不同濃度醫用臭氧對大鼠星形膠質細胞影響的體外觀察內容研究的意義和主要內容

國內外研究進展實驗方法和內容初步計劃

經費預算

可行性預測

不利因素

參考文獻研究的意義和主要內容醫用臭氧是臭氧和氧氣的混合物，應用于臨床已有100多年的歷史。醫用臭氧技術在臨床各專業中被廣泛關注，并顯示了良好的應用前景。在疼痛臨床中，自1988年Verga將臭氧注入腰大肌及椎旁間隙治療腰腿痛，臭氧開始越來越多的用于疼痛治療。研究的意義和主要內容對于腰腿痛病人，醫用臭氧椎間盤內和椎旁注射取得了良好的療效。但是臭氧作為一種極強的氧化劑，在治療過程中有可能會誤入或滲入蛛網膜下腔，這是否會對中樞神經系統造成損傷，或是多大劑量能造成損傷，已經引起了臨床醫務工作者的關注和重視。研究的意義和主要內容星形膠質細胞作為中樞神經系統中數量最多的細胞，它的功能在近年來被人們越來越多地認識到，甚至有人把星形膠質細胞和神經元比作中樞神經系統中同等重要的功能伙伴。研究的意義和主要內容并且星形膠質細胞參與構成了血腦屏障，最先接觸蛛網膜下腔中的毒性物質，而它本身也有強大的抗氧化能力，因此星形膠質細胞在抵抗臭氧的毒性作用中可能發揮了很大的作用，但廣泛查閱未檢索到相關報道。本研究擬從生化改變和形態學兩方面觀察不同濃度的醫用臭氧對體外培養的星形膠質細胞的影響，以期為臨床工作提供有意義的參考。國內外研究進展國內外關于臭氧的研究多集中于免疫系統、心血管系統、神經內分泌系統、呼吸系統等方面。在疼痛領域，對臭氧的研究都集中在臭氧的治療作用，尤其是臭氧溶解椎間盤髓核作用和消炎止痛作用。國內外研究進展在臭氧的毒性方面，本科前期觀察了不同濃度的醫用臭氧2ml（30mg/L,50mg/L,80mg/L）經小腦延髓池注入蛛網膜下腔后，兔行為學未受到明顯影響，而隨著醫用臭氧濃度的增加，腦脊液的抗氧化水平逐漸提高，脂質過氧化反應被抑制；當超出機體抵抗氧化的代償能力時，抗氧化水平不再繼續提高，脂質過氧化反應短暫增強。這表明隨著劑量的增加醫用臭氧鞘內注射有潛在的神經毒性，研究結果發表在中華麻醉學雜志上，這一結論為進一步研究醫用臭氧的神經毒性提供了初步的研究結果。國內外研究進展但關于臭氧對離體細胞作用的研究，國外多是集中在臭氧對血液細胞和支氣管上皮細胞的作用上，國內幾乎沒有在此方面的研究；而對于離體神經細胞的作用，國內外都沒有相關文獻報道。實驗方法和內容1星形膠質細胞培養參照Kim等人的方法，并略作改動。大致步驟如下：（1）取1～2天齡的大鼠，經75%乙醇消毒后，用手術剪將頭部剪下，置于無菌培養皿中。（2）沿縱軸剪開皮膚和顱骨，打開顱腔，取出腦組織并移入另一含有預冷生理鹽水的培養皿中，去除嗅部，小心分離出兩側的大腦皮質。注：在取材過程中，為防止污染，所用的消毒手術器械每一步驟均要加以更換。實驗方法和內容

1星形膠質細胞培養（3）小心地撕去腦膜，通常腦膜呈粉紅色，若皮質組織已不見該顏色一般說明腦膜已去除干凈。（4）將組織切成約0.2×0.2×0.2mm3大小的碎塊后，移入另一含有9ml生理鹽水的培養皿中。（5）加入無菌的1ml0.25%胰蛋白酶液(預先用5%調節Ph7.3),置37℃水浴振蕩消化20-30分鐘。實驗方法和內容

