啤酒酵母蔗糖酶提取、分離純化、性質(zhì)鑒定及反應(yīng)動力學(xué)實驗啤酒酵母細胞破碎、離心E1E2乙醇分級沉淀透析E3離子交換層析蛋白質(zhì)含量測定Folin-酚法酶活力測定DNS法米氏常數(shù)測定雙倒數(shù)法酶反應(yīng)動力學(xué)正交設(shè)計實驗流程2一、目的要求1、熟悉工作曲線的制作方法及注意事項；2、掌握3,5-二硝基水楊酸（DNS）比色定糖的原理和方法；3、掌握Folin-酚法測定蛋白質(zhì)含量的原理和方法；4、掌握酶蛋白分離提純的原理；5、掌握酶的比活力測定及其計算方法；6、掌握酶促反應(yīng)動力學(xué)中用雙倒數(shù)法測定Km的方法；7、運用正交試驗法確定溫度、pH值、離子濃度的最適條件。3

二、實驗對象

啤酒酵母蔗糖酶

蔗糖酶(Sucrase，EC.3.2.1.26)又稱為轉(zhuǎn)化酶(Invertase)，是催化蔗糖水解成為果糖和葡萄糖的一種酶，廣泛存在于動植物和微生物中，主要存在于酵母中。4

該酶以兩種形式存在于酵母細胞膜的外側(cè)和內(nèi)側(cè)；在細胞膜外細胞壁中的稱之為膜外蔗糖酶，其活力占總酶活力的大部分，含有50%

糖成分的糖蛋白；在細胞膜內(nèi)側(cè)細胞質(zhì)中的稱之為膜內(nèi)蔗糖酶，含有少量的糖。蔗糖酶的存在形式5

這兩種酶組成上有較大的差別，但其底物專一性和動力學(xué)性質(zhì)仍十分相似，故本實驗未區(qū)分膜內(nèi)酶與膜外酶。而且由于膜內(nèi)酶含量很少，難提取，本實驗提取純化的主要是膜外酶。

名稱MW亞基Km(底物為蔗糖)pI(等電點)最適pH最適溫度膜外酶27萬(22萬)雙26mM5.0(3.5～5.5)60℃膜內(nèi)酶13.5萬雙25mM4.5(3.5～5.5)60℃兩種酶性質(zhì)和組成對比6

三、實驗步驟及原理1、蔗糖酶的提取2、蔗糖酶的純化3、各純化級別蔗糖酶的活力測定4、各純化級別蔗糖酶的蛋白質(zhì)含量測定5、蔗糖酶酶促反應(yīng)動力學(xué)研究6、正交試驗法測定不同條件對蔗糖酶活性的影響71、蔗糖酶的提取(細胞破壁)8動物細胞植物細胞細胞的形態(tài)與特征9基本特征：單細胞，橢圓形、圓形或柱形。長5-30μm，寬1-5μm。酵母菌10生物材料破碎的方法（1）機械（勻漿）法（2）超聲波處理法（3）反復(fù)凍融法（4）化學(xué)處理法（5）溶胞作用(酶溶解法)（6）自溶法11（1）機械（勻漿）法

①研缽TheNobelPrizeinChemistry1907EduardBuchner愛德華·比希納(1860–1917)

Germanorganicchemistandbiochemist"forhisbiochemicalresearchesandhisdiscoveryofcell-freefermentation"12Teflon：聚四氟乙烯

先將剪碎的組織置于管中，再套入研桿來回研磨，上下移動，即可將細胞研碎，此法細胞破碎程度比高速組織搗碎機高，適用于少量組織和臟器。（1）機械（勻漿）法②玻璃或Teflon研棒勻漿器（50mL）13（1）機械（勻漿）法③高速組織搗碎機（0.5-1L）、

將材料配成稀糊狀液，放置于筒內(nèi)約1/3體積，蓋緊筒蓋，將調(diào)速器先撥至最慢處，開動開關(guān)后，逐步加速至所需速度。此法適用于動物內(nèi)臟組織、植物肉質(zhì)種子等。均質(zhì)機高速組織搗碎機14（1）機械（勻漿）法④高壓勻質(zhì)機（XL）高壓下的細胞通過閥門流出時，細胞內(nèi)外壓力同時降低，但由于細胞膜的作用，胞外壓力瞬間降至常壓，而胞內(nèi)壓力相比之下降低較慢，從而在細胞內(nèi)外形成壓力差，使細胞膜破裂。

優(yōu)點：快速，產(chǎn)熱小，對蛋白損傷小，破碎效率高，一次破碎效率可達90%以上高壓勻質(zhì)機15（2）超聲波處理法

用一定功率的超聲波處理細胞懸液，使細胞急劇震蕩破裂，此法多適用于微生物材料，常選用濃度為50-100mg/ml菌體，在30至60Hz頻率下處理10-15分鐘，此法的缺點是在處理過程會產(chǎn)生大量的熱，應(yīng)采取相應(yīng)降溫措施。水浴式探頭式16（3）反復(fù)凍融法：將細胞在-20度以下冰凍，室溫融解，反復(fù)幾次，由于細胞內(nèi)的水形成冰粒而剩余的細胞液中鹽濃度增高引起溶脹，使細胞結(jié)構(gòu)破碎。設(shè)備簡單、效率不高，時間長，注意蛋白酶！（4）化學(xué)處理法：有些動物細胞可采用十二烷基磺酸鈉(SDS)、去氧膽酸鈉等細胞膜破壞。17（5）溶胞作用(酶溶解法)：

