胰島自身抗體檢測技術新進展1型糖尿病(TIDM(ICA)、(GADA2(IA-2A(IAA)、8(ZnT8AT1DMICAGADAIA-2A疫(ELISA(R1A(RLA酶聯免疫吸附法分析法酶聯免疫吸附法分析法(ELISA)檢測GADA和IA-2A在國內外各級醫院應用較廣，目前檢測法主要基于3種不同原理設計。①包被抗原法(直接法)GAD9660min，洗滌，加入連接堿性磷酸酶的羊抗人免疫球蛋白抗體，室溫反應60min作用30min，加入NaOH溶液終止反應。在酶免儀上于405nm知待測血清GADA②包被抗體法(間接法)GADA(1A-2A96GADIA-2)抗原，4℃避光固定過夜。洗滌，加入預稀釋的血清，室溫作用90min，再加入連接堿性磷60min，加入NaOH溶液終止反應。在酶免儀上，于405nm可知待測血清GADAIA-2A)水平。該方法與直接法相比，靈敏度和特異性有所提高。③應用親和素和生物素放大系統的ELISA法親和素一生物素系統在ELISA中的應用有多種形式可用于間接包被亦可用于終反應放大。可以在固相上先預包被親和素，應用吸附法包被固相的抗體或抗原與生物素結合通過親和素一生物素反應而使生物素化的抗體或抗原固相化這種包被法不僅可增加吸附的抗體或抗原量而且使其結合點充分暴露另外在常規ELISA中的酶標抗體也可用生物素化的抗體替代，然后連接親和素 一酶結合物，以放大反應信號。“前放大”模式是放大了抗原包被量或使抗原表位充分暴露。其原理是：第一步GAD(IA-2GADA(或IA-2A(HRP)標記的抗人IgG與GADIA-2)抗體結合。HRP復合物與ABTSGADA(或IA-2A)水平。該方廠低抗體水平的正常人標本以及高抗體水平的T1DM“后放大”模式是放大了顯色信號。其原理是：將GAD(或IA-2)抗原包被在ELISA板上與血清中的GADA(或IA-2A)結合洗滌再加入結合生物素的GAD(或IA-2)與固定好的復合物結合。這樣GAD(或IA-2)—BIOTIN與GADA(或IA-2A)水平成正相關。加入鏈酶素過氧化物酶結合，再加入底物TMB顯色，讀取450nmF的吸光度，與標準曲線對照，即可得到血清中的GADA(或 IA-2A)水平。該方法批內CV為2.4-4.2%，批間CV靈敏度和特異性好。上升。我們的研究顯示不同原理設計的ELISA放射免疫分析法放射免疫法檢測GADA和IA-2A主要采用采用氯胺T標記法用125I標記GAD(或IA-2)與血清在分析緩沖液中4℃作用過夜。加入蛋白A—瓊脂糖后于4℃放置1h，沉淀經洗滌3次后進行放射計數以陽性參考血清為標準待測血清的活性定義為陽性血清的沉淀計數分率Masuda等采用此方法檢測了217例不同年齡與病程的IA-2A，發現陽性率為47%(103/217)，其中新發病的TIDM 陽性率57%(64/113)。有2.5%(1/40)的Grave's病患者用此方法檢測ftIA-2A陽性，T2DM患者IA-2A陽性率2.5%(5/204)。該方法與標準的放射配體檢測法結果相關系數r為0.78。我們的研究顯示采用RSR放射免疫試劑盒檢測GADA與放射配體法—致率達79.3%由于采用氯胺T標記法前必須獲得高純度及高活性的胰島自身抗原且在標記過程中有可能導致胰島自身抗原的損傷或空間構象的改變從而降低方法的靈敏度，故該法較少應用標準化分析。放射配體檢測法主要檢測方法是采用人GAD65(或IA-2)cDNA插入到原核表達質粒pcDNAⅡSP6啟動子下，構建重組質粒，并轉化宿主菌E．coli．DH10B后，通過原位雜交篩選出含重組質粒的陽性菌落，堿法提取質粒進行酶切和測序鑒定。