1星形膠質細胞培養（6）加入20ml含血清的DMEM完全培養基,并用吸管柔和的吹打3次。（7）靜置數分鐘待組織下沉后，將細胞懸液移入另一新的離心管，再加入15mlDMEM至剩余組織中，稍用力吹打3-4次后，再讓組織下沉，收集細胞懸液。實驗方法和內容

1星形膠質細胞培養（8）重復步驟（7）3-4次，直至組織全部分散成細胞懸液。將收集的細胞懸液用130um的篩網過濾。（9）過濾后的細胞懸液用50ml的無菌離心管分裝，以1000r/min離心10min。（10）盡可能吸去上清液，每管加入10mlDMEM/F12，并柔和吹打3min,讓細胞碎片和殘余組織團塊下沉后，收集細胞懸液。（11）用吸管將細胞懸液轉移至細胞培養瓶，37C，5%CO2孵育40分鐘，然后翻轉培養瓶，將細胞懸液轉移至另一培養瓶，重復此步驟3~4次以除去成纖維細胞。實驗方法和內容

1星形膠質細胞培養（12）取0.1%苔盼藍與細胞懸液以1：1稀釋后，檢查活細胞的數量，將細胞密度稀釋成1.5×106

／ml,

接種入75cm2的培養瓶中，5％C02／95％空氣，37℃，飽和濕度培養。（培養液組成：DMEM/F12，添加10％胎牛血清、4mmol／L一谷氨酰胺、10萬U青霉素／10萬U鏈霉素、15mmol／LHEPES）。(13)接種三天后更換培養液，以后每隔兩天換液一次。定期換液觀察至培養第8天時細胞已融合，用0．25%胰蛋白酶消化處理后傳代，兩次傳代后約第三周時即可得純化的星形膠質細胞。實驗方法和內容

1星形膠質細胞培養（14）星形膠質細胞的鑒定采用膠原纖維酸性蛋白(GFAP)免疫組化染色：以無水酒精固定貼壁細胞10min，PBS漂洗；過氧化酶阻斷劑，室溫下孵育10min；一抗(鼠抗)一抗GFAP抗體室溫下60min；生物素標記的第二抗體，室溫下孵育10min；鏈親和素一過氧化物酶溶液，室溫下孵育10min；DAB染色，蘇木精對比染色，中性樹膠封固。進行膠質原纖維酸性蛋白(GFAP)抗血清反應，顯示陽性反應(光鏡下觀察呈棕褐色)的是星形膠質細胞。

GFAP鑒定星形膠質細胞純度90%以上可用于實驗。實驗方法和內容

2實驗分組

將培養的細胞懸液分為純氧組（O2組）及各濃度臭氧組（02-O310組，02-O320組，02-O340組，02-O360組，02-O380組），────────────────────分組平行試驗數量處理P組O2組5通入純氧O2-O310組5通入10mg/L臭氧O2-O320組5通入20mg/L臭氧O2-O340組5通入40mg/L臭氧O2-O360組5通入60mg/L臭氧O2-O380組5通入80mg/L臭氧────────────────────說明：醫用臭氧是氧氣和臭氧的混合物，臭氧代謝生成氧氣。氧氣具有生物活性，要全面的觀察醫用臭氧的生物效應除了要考慮到臭氧本身的作用外還要考慮到在混合氣體中共同存在和經由代謝生成的氧氣的作用。實驗方法和內容

3干預手段將各組細胞懸液中分別通入純氧及臭氧（濃度各為10mg/L，20mg/L，40mg/L，60mg/L，80mg/L），體積與細胞培養液按體積以1：1計，在10分鐘內通完，分別孵育2h,4h后進行顯微鏡下觀察及生化檢測。臭氧抽取方法：將臭氧發生器接通電源，通過調校臭氧濃度及氧氣輸入量按鈕或去所需濃度的醫用臭氧。用一次性注射器接至臭氧輸出端口，并用力下壓，臭氧即可依靠自身壓力充滿注射器，第一管廢棄不用，獲得的醫用臭氧需立即使用。實驗方法和內容