用生物酶將細胞壁和細胞膜消化溶解的方法。常用的溶酶有溶菌酶、β-1,3-葡聚糖酶、蛋白酶等。（6）自溶法：

將新鮮的生物材料存放于一定的pH和適當(dāng)?shù)臏囟认拢毎Y(jié)構(gòu)在自身所具有的各種水解酶（如蛋白酶和酯酶等）的作用下發(fā)生溶解，使細胞內(nèi)含物釋放出來。18自溶法破壁（本實驗）干酵母粉溶于蒸餾水乙酸鈉乙酸乙酯35℃恒溫攪拌40分鐘35℃恒溫過夜補加蒸餾水?dāng)嚢杈鶆颍珊隣铍x心棄沉淀及脂層E1記錄生產(chǎn)廠家和批號用硫酸紙封嚴(yán)（過夜）超聲波破碎：使用超聲波破碎儀在50%的功率(約450W左右)，超聲20min(40min),超5s停5s，Φ6探頭。(冰浴)192、蔗糖酶的純化20E1用稀HAc調(diào)pH=4.5乙醇分級(32%乙醇飽和度)Ι離心，取上清乙醇分級(47.5%乙醇飽和度)Ⅱ離心，取沉淀透析水§磷酸緩沖液過夜離心，取上清E2E2E3DEAE-52離子交換層析211.酶的蛋白屬性；2.調(diào)節(jié)酶溶解度的方法；

鹽析、有機溶劑分級沉淀3.根據(jù)酶分子大小、形狀不同的分離方法；透析、凝膠層析4.根據(jù)酶分子電荷性質(zhì)的分離方法；離子交換層析酶的純化方法221.酶的蛋白屬性兩性電離蛋白質(zhì)分子除兩端的氨基和羧基可解離外，氨基酸殘基側(cè)鏈中某些基團，在一定的溶液pH條件下都可解離成帶負電荷或正電荷的基團。等電點(isoelectricpoint,pI)

當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)溶液處于某一pH時，蛋白質(zhì)解離成正、負離子的趨勢相等，即成為兼性離子，凈電荷為零，此時溶液的pH稱為蛋白質(zhì)的等電點。23

大分子(膠體)

分子量可自1萬至100萬之巨，其分子的直徑可達1～100nm，為膠粒范圍之內(nèi)。

穩(wěn)定的因素顆粒表面電荷水化膜24+++++++帶正電荷的蛋白質(zhì)－－－－－－－－帶負電荷的蛋白質(zhì)在等電點的蛋白質(zhì)水化膜酸堿酸堿++++++++帶正電荷的蛋白質(zhì)－－－－－－－－帶負電荷的蛋白質(zhì)不穩(wěn)定的蛋白質(zhì)顆粒酸堿脫水作用脫水作用脫水作用溶液中蛋白質(zhì)的聚沉252.調(diào)節(jié)酶溶解度的方法；（1）改變離子強度；鹽析硫酸銨分級沉淀（反抽提法）反抽提法（BackExtraction）例：E.coliRNA聚合酶42%-50%硫酸銨飽和度時沉淀通常方法：先33%-------再50%反抽提法：再42%

將包含待分離酶在內(nèi)的多種蛋白一起先沉淀出來，然后再選擇適當(dāng)?shù)倪f減濃度的硫酸銨溶液來抽提沉淀物。蛋白從溶液中沉淀析出十分容易，沉淀在溶液中溶解有高特異性。26（2）改變pH或溫度；酶在未純化之前pI也是未知的，pH不宜變化過大，以免失活。Cu,Zn-SOD的純化可在70oC，10min（3）改變介電常數(shù)；有機溶劑分級沉淀：向水溶液中加入一定量親水性的有機溶劑，降低溶質(zhì)的溶解度，使其沉淀析出的分離純化方法。親水性有機溶劑加入溶液后降低介質(zhì)的介電常數(shù)，使溶質(zhì)分子之間的靜電引力增加，聚集形成沉淀。親水性有機溶劑的水合作用降低了自由水的濃度，壓縮了表面水化膜的厚度，降低其親水性，導(dǎo)致脫水凝集。27

有機溶劑分級沉淀操作條件的控制

溶劑選擇常用的溶劑是乙醇、丙酮、甲醇，二甲基甲酰胺、二甲基亞砜也可做沉淀劑。沉淀用有機溶劑的選擇主要應(yīng)考慮沉淀作用強、對生物分子的變性作用小、毒性小以及揮發(fā)性適中。溫度使用有機溶劑沉淀生物大分子時應(yīng)控制在低溫下進行。樣品濃度的控制

一般認(rèn)為蛋白質(zhì)的初始濃度為0.5-2%為好。283.根據(jù)酶分子大小、形狀不同的分離方法；（1）透析；

利用具有一定孔徑的親水膜，在常壓下依靠小分子物質(zhì)的擴散運動，將含有高分子和其他小分子的溶液與純水或緩沖溶液分隔的一種方法.用于去除大分子溶液中的小分子物質(zhì)，稱為脫鹽。用于去除大分子溶液中的溶劑，此稱為濃縮。29（2）超濾；30中空纖維超濾裝置多層平板小型實驗室超濾裝置小型盒式平板超濾UF系統(tǒng)小型實驗室超濾裝置31（3）凝膠層析（gelchromatography）凝膠層析的定義：

凝膠是一種具有多孔、網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的分子篩。利用這種凝膠分子篩對大小、形狀不同的分子進行層析分離，稱凝膠層析。凝膠層析

常見名稱：凝膠過濾、分子篩層析、排阻層析、凝膠滲透層析。32凝膠層析是利用凝膠把分子大小不同的物質(zhì)分離開的一種方法，其原理是分子篩效應(yīng)，混合樣品如同“過篩”一樣，因分子大小的不同得以彼此分開。在洗脫過程中，大分子不能進入凝膠內(nèi)部，而沿凝膠顆粒間的空隙最先流出柱外；而小分子可以進入凝膠顆粒內(nèi)部的多孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，路徑長、流速慢，以至最后流出柱外。3334

凝膠層析的應(yīng)用范圍：

凝膠層析法適用于分離和提純蛋白質(zhì)、酶、多肽、激素、多糖、核酸類等物質(zhì)。分子大小彼此相差25%的樣品，只要通過單一凝膠床就可以完全將它們分開。利用凝膠的分子篩特性，可對這些物質(zhì)的溶液進行脫鹽、濃縮、去熱源和脫色。