將連接正確的重組質粒在轉染的E．coli．DHl0B中繁殖擴增，并抽提純化質粒。GAD65(或IA-2)的質粒在無蛋氨酸的兔網織紅細胞裂解液體系中，加入35S標記蛋氨酸(35S-Met)，經由體外轉錄/翻譯直接得到35S標記GAD65(1A-2)抗原。采用Sephadex柱凝膠層析或三氯醋酸(TCA)沉淀等方式去除游離的35S-Met。35S標記GAD65(IA-2)與血清旋轉孵育后，用蛋白A-瓊脂糖沉淀抗原抗體復合物。沉淀物經TBST緩沖液充分洗滌后，加入閃爍液置于液閃儀上計數，結果以抗體指數或國際標準單位形式報告。目前該方法是國際上檢測胰島自身抗體的標準化方法，我們于1996年在國內首次建立了該方法。2000年，對抗原抗體進行孵育，所需血清量小，適宜于大規模兒童人群的篩查；采用了Millipore本檢測。目前大多數歐美發達國家的權威實驗室均同時建立了該檢測法，我們于2004年在國內首次建立了該方法。胰島自身抗體檢測的標準化為了使各實驗室檢測胰島自身抗體的結果具有可比性(IDS(CDC)共同舉辦的糖(DASPWHO國際參考標準物，將結果報告換算成統一的國際單位形式，使各50例新診斷為T1DM100例健康人血清以及WHO1353已成為胰島自身抗體檢測的權威評估機構。我們分別20032005年的兩次DASP2003531520059自身抗體檢測水平步入國際先進行列。胰島自身抗體異質性研究胰島自身抗體的檢測是診斷T1DM的重要依據，而對自身抗體的異質性研究能進一步闡明自身免疫的發生與發展過程融合蛋白構建技術初步明確了抗體針對胰島抗原的粗略區域單克隆抗體封閉技術進一步辯明了抗體識別抗原某一肽段及表位擴展規律然而自身抗原具有高度構象和線性不連續的表位，抗體實際識別和接觸抗原的特定氨基酸難以確定利用特異性抗體篩選噬菌體隨機肽 展示文庫結合位點指導下突變技術有利于分析構象型的表位最終有望能鑒別抗體互補結合抗原的關鍵氨基酸殘基采用生物素化單克隆亞類特異性抗體并籍助鏈霉親合素瓊脂糖沉淀劑是目前檢測自身抗體亞類／同種型的主要手段。單克隆抗體技術可用于區分IA-2A／IA-2βA。采用蛋白變性劑洗脫或裂解法同樣能適用于胰島自身抗體親合力的檢測。諸多研究顯示，在T1DM擴展。對于GADA，最初出現與GADC端，擴展到N1A-2A，直接針對JM區和C末端，多IA-2／IA-2β表位的反應IgG亞類存在與GAD65-Ab陽性的T1DMIA-2AIgGT1DM目前發現IgE-IA-28(ZnT8A)①ZnT8蛋白ZnT8屬于CDF(陽離子擴散易化)家族，含369個氨基酸。為基因SLC30A8(染色體8q24．11)編碼，所有的蛋白有著相同的染色體組織結構，即8個外顯子和7個內含子。與IGRP等其他糖尿病自身抗原一樣，ZnT8是一種6次跨膜蛋白。預測序列在第四和第五螺旋結構中包含豐富的組氨酸區域。哺乳動物與人ZnT8蛋白非常相似(98%保守的氨基酸)，提示其進化過程的高度保守性。②ZnT8表達部位僅定位于胰島p③ZnT8生理作用能使鋅摻入到胰島素囊泡ft，易化鋅—胰島素固相六聚體的形α細胞和β細胞分泌的胰高血糖素以及胰島素旁分泌和自分泌的調節表達增高能刺激鋅的富集和增加胰島素分泌Ins—1E細胞內鋅濃度。而且，ZnT8ATP／ADP比率增高封閉了ATPKATP通路、胰島素合成與儲存以及。細胞水平。故目前國際研究認為ZnT8④ZnT8A由于ZnT8Hutton2007年首次采用構建ZnT8融合蛋白技術建立了ZnT8ZnT8C-和N，末端單鏈分子蛋白結構的序列連接起來，插入到35S_metTNTT735S