4觀測指標4.1相差顯微鏡下星形膠質細胞形態觀察星形膠質細胞形狀不規則、呈多角形或星形，扁平狀;胞體較大,直徑大約為9-10um,胞質較豐富、胞突較多較長;細胞核大，呈圓形或卵圓形，常偏于胞體一側,染色質少。生長良好的細胞，在顯微鏡下可觀察到細胞透明度大，折光性強，輪廓不清，并可見細胞部分細微結構。實驗方法和內容

4觀測指標若細胞生長狀態不良，可見細胞輪廓增強，細胞折光性變弱，細胞胞質中出現空泡，脂滴和其他顆粒狀物質，細胞之間空隙增大，細胞形態不規則，甚至失去原有細胞的特點，產生圓縮脫落，有時細胞表面及周圍出現絲絮狀物，細胞死亡會崩解漂浮在培養液中。在受到外界損傷因素時，細胞會變得腫脹，突起增多。實驗方法和內容

4觀測指標4.2細胞計數這是細胞培養中常用的基本技術之一，也是比較簡便實用的觀測指標。在細胞培養研究中，了解細胞的數量和存活情況是很重要的一個環節，由此可以判斷培養條件和方法是否合適，而且通過細胞數量的變化可以初步了解所使用的某些因素對細胞的影響。實驗方法和內容

4觀測指標細胞損傷或死亡時，由于細胞膜的結構或通透性發生改變，某些染料可穿透細胞膜進入細胞內，使細胞染色，從而可以根據細胞是否著色來區分活細胞和死細胞，并根據活細胞和死細胞的比例即活細胞百分率來判斷細胞受損的程度。實驗方法和內容

4觀測指標4.3生化指標生物膜中的不飽和脂肪酸對自由基及脂質過氧化產物具有極強的敏感性,過量可導致損傷。文獻表明，脊髓損傷后5～30min自由基即有升高，2小時后脂質過氧化產物升高最明顯，此后不同性質損傷變化不同。這表明在脊髓損傷后的急性期改變中氧化-抗氧化系統失衡起重要作用。4.3.1超氧化物歧化酶（SOD）SOD是氧化-抗氧化系統中重要的酶,對機體的氧化與抗氧化平衡起著至關重要的作用。SOD專一以超氧陰離子自由基為底物，能清除自由基并終止其連鎖反應，保護細胞免受損傷，同時本身被消耗。它的含量可反映體內自由基的變化情況，能夠反映抵抗自由基損傷的能力。SOD活力的高低與衰老、腫瘤、炎癥、自身免疫病、血液病、輻射、藥物作用等有著密切的聯系，對疾病的病因學探討，診斷治療的觀察有著重要意義。4.3.2丙二醛（MDA）MDA為脂質過氧化物終產物之一,具有細胞毒性。其含量多少能體現機體的脂質過氧化程度，能夠反映細胞受損的程度。機體通過酶系統與非酶系統產生氧自由基，自由基能攻擊生物膜中的多不飽和脂肪酸(PUFA)，引發脂質過氧化作用，并因此形成脂質過氧化物，如:醛基(丙二醛)、酮基、羥基、氫過氧基或過氧基，以及新的氧自由基等。脂質過氧化作用不僅把活性氧轉化成活性化學劑，即非自由基性的脂類分解產物，而且通過鏈式或鏈式支鏈反應，放大活性氧的作用。4.3.2丙二醛（MDA）