凝膠層析的優(yōu)點：

凝膠層析具有設(shè)備簡單、操作方便、分離迅速及不影響生物學(xué)活性等優(yōu)點。目前已被廣泛應(yīng)用于各種生化產(chǎn)品的分離和純化。35凝膠層析的特點

凝膠層析操作簡便，所需設(shè)備簡單；分離效果較好，重復(fù)性高。最突出的是樣品回收率高，接近100％；分離條件緩和。凝膠骨架親水，分離過程又不涉及化學(xué)鍵的變化，所以對分離物的活性沒有不良影響；應(yīng)用廣泛。適用于各種生化物質(zhì)，如肽類、激素、蛋白質(zhì)、多糖、核酸的分離純化、脫鹽、濃縮以及分析測定等。分離的分子量范圍很寬，如SephadexG類為

102-105D；Sepharose類為105-108D。

364.根據(jù)酶分子電荷性質(zhì)的分離方法；離子交換層析基本原理：

以離子交換劑為固定相，以特定的離子溶液為流動相，利用離子交換劑對待分離的各種離子結(jié)合力的差異，而將混合物中不同離子進行分離的層析技術(shù)。37++++++-------anionexchangebeadEquilibration離子交換分離的基本步驟---平衡-上樣-吸附-洗脫-再生38Sampleapplicationandwash-----------++++++----離子交換分離的基本步驟---平衡-上樣-吸附-洗脫-再生39Elution----------------------------------++++++++++++--離子交換分離的基本步驟---平衡-上樣-吸附-洗脫-再生40Regeneration-----------------------++++++離子交換分離的基本步驟---平衡-上樣-吸附-洗脫-再生41SampleapplicationandwashElutionEquilibrationRegeneration--------------------------------------------------------------------++++++++++++++++++++++++++++++-----------42如何選擇離子交換介質(zhì)

對pI=5的某酸性蛋白質(zhì)，當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)為陰離子時，在pH5.5-9.0的范圍內(nèi)應(yīng)選陰離子交換劑；當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)為陽離子時，在pH3.5-4.5的范圍內(nèi)應(yīng)首選陽離子交換劑43離子交換劑不溶性載體:惰性的高分子固定骨架功能基團:與載體共價結(jié)合的固定的活性基團平衡離子:與功能基團以離子鍵聯(lián)結(jié)可移動的活性離子平衡離子決定樹脂正負在介質(zhì)中帶正電的物質(zhì)用陽離子交換劑；帶負電物質(zhì)用陰離子交換劑。44陽離子交換樹脂：

①強酸性樹脂：主要是磺酸型樹脂，功能基團為磺酸根及甲基磺酸根；②中酸性樹脂：主要是磷酸型樹脂，功能基團為磷酸根；③弱酸性樹脂：主要是羧酸型樹脂和酚型樹脂，功能基分別為羧基和酚基。離子交換樹脂45

陰離子交換樹脂①強堿性樹脂：功能基團多為季胺-N+≡R3；有兩種強堿性陰離子交換樹脂，一種含三甲胺基稱為紡織品堿Ⅰ型，另一種含二甲基-β-羥基-乙胺基團，稱為強堿Ⅱ型。②中強堿性樹脂：兼有以上兩類活性基團。③弱堿性樹脂：弱堿性陰離子交換樹脂的活性基團是伯、仲、叔胺基，即-NH2，-NHR，-NR2，吡啶基等。46樹脂骨架為纖維素，根據(jù)活性基團的性質(zhì)可分為陽離子交換纖維素和陰離子交換纖維素兩類； 特點：骨架松散、親水性強、表面積大、交換容量大、吸附力弱、交換和洗脫條件溫和、分辨率高。離子交換纖維素47適量水浸泡，漂洗，使之充分溶漲；數(shù)十倍的0.5mol/L氫氧化鈉液反復(fù)浸泡0.5～1h，每次換液皆須用水洗至近中性；按交換的需要用平衡離子處理；最后以交換用緩沖液平衡備用。離子交換纖維素的預(yù)處理48裝柱：本實驗使用DEAE-52離子交換樹脂，先把柱內(nèi)裝1/3的5mmol/LpH6.0磷酸起始緩沖液，把柱子垂直固定；將DEAE-52離子交換樹脂用起始緩沖液調(diào)稀、攪勻后加入，柱內(nèi)的DEAE-52離子交換樹脂應(yīng)非常均勻地分布，防止出現(xiàn)截面和氣泡，床面要平整，床高距柱頂約2-3cm為宜。用起始緩沖液洗柱，控制好流速（防止流干）；平衡：用5mmol/LpH6.0的磷酸起始緩沖液平衡過夜。上樣：將柱中的緩沖液放盡，封閉出口，用細長的玻璃管沿柱壁繞環(huán)加入E2，待樣液達到2cm后再在柱中間小心加樣，打開截流閥，注意控制流速，使流出液的流出速度為1-1.5ml/min左右。DEAE-52離子交換層析（本實驗）49洗柱：樣品全部進入床面后，在柱面加入2cm的緩沖液，在儲液瓶中加入5mmol/LpH6.0的磷酸緩沖液，連接紫外檢測器、記錄儀和收集器，打開截流閥，洗出未吸附的雜蛋白。目測記錄儀上的紫外吸收峰的酶活力，檢查流出液中是否有酶活力存在（即酶是否掛在離子交換樹脂上）。洗柱體積控制在5個柱體積左右。目測酶活力方法：取兩支試管，各加入1ml5%蔗糖液，然后于一支中加入1ml起始緩沖液，另一支中加1ml洗柱流出液，同時于35℃恒溫水浴中進行水解反應(yīng)3min，然后各加DNS試劑1ml，于沸水浴中反應(yīng)5min，比較兩支試管顏色的深淺。50洗脫：本實驗用階段洗脫進行。用含0.15mol/LNaCl的5mmol/LpH6.0的磷酸緩沖液100ml，控制流速為1.5ml/min，用小試管收集。收集酶活力峰：目測記錄儀上的蛋白峰的酶活力，確定酶活力峰的位置。用試管收集峰尖處的樣品得到E3，量出總體積V3（留2ml置于冰箱中保存，待測酶活力及蛋白質(zhì)濃度），其它酶液于4℃過夜，留動力學(xué)實驗使用。

