色，它具有簡便、快速定性作用。3、檢驗方法⑴mEC增菌培養取樣品5g接種到50ml10％新生霉索mEC增菌液中搖勻放恒溫搖床，37℃振蕩培養6h。⑵DICA法用試劑盒所配專用棉拭子，沾取樣品增菌液后，插入EHE．Coli檢測卡一端的加樣孔中，10min內讀取結果；只有質控帶出現紅色條帶表明無E．ColiO157抗原存在．同時也表示實驗正確；出現兩條紅色條帶(測試和質控帶)表示可能有E．ColiO157抗原存在,如均無出現紅色條帶，表示實驗失敗。

⑶IMS法將樣品增菌液分成DICA法陽性和陰性兩組．均取1ml加入1.5mlep離心管中(離心管事先已加入20μl免疫磁珠)振搖20～30min，上磁鐵板吸附沉淀免疫磁珠，吸去上清液，反復用PBT-T洗滌2次，加50μlPBs-T重懸浮、混勻，分涂于2塊CT-SMAC平板37℃培