因此，初始的一個活性氧能導致很多脂類分解產物的形成，這些分解產物中，一些是無害的，另一些則能引起細胞及功能障礙，甚至死亡。氧自由基不但通過生物膜中多不飽和脂肪酸(PUFA)的過氧化引起細胞損傷，而且還能通過脂質過氧化物的分解產物引起細胞損傷。因而測試MDA的量常常可反映機體內脂質過氧化的程度，間接地反應了機體清除氧自由基的能力，而MDA的高低又間接反應了機體細胞受自由基攻擊的嚴重程度。4.3.3乳酸脫氫酶(lactatedehydrogenase,LDH)乳酸脫氫酶是存在于細胞漿內參與糖酵解最后一步即丙酮酸和乳酸相互轉化時的一種催化酶。LDH在正常人體血漿中含有少量，均系來源于組織細胞，但在某些疾病時所累及的細胞會額外釋放入血或腦脊液，故臨床上常用血清或腦脊液LDH活性測定來診斷疾病和進行藥物治療作用的評價。4.3.3乳酸脫氫酶(lactatedehydrogenase,LDH)進行離體細胞培養時，如果培養的細胞受損，LDH也會由細胞漏出至培養液中，因此通過細胞培養液LDH漏出率的測定可以較客觀地衡量細胞的受損程度。在相同的條件下細胞培養液LDH的漏出率高的細胞損傷程度就大。4.3.3乳酸脫氫酶(lactatedehydrogenase,LDH)在本試驗中，生物膜尤其是細胞膜中的不飽和脂肪酸對由臭氧產生的自由基及脂質過氧化物具有極強的敏感性，過量可導致損傷，而且細胞膜相對于胞內結構首先接觸到內環境中的毒性物質，因而細胞膜是臭氧攻擊的重要靶點，會更多的受到損傷。細胞膜損傷后會導致通透性增高，細胞內的成分會比較容易的漏出，LDH也會漏出。細胞膜損傷越嚴重，LDH就會漏出越多，因而測定LDH漏出率可以較特異的反應細胞膜的損傷程度。實驗方法和內容

4觀測指標如上所述，LDH漏出率，MDA和SOD分別代表著損傷和抗損傷因素，并且對神經膠質細胞損傷反應靈敏，是分析醫用臭氧對中樞神經系統有無毒性的合適指標。實驗方法和內容

5測定方法5.1相差顯微鏡直接觀察法細胞形態觀察（1）調整好相差顯微鏡（2）觀察瓶皿準備（3）調光（4）調焦和攝影（5）細胞觀察實驗方法和內容

5測定方法5.2細胞計數和活細胞百分率（1）取清潔計數板和專用蓋玻片，用絲綢輕輕拭干。（2）取細胞懸液0.3ml，加入0.9ml0.5%濃度的臺盼藍（PBS配置），混勻后滴半滴于血球計數板內，以充滿不外溢為宜。也可直接將細胞懸液在一側滴加到蓋玻片中，不要溢出，也不要過少或出現氣泡。（3）在顯微鏡下用10X物鏡觀察計數四角大分格中的細胞數。代入下式得出細胞密度。細胞數/mL=(4大格細胞數之和/4)X104X稀釋倍數臺盼藍染色法可計算出活細胞數和死細胞數以測定細胞存活百分率。一般臺盼藍染色可使死細胞染成藍色，活細胞不著色。細胞存活百分率=(4大格活細胞數/4大格活細胞+死細胞數)x100%實驗方法和內容

5測定方法5.3生化指標測定5.3.1SOD測定:黃嘌呤氧化酶法。原理是超氧陰離子自由基能氧化羥胺形成的亞硝酸鹽并在顯色劑的作用下呈現紫紅色，用可見光分光光度計可測其吸光度。當被測樣品中含SOD時，對超氧陰離子自由基有專一性的抑制作用，使形成的亞硝酸鹽減少測定管的吸光度低,從而計算出被測樣品中的SOD活力。方法：作用終止后,吸去培養液,以冰生理鹽水洗滌細胞2次,用細胞刮板刮下細胞,冰生理鹽水收集,在冰浴中用超聲細胞破碎儀破碎細胞,顯微鏡下觀察無完整細胞后,按照試劑盒說明分別測定細胞內SOD活性,結果以U·mg-1(pro)表示。實驗方法和內容