513、蔗糖酶的活性測定

52酶活力

(enzymeactivity)酶催化某一反應(yīng)的能力單位時間內(nèi)單位體積中

底物(substrate)

的減少量或

產(chǎn)物(product)

的增加量531、測定酶活力時應(yīng)注意幾點

（1）應(yīng)測反應(yīng)初速度(initialvelocityorinitialspeed)(如每分鐘底物轉(zhuǎn)換的μmol)（2）酶速度(velocity)：酶催化反應(yīng)的速率，符號V0:μmol／min，以零時點為起點作一與曲線的線性部分相切的直線，這一直線的

斜率即等于V0。（3）測酶活力時應(yīng)使反應(yīng)溫度、pH、離子強度和底物濃度等因素保持恒定。（4）測定酶反應(yīng)速度時，應(yīng)使[S]>>[E]。[P][t][t1]起始期─產(chǎn)物迅速形成(線性部分)

速率下降─底物用盡和／或酶失活54國際單位（IU）：在特定的條件下，每分鐘催化1μmol底物轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物所需的酶量。催量單位（kat）：在特定條件下，每秒鐘使1mol底物轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物所需的酶量。1IU=16.67×10-9kat

酶活力單位：2、酶活力和比活力表示方式55活力(或總活力)涉及在樣品中酶的總單位，而比活力是酶純度的量度，是每毫克酶的催化活力數(shù)(U/mg蛋白)。在酶的純化過程中它的比活力逐漸升高，當(dāng)酶提純時，其比活力值成為最大和恒定。酶的比活力(specificactivity，也稱比活性）比活力：指每mg蛋白質(zhì)所具有的酶活力，一般用U/mg蛋白質(zhì)來表示。比活力=酶活力（U/ml）/蛋白質(zhì)濃度（mg/ml）比活力有時也可用每g或每ml酶含多少個活力單位來表示56最方便的測定：測量產(chǎn)物出現(xiàn)的速率或底物的消失速率3、酶活力的測定方法

★

Lightabsorption底物(或產(chǎn)物)在特殊波長下吸收光57DNS法測定蔗糖酶活力（本實驗）1、3,5-二硝基水楊酸比色定糖的原理：

DNS試劑+

D-葡萄糖氨基化合物

（還原糖）強酸性溶液

沸水浴（棕紅色）2）在一定范圍內(nèi)還原糖的量與反應(yīng)液的顏色強度成一定比例關(guān)系（可于比色測定），所以可用DNS比色法測定還原糖的含量。1）2、蔗糖酶活力測定的原理：1）蔗糖酶催化的反應(yīng)是：

2）蔗糖酶活力的規(guī)定：在本實驗條件下，每3分鐘釋放1毫克還原糖所需的酶量定義為一個活力單位。3）該方法是半微量定糖法，操作簡便、快速、雜質(zhì)干擾較少。蔗糖D-果糖+D-葡萄糖蔗糖酶58

3、DNS比色定糖法工作曲線的制作：①取8支血糖管編號1-8，按下頁表中的順序和數(shù)量加入葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液（2mg/ml）、蒸餾水、3,5-二硝基水楊酸試劑，混勻后同時放入沸水浴中準(zhǔn)確反應(yīng)5分鐘（注意：一定等沸水浴鍋中的水沸騰后再放入試管，且不要用大燒杯代替沸水浴鍋），取出后立即用流動的冷水冷卻，加蒸餾水定容至25ml，搖勻，測定540nm處的吸光度值。②以葡萄糖(mg)含量為橫坐標(biāo)、A540值為縱坐標(biāo)，畫出工作曲線。593,5-二硝基水楊酸比色定糖法工作曲線的制作試號葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液（ml）

去離子水（ml）

3，5-二硝基水楊酸試劑（ml）A540102.0320.21.8330.61.4341.01.0351.40.63

6

1.80.2372.00360蔗糖酶活力的測定操作：①取兩支試管分別加入用pH4.6,0.2mol/L的醋酸緩沖液適當(dāng)稀釋過的酶液

2ml，一支中加入0.5ml

1mol/L的NaOH，搖勻，使酶失活（做對照），另一支做測定管；把兩支試管和5%的蔗糖溶液放入35℃水浴中預(yù)熱恒溫；分別取2ml5%的蔗糖加入上述兩試管中，并準(zhǔn)確計算時間，3分鐘后于測定管中加入

0.5ml1mol/L的NaOH，搖勻，終止反應(yīng)。②從反應(yīng)混合物中取出0.5ml溶液放入血糖管中，加入3ml3,5二硝基水揚酸試劑和1.5ml水，搖勻。于沸水浴中準(zhǔn)確反應(yīng)5min，立即用冷水冷卻，加水稀釋至25ml，搖勻，于540nm處測光密度。在葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線上找到所測定光密度值對應(yīng)的葡萄糖含量，按下面公式計算酶活力：

[E]=葡萄糖mg數(shù)×(4.5/0.5)×E的稀釋倍數(shù)/2ml614、蔗糖酶的蛋白濃度測定

62紫

外

吸

收

法雙

縮

脲

法Folin-酚法(Lowry法)63原理：大多數(shù)蛋白質(zhì)由于有酪氨酸和色氨酸的存在，在紫外光

280nm

有吸收峰，可以進行蛋白質(zhì)含量的測定。

計算公式：

蛋白質(zhì)含量(mg/ml)=1.55A280―0.76A260

紫外吸收法優(yōu)點：樣品不需要經(jīng)過預(yù)先處理，即可直接進行測定。方法簡單而快速，又不損害樣品中的蛋白質(zhì)，測定之后的樣品仍可作他用。樣品中有硫酸或其他鹽類存在也不影響測定。在柱層析分離酶或蛋白質(zhì)時，常為人們所采用。缺點：核酸在

280nm

也有吸收，干擾測定，但核酸的最大吸收峰在

260nm。不同蛋白質(zhì)的氨基酸組成也不同，因而光吸收也不盡相同，這就會帶來誤差。64

雙縮脲法雙縮脲法是第一個用比色法測定蛋白質(zhì)濃度的方法，至令仍廣泛采用。原理:Cu2+與蛋白質(zhì)的肽鍵絡(luò)合，形成紫紅色絡(luò)合物，此絡(luò)合物在540nm波長處有最大吸收，是一種快速測定蛋白質(zhì)的方法，但其靈敏度較低。

優(yōu)點：是一種快速測定蛋白質(zhì)的方法。

缺點：靈敏度較低。干擾物有硫醇，以及具有肽性質(zhì)緩沖液，如Tris

緩沖液等。65

這是測定蛋白質(zhì)含量最靈敏的經(jīng)典方法之一，由于方法簡便，靈敏度高，常為實驗室所采用，也是文獻上用得最多的方法之一。

Folin-酚法(Lowry法)

(A)凡含有兩個及兩個以上肽鍵(-CO-NH-)的化合物在堿性溶液中(如Folin-甲試劑)都能與Cu2+作用，形成紫色的復(fù)合物；(B)所有的蛋白質(zhì)均可與Folin-甲試劑反應(yīng)形成紫色的銅-蛋白質(zhì)復(fù)合物；(C)銅-蛋白質(zhì)復(fù)合物在pH=10的堿性溶液中可將磷鉬酸-磷鎢酸(Folin-乙試劑)還原成蘭色的鉬藍和鎢藍混合物，其顏色的深淺(在一定范圍內(nèi))與蛋白質(zhì)的含量成正比。干擾物質(zhì)與雙縮脲法相同，而且受它們的影響更大。（附2）原理:66三種蛋白質(zhì)測定方法比較方法靈敏度原理干擾物質(zhì)紫外吸收法靈敏度較高50～100μg，比色杯的最小測量體積為0.1ml蛋白質(zhì)中的酪氨酸和色氨酸殘基在280nm處的光吸收各種嘌吟和嘧啶、各種核苷酸雙縮脲法（Biuret法）靈敏度低1～20mg多肽鍵＋堿性Cu2＋產(chǎn)生紫色絡(luò)合物硫酸銨、各種硫醇Tris緩沖液、Folin-酚法（Lowry法）靈敏度高～5μg雙縮脲反應(yīng)；磷鉬酸－磷鎢酸試劑還原成蘭色的鉬藍和鎢藍混合物硫酸銨、Tris緩沖液、各種硫醇、酚類、檸檬酸67本實驗Folin-酚法測定蛋白質(zhì)含量工作曲線的制作①取7支試管（干燥）按下表中順序加入各種試劑并進行反應(yīng)和測定試管號1234567蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液(ml)00.10.20.40.60.81.0

pH7.8磷酸緩沖液1.00.90.80.60.40.20Folin甲試劑1.01.01.01.01.01.01.0室溫下振蕩10minFolin乙試劑4.04.04.04.04.04.04.0

立即搖勻，于55℃水浴中保溫5min，用冷水冷卻1min，650nm處測吸光度A650

②以1號管為參比調(diào)零，記錄光密度值A(chǔ)650，以標(biāo)準(zhǔn)液的濃度為橫坐標(biāo)，A650值為縱坐標(biāo)，畫出工作曲線。

*蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液：200μg/ml

BSA68樣品的測定：取兩支試管（平行）各加入樣品液（稀成一定濃度的）1ml，其他操作（反應(yīng)和比色測定）同工作曲線的制作蛋白質(zhì)濃度的計算：蛋白含量測定的計算A650值對應(yīng)的μg數(shù)(Pr)×10-3

Pro溶液的ml數(shù)

×稀釋倍數(shù)Pro(mg/ml)=69制作工作曲線的注意事項1.分光光度計的使用：測樣時，光吸收值A(chǔ)應(yīng)在0.100-0.700之間，并小于標(biāo)準(zhǔn)曲線的最大值，否則，縮小或加大樣品的稀釋倍數(shù)，重測！702.比色杯的使用：1).洗凈（洗凈的標(biāo)準(zhǔn)是：透明、無痕跡、不掛水珠）后，置小燒杯內(nèi)用蒸餾水浸沒；2).用蒸餾水orbuffer校正（方法在儀器室講），然后在杯底標(biāo)上記號（0、1、2、3）；3).向杯中加樣液時，按濃度從低到高的順序加，注意加樣到比色杯的2/3處；如樣液有外溢，先用濾紙條吸干（不許搽）；再用鏡頭紙向一個方向搽至透明；4).將裝有參比、樣品溶液的比色杯放入比色杯架上時，要擺放在一條直線上；5).倒出液體后，一定要用洗瓶中的蒸餾水洗凈，然后倒置在濾紙上吸干；6).任何情況下都不許把比色杯放在儀器蓋上；7).各臺分光光度計的比色杯是配套的，不許隨意調(diào)換使用。713.工作曲線的制作：1）反應(yīng)：①取液量準(zhǔn)確：移液管洗凈、標(biāo)號、潤洗，最好同一人取樣；②溫度準(zhǔn)確：（恒溫水浴中放有溫度計），記時準(zhǔn)確（用秒表）；③所用的標(biāo)準(zhǔn)液、buffer、反應(yīng)液應(yīng)是同一批配制的；④加入Folin-乙試劑時要特別小心！因為Folin-乙試劑只有在酸性條件下穩(wěn)定，而反應(yīng)是在堿性溶液中進行，所以加入Folin-乙試劑后，一定要迅速搖勻（加一管搖一管）；2）測量：①由同一個人讀數(shù)；②制作標(biāo)準(zhǔn)曲線及測量樣品使用同一臺儀器；3）記錄：①實驗記錄要清晰，實驗結(jié)束后要請教師簽字；②記錄儀器使用情況。4）制圖：①標(biāo)明：曲線名稱、橫縱坐標(biāo)的單位、儀器號、使用時間；②注意實驗點的分布、大小（依據(jù)誤差）、直線的角度（最好在45度左右）③不許延長工作曲線（比耳定律適用于稀溶液中的反應(yīng)）。72結(jié)果及數(shù)據(jù)處理樣品V(ml)測酶活力測定蛋白含量稀釋倍數(shù)OD540稀釋倍數(shù)OD650E1E2E3