5測定方法/生化指標測定5.3.2MDA測定:硫代巴比妥酸(TBA)法。原理是過氧化脂質在酸性條件下分解成MDA，MDA與TBA結合成紅色色素，其吸收峰為535nm。方法：作用終止后,吸去培養液,以冰生理鹽水洗滌細胞2次,用細胞刮板刮下細胞,冰生理鹽水收集,在冰浴中用超聲細胞破碎儀破碎細胞,顯微鏡下觀察無完整細胞后,按照試劑盒說明分別測定細胞內MDA含量,結果以nmol·mg-1(pro)表示。實驗方法和內容

5測定方法/生化指標測定

5.3.3LDH測定：比色測定法。原理乳酸與氧化型輔酶I(NAD)在LDH催化作用下生成丙酮酸和還原型輔酶I(NADH)，丙酮酸再和2,4一二硝基苯肼反應生成2,4一二硝基苯腙，后者在堿性溶液中呈棕紅色，從而通過比色法測定丙酮酸含量推算出LDH的活力。實驗方法和內容

5測定方法/生化指標測定5.3.3.1細胞培養液LDH活性測定實驗終止后，吸出待測培養孔內的培養液，以3000rpm離心10分鐘，取上清液進行檢測，用乳酸脫氫酶試劑盒測定LDH含量。按照LDH測定試劑盒說明,在分光光度計上于340nm處檢測,結果以U·L-1表示。實驗方法和內容

5測定方法/生化指標測定/LDH5.3.3.2細胞勻漿液LDH活性測定將待測培養孔內的培養液吸出后，加入等量PBS液，用細胞刮板刮取細胞并收集到相應編號的容器內，在超聲波破碎上將細胞破碎，然后進行細胞勻漿液LDH活性的測定。按照LDH測定試劑盒說明,在分光光度計上于340nm處檢測,結果以U·L-1表示。實驗方法和內容

5測定方法/生化指標測定/LDH5.3.3.3細胞培養液LDH漏出率的測定細胞培養液LDH漏出率(%)=:培養液LDH總活性/(培養液LDH總活性+細胞勻漿液LDH總活性)X100%注:：1）培養液LDH總活性=培養液LDH的活性X培養液的體積;2)細胞勻漿液LDH總活性二細胞勻漿液LDH的活性X細胞勻漿液蛋白含量X細胞勻漿液的體積;3)計算時一定要注意單位的換算。初步計劃2007、4-----2007、5準備試劑、材料、聯系相關科室。2007、5-----2007、7預實驗階段。2007、7-----2007、11正式實驗階段，并進行實驗總結。2007、11-----2008、2整理材料、分析結果、論文撰寫、準備答辯。經費預算神經膠質細胞培養：2000元；SOD、MDA、LDH測定：4000元；顯微鏡下細胞形態觀察、計數：2000元。可行性預測1本科室技術力量雄厚，科研能力強。2已開展的相關研究提供了可借鑒的理論指導和實踐經驗。不利因素1相關基礎研究報道較少，缺少直接借鑒的經驗。2所需科研經費數目較大。3神經細胞培養比較困難。參考文獻張維，傅志儉，謝珺田，趙學軍。鞘內注射醫用臭氧對兔行為學和腦脊液超氧化物歧化酶、丙二醛水平的影響，中華麻醉學雜志,2006，26：552-554;HallED,BranghlerJM.Roleoflipidperoxidationinpost-traumaticspinalcorddegeneration.Cent

Nerv

SystTrauma,1986,3(4):281;3L.JANSKY1,P.REYMANOVá1,J.KOPECKY.DynamicsofCytokineProductioninHumanPeripheralBlood,MononuclearCellsStimulatedbyLPSorInfectedbyBorrelia

Physiol.Res.52:593-598,2003;4Velio

BocciCA.OzoneasJanus:thiscontroversialgascanbeeithertoxicormedicallyusefulMediatorsofInflammation,200413(1),3_/11;5楊志軍,魏玲.星形膠質細胞生物學功能研究進展,華神經醫學雜