1.原始數(shù)據(jù)

2.洗脫曲線：

73

3.數(shù)據(jù)處理（有關(guān)計算）

1）[E]=葡萄糖mg數(shù)×（4.5/0.5）×E的的稀釋倍數(shù)/2ml=（）U/ml2）總活力：[E]×V3）[Pr]：查標(biāo)準(zhǔn)曲線

4）總Pr量：[Pr]×V5）比活力：[E]/[Pr]or總活力/總Pr量

6）階段收率：E2活力/E1活力、E3活力/E2活力

7）總收率：E3總活力/E1總活力

8）提純倍數(shù)：比活力n/比活力n-1，n=1，2，3

將計算出的數(shù)據(jù)添表：表格見后74蔗糖酶酶樣品酶濃度總活力蛋白濃度總蛋白量比活力提純倍數(shù)階段收率總收率（ml）（u/ml）（u）（mg/ml）（mg）（u/mg）（%）（%）樣品體積E1E2E375酶的提純過程記錄格式（設(shè)想的提純步驟）步驟總體積(ml)蛋白濃度(mg/ml)蛋白總量(mg)酶濃度(u/ml)比活力(u/mg)總活力(u)產(chǎn)率(%)提純倍數(shù)粗無細胞抽提液1000121200050.41650001001.0050oC熱變性除雜蛋白1000880004.80.604800961.44硫胺分級沉淀（30-50%）飽和度250375011.03.672730558.83DEAE離子交換層析（經(jīng)透析、濃縮）573536452182036.4125SephadexG-100100.929.2170185170034444765、蔗糖酶酶促反應(yīng)動力學(xué)研究77酶促反應(yīng)動力學(xué)？(Kineticsofenzyme-catalyzedreaction)

酶促反應(yīng)動力學(xué)是研究酶促反應(yīng)的速度以及影響此速度的各種因素的科學(xué)，是酶工程研究中的一個重要內(nèi)容。781、影響酶促反應(yīng)速度的因素

pH值溫度酶濃度底物濃度激活劑抑制劑79pH對酶反應(yīng)速度的影響

在一定的pH下,酶具有最大的催化活性,通常稱此pH為最適pH。80溫度對酶反應(yīng)速度的影響一方面是溫度升高,酶促反應(yīng)速度加快。另一方面,溫度升高,酶的高級結(jié)構(gòu)將發(fā)生變化或變性，導(dǎo)致酶活性降低甚至喪失。因此大多數(shù)酶都有一個最適溫度。在最適溫度條件下，反應(yīng)速度最大81酶濃度對酶反應(yīng)速度的影響

如果底物濃度足夠大，足以使酶飽和，則反應(yīng)速度與酶濃度成正比。82底物濃度對酶反應(yīng)速度的影響在低底物濃度時,反應(yīng)速度與底物濃度成正比，表現(xiàn)為一級反應(yīng)特征。當(dāng)?shù)孜餄舛冗_到一定值，幾乎所有的酶都與底物結(jié)合后，反應(yīng)速度達到最大（Vmax），此時再增加底物濃度，反應(yīng)速度不再增加，表現(xiàn)為零級反應(yīng)。832、酶促反應(yīng)動力學(xué)方程式——米氏學(xué)說[S]：底物濃度Ｋm：米氏常數(shù)Vmax：最大反應(yīng)速度V：不同[S]時的反應(yīng)速度MichaelisLandMentenML.,.BiochemZ.1913,49:333–369.84米氏常數(shù)（Km）的意義

Km值是酶的特征常數(shù)之一，只與酶的性質(zhì)有關(guān)，而與酶的濃度無關(guān)。

Km值作為常數(shù)只是對一定的底物、一定的pH、一定的溫度條件而言，測定酶的Km值可以作為鑒別酶的一種手段。

1/Km可以表示酶對底物親和力的大小,1/Km越大,表明親和力越大,多底物酶有不同的Km值,最適底物的Km值最小。85當(dāng)V=Vmax/2時，米氏方程變換為：

Vmax[S]Km＋[S]Vmax

2＝

V=1/2Vmax,Km=[S]

米氏常數(shù)是反應(yīng)速度為最大值的一半時的底物濃度。米氏常數(shù)的單位為mol/L。VmaxV[S]KmVmax/286

1Km11=

+

V

Vmax[S]Vmax雙倒數(shù)作圖法：、將米氏方程兩邊取倒數(shù)，可轉(zhuǎn)化為下列形式：Km和Vm的測定87

以1/V對1/[S]作圖得一直線，其斜率是Km/Vmax，在縱軸上的截距為1/Vmax,橫軸上的截距為-1/Km。885、蔗糖酶米氏常數(shù)的測定（本實驗）1）將離子交換柱層析得的E3稀釋(pH4.6HAc緩沖液)至15U/mL，共16ml。2）取試管8支，按0—7編號，0為對照管。3）按下表將蔗糖液、醋酸緩沖液分別加入試管中，于35℃水浴中保溫（使溫度平衡，以下同）10min。4）取約16ml酶液，放入同一水浴中保溫約10min。5）于各管中依次按同樣時間間隔加入已保溫過的酶液2ml，記時，立即搖勻。在35℃水浴中準(zhǔn)確反應(yīng)3min。6）按同樣次序和時間間隔，加入0.5ml的1mol/LNaOH，搖勻，終止反應(yīng)。7）吸取反應(yīng)混合物0.5ml，加入盛有3mlDNS試劑和1.5ml去離子水的血糖管中，放入沸水中加熱5min，冷卻后稀釋定容至25ml，搖勻后，測定A540值89反應(yīng)物活力測定數(shù)據(jù)處理管號0.1mol/L蔗糖液pH4.6buffer酶液（ml）1mol/LNaOH(ml)吸取反應(yīng)物(ml)DNS試劑(ml)水(ml)A540底物濃度(S)1/S1/A002.002.000.50.531.5010.41.602.000.50.531.50.01010020.51.502.000.50.531.50.01258030.61.402.000.50.531.50.01566.740.81.202.000.50.531.50.025051.01.002.000.50.531.50.0254061.50.502.000.50.531.50.037526.772.00.002.000.50.531.50.0502090數(shù)據(jù)處理：

以A值作為相對反應(yīng)速度，以1/S為橫坐標(biāo)，1/A為縱坐標(biāo)作圖，由圖求出Km和Vmax值。916、正交試驗法測定不同條件對蔗糖酶活性的影響92正交試驗設(shè)計(Orthogonalexperimentaldesign)

是研究多因素多水平的一種設(shè)計方法，它是從全面試驗中挑選出部分有代表性的點進行試驗，這些有代表性的點具備了“均勻分散，齊整可比”的特點。是一種高效率、快速、經(jīng)濟的實驗設(shè)計方法。日本著名的統(tǒng)計學(xué)家田口玄一將正交試驗選擇的水平組合列成表格，稱為正交表。93問題的提出—多因素的實驗問題例:某化工廠為提高產(chǎn)品的轉(zhuǎn)化率，選擇了三個有關(guān)的因素進行條件試驗，反應(yīng)溫度(A)，反應(yīng)時間(B)，用堿量(C)，并確定了它們的試驗范圍：A：80-90℃B：90-150minC：5-7%實驗?zāi)康氖歉闱宄蛩谹、B、C對轉(zhuǎn)化率的影響，哪些是主要因素，哪些是次要因素，從而確定最優(yōu)生產(chǎn)條件，即溫度、時間及用堿量各為多少才能使轉(zhuǎn)化率提高。94這里，對因素A、B、C在試驗范圍內(nèi)分別選取三個水平A：A1＝80℃、A2＝85℃、A3＝90℃B：B1＝90min、B2＝120min、B3＝150minC：C1＝5%、C2＝6%、C3＝7%正交試驗設(shè)計中，因素可以定量的，也可以是定性的，定量因素各水平間的距離可以相等也可以不等。95A1B1C1A2B1C1A3B1C1A1B1C2A2B1C2A3B1C2A1B1C3A2B1C3A3B1C3A1B2C1A2B2C1A3B2C1A1B2C2A2B2C2A3B2C2A1B2C3A2B2C3A3B2C3A1B3C1A2B3C1A3B3C1A1B3C2A2B3C2A3B3C2A1B3C3A2B3C3A3B3C3A1A2A3B3

B2B1C1C2C3取三因素三水平，通常有兩種試驗方法：(1)全面實驗法：共有33=27次試驗，如圖所示，立方體包含了27個節(jié)點，分別表示27次試驗。96全面試驗法的優(yōu)缺點：例如：選六個因素，每個因素選五個水平時，全面試驗的數(shù)目是56＝15625次。缺點：(1)試驗次數(shù)太多，費時、費事，當(dāng)因素水平比較多時，試驗無法完成。(2)不做重復(fù)試驗無法估計誤差。(3)無法區(qū)分因素的主次。優(yōu)點：對各因素與試驗指標(biāo)之間的關(guān)系剖析得比較清楚97變化一個因素而固定其它因素，如首先固定B、C于B1、C1，使A變化之，則：如果得出結(jié)果A3最好，則固定A于A3，C還是C1，使B變化，則：得出結(jié)果B2最好，則固定B于B2，A于A3，使C變化，則：實驗結(jié)果以C2最好。于是得出最佳工藝條件為A3B2C2。C1A3B2C2(ok)C3(2)簡單比較法：B1A3C1B2(ok)B3A1B1C1A2A3(ok)98A1A2A3B3B2B1C1C2C3簡單比較法的試驗點99缺點：

(1)試驗點不具代表性。考察的因素水平僅局限于局部區(qū)域，不能全面地反映因素的全面情況。(2)無法分清因素的主次。(3)如果不進行重復(fù)試驗，試驗誤差就估計不出來，因此無法確定最佳分析條件的精度。(4)無法利用數(shù)理統(tǒng)計方法對試驗結(jié)果進行分析。

簡單比較法的優(yōu)缺點優(yōu)點：實驗次數(shù)少100考慮兼顧全面試驗法和簡單比較法的優(yōu)點，利用根據(jù)數(shù)學(xué)原理制作好的規(guī)格化表－正交表來設(shè)計試驗不失為一種上策。用正交表來安排試驗及分析試驗結(jié)果，這種方法叫做正交試驗法。正交試驗的提出101正交試驗法優(yōu)點：（1）試驗點代表性強，試驗次數(shù)少。（2）不需做重復(fù)試驗，就可以估計試驗誤差。（3）可以分清因素的主次。（4）可以使用數(shù)理統(tǒng)計的方法處理試驗結(jié)果。正交試驗（表）法的特點：（1）均衡分散性─代表性。（2）整齊可比性─可以用數(shù)理統(tǒng)計方法對試驗結(jié)果進行處理。102A1A2A3B3B2B1C1C2C3123654789用正交實驗法只需要9次實驗103實驗需要考慮的結(jié)果稱為實驗指標(biāo)（簡稱指標(biāo)）可以直接用數(shù)量表示的叫定量指標(biāo)；不能用數(shù)量表示的叫定性指標(biāo)。定性指標(biāo)可以按評定結(jié)果打分或者評出等級，可以用數(shù)量表示，稱為定性指標(biāo)的定量化。實驗中要考慮的對實驗指標(biāo)可能有影響的變量簡稱為因素，用大寫字母A、B、C…表示每個因素可能出的狀態(tài)稱為因素的水平（簡稱水平）一、指標(biāo)、因素和水平104L8(27)正交表的代號正交表的橫行數(shù)字碼數(shù)（因素的水平數(shù)）正交表的縱列數(shù)（最多允許安排因素的個數(shù)）二、正交表符號的意義105正交表的特點：每個列中，“1”、“2”、“3”出現(xiàn)的次數(shù)相同；任意兩列，其橫方向形成的九個數(shù)字對中，恰好(1,1)、(1,2)、(1,3)、(2,1)(2,2)、(2,3)、(3,1)、(3,2)、(3,3)出現(xiàn)的次數(shù)相同這兩點稱為正交性：均衡分散，整齊可比，代表性強，效率高均衡分散：試驗點在試驗范圍內(nèi)排列規(guī)律整齊整齊可比：試驗點在試驗范圍內(nèi)散布均勻三、正交表的正交性（以L9(34)為例）1 1 1 1 12 1 2 2 23 1 3 3 34 2 1 2 35 2 23 16 2 3 1 27 3 1 3 28 3 2 1 39 3 3 2 1列號實驗號1234106（1）明確實驗?zāi)康模_定實驗指標(biāo)實驗?zāi)康氖歉闱宄嗀、B、C對轉(zhuǎn)化率的影響，實驗指標(biāo)為轉(zhuǎn)化率（2）確定因素－水平表因素水平A溫度（℃）B時間（min）C用堿量（x%）123808590901201505%6%7%因素水平ABC123A1A2A3B1B2B3C1C2C3四、用正交表安排實驗107A溫度（℃）1B時間（Min）2C用堿量（x%）34轉(zhuǎn)化率（x%）1 1(80℃) 1(90Min)1(5%)1312 1(80℃) 2(120Min) 2(6%)2543 1(80℃) 3(150Min) 3(7%) 3384 2(85℃) 1(90Min) 2(6%)3535 2(85℃)2(120Min)3(7%)1496 2(85℃)3(150Min) 1(5%) 2427 3(90℃)1(90Min) 3(7%) 2578 3(90℃)2(120Min) 1(5%) 3629 3(90℃)3(150Min) 2(6%) 164列號實驗號（4）確定實驗方案“因素順序上列，水平對號入座，橫著做”（3）選用合適正交表

本實驗可選取正交表L9(34)安排實驗。108五、正交實驗結(jié)果分析－極差分析法分析內(nèi)容：3個因素中，哪些因素對轉(zhuǎn)化率影響大，哪些因素影響小；如果某個因素對實驗數(shù)據(jù)影響大，那么它的哪個水平對提高轉(zhuǎn)化率有利。109對于因素A

A溫度（℃）1

B時間（Min）

2

C用堿量（x%）3

4轉(zhuǎn)化率（x%）1 1(80℃) 1(90Min)1(5%)1312 2(120Min) 2(6%)2543 3(150Min) 3(7%)3384 2(85℃) 1(90Min) 2(6%)3535 2(120Min)3(7%)1496 3(150Min) 1(5%)2427 3(90℃)1(90Min) 3(7%)2578 2(120Min) 1(5%)3629 3(150Min) 2(6%)164列號實驗號110從表中可以看出，A1、A2、A3各自所在的那組實驗中，其它因素（B、C）的1、2、3水平都分別出現(xiàn)了一次。計算方法如下：K1A=x1+x2+x3=31+54+38=123k1A=K1A/3=123/3=41K2A=x4+x5+x6=53+49+42=144k2A=K2A/3=144/3=48K3A=x7+x8+x9=57+62+64=183k3A=K3A/3=183/3=61我們比較K1A、

K2A、K3A時，可以認(rèn)為B、C對K1A、

K2A、K3A的影響是大體相同的。于是，可以把K1A、

K2A、K3A之間的差異看作是A取了三個不同水平引起的。——正交設(shè)計的整齊可比性111對于因素B

A溫度（℃）1

B時間（Min）

2

C用堿量（x%）3

4轉(zhuǎn)化率（x%）1 1(80℃) 1(90Min)1(5%) 1314 2(85℃) 2(6%) 3537 3(90℃) 3(7%) 2572 1(80℃) 2(120Min) 2(6%)2545 2(85℃)3(7%) 1498 3(90℃) 1(5%) 3623 1(80℃) 3(150Min) 3(7%) 3386 2(85℃) 1(5%) 2429 3(90℃) 2(6%) 164列號試驗號112同理可以算出：K1B=x1+x2+x3=31+53+57=141k1B=K1B/3=141/3=47K2B=x4+x5+x6=54+49+62=165k2B=K2B/3=165/3=55K3B=x7+x8+x9=38+42+64=

144k3B=K3B/3=183/3=48我們比較K1B、

K2B、K3B時，可以認(rèn)為A、C對K1B、

K2B、K3B的影響是大體相同的。于是，可以把K1B、

K2B、K3B之間的差異看作是B取了三個不同水平引起的。對于C與此同理113將每列的k1、

k2、k3中最大值于最小值之差稱為極差即：第一列（A因素）＝k3A－k1A＝61－41＝20第二列（B因素）＝k2B－k1B＝55－47＝8第三列（C因素）＝k2C－k1C＝57－45＝12影響大，就是該因素的不同水平對應(yīng)的平均轉(zhuǎn)化率之間的差異大直觀看出：一個因素對試驗結(jié)果影響大，就是主要因素本例中：因素主次為確定因素的主次ACB主

次114確定各因素應(yīng)取的水平

A溫度（℃）1

B時間（Min）

2

C用堿量（x%）3

4轉(zhuǎn)化率（x%）1 1(80℃) 1(90Min)1(5%) 1312 1(80℃) 2(120Min) 2(6%)2543 1(80℃) 3(150Min) 3(7%) 3384 2(85℃) 1(90Min) 2(6%) 3535 2(85℃)2(120Min)3(7%) 1496 2(85℃)3(150Min) 1(5%) 2427 3(90℃)1(90Min) 3(7%) 2578 3(90℃)2(120Min) 1(5%) 3629 3(90℃)3(150Min) 2(6%) 164列號試驗號K1＝123K2＝144K3＝183k1A=K1A/3=123/3=41k2A=K2A/3=144/3=48k3A=K3A/3=183/3=61本例要求指標(biāo)越大越好，應(yīng)取指標(biāo)最大的水平，k3A最大，故因素A應(yīng)該取A3115K1123141135

K2144165171K3183144144

k1414745

k24855