關于抗生素發酵的代謝與控制第一頁，共六十頁，2022年，8月28日1、次級代謝產物和初級代謝產物的關系2、抗生素產生菌的幾種主要代謝調節機制3、細胞生長期和抗生素生產期的相互關系4、抗生素合成的關鍵酶5、影響次級代謝產物產量的因素及改進措施第二頁，共六十頁，2022年，8月28日初級代謝產物：微生物產生的對自身生長和繁殖必須的物質。而產生這些物質的代謝體系稱為初級代謝(primarymetabolism)。初級代謝體系具體可分為：分解代謝體系素材性生物合成體系結構性生物合成體系第一節、初級代謝產物和初級代謝第三頁，共六十頁，2022年，8月28日次級代謝是指微生物在一定的生長時期，以初級代謝產物為前體，合成一些對微生物的生命活動無明確功能的物質的過程。這一過程的產物，即為次級代謝產物。次級代謝是相對于初級代謝而提出的一個概念。次級代謝產物大多是分子結構比較復雜的化合物。根據其作用，可將其分為抗生素、激素、生物堿、毒素及維生素等類型。第四頁，共六十頁，2022年，8月28日次級代謝與初級代謝關系密切，初級代謝的關鍵性中間產物往往是次級代謝的前體，比如糖降解過程中的乙酰-CoA是合成四環素、紅霉素的前體。次級代謝一般在菌體對數生長后期或穩定期間進行，但會受到環境條件的影響；某些催化次級代謝的酶的專一性不高；次級代謝產物的合成，因菌株不同而異，但與分類地位無關；質粒與次級代謝的關系密切，控制著多種抗生素的合成。1、初級代謝與次級代謝的關系第五頁，共六十頁，2022年，8月28日第六頁，共六十頁，2022年，8月28日第七頁，共六十頁，2022年，8月28日從上圖可以看出，許多物質處于代謝的分叉點上，例如：CH3CO-SCoA，是葡萄糖糖經HMP、EMP生成的中間物質，經羧化后可形成丙二酰輔酶A，丙二酰輔酶A可用于脂肪酸的合成上，進而又可經多次重復縮合、環化等形成四環素類或其他抗菌素等次級代謝產物，而CH3COSCoA又可以進入TCA循環，這類物質稱之為：分叉中間體，還有丙酮酸、草酰乙酸、莽草酸等；這些分叉中間體把微生物的次級代謝和初級代謝緊密地聯系起來。第八頁，共六十頁，2022年，8月28日次級代謝產物一般不在產生菌的生長期產生，而在隨后的生產期形成；2.種類繁多，結構特殊，含有不常見的化合物（如：抗生素、毒素、色素和生物堿等）；含有少見的化學鍵（如：吩嗪、吡咯、喹啉、聚乙烯和多烯的不飽和鍵等）；2、微生物次級代謝的特征第九頁，共六十頁，2022年，8月28日一種微生物的不同菌株可以產生分子結構迥異的次級代謝物；不同種類的微生物也能產生同一種次級代謝物；次級代謝產物的合成比生長對環境因素更敏感。如菌體生長，磷酸鹽濃度0.3～300mmol/L；產物合成，磷酸鹽濃度0.1～10mmol/L；第十頁，共六十頁，2022年，8月28日3、次級代謝產物的生物合成①養分的攝入；②通過中樞代謝途徑（初級代謝）養分轉化為中間體；③小分子建筑單位（前體，進入次級代謝）的形成；④前體進入次級代謝生物合成途徑；⑤在次級代謝的主要骨架形成后作最后的修飾，成為產物。第十一頁，共六十頁，2022年，8月28日4、次級代謝產物生物合成主要調節機制①.酶合成的誘導調節；②.反饋調節；③.磷酸鹽的調節；④.ATP的調節作用；第十二頁，共六十頁，2022年，8月28日①能量供應不足是啟動寡聚酮化合物合成的關鍵因素。如在金霉素合成期高產菌株胞內ATP濃度比低產菌株的低許多；且其腺苷酸的合成能力低，故其能量代謝活性較低。②ATP對初級代謝產物的某些酶，如檸檬酸合成酶與PEP羧化酶的活性有變構抑制作用。低濃度的ATP促進PEP羧化形成草酰乙酸，并由此生成丙二酰CoA。ATP的調節作用第十三頁，共六十頁，2022年，8月28日一、概述狹義抗生素:由微生物（包括細菌、放線菌、真菌等）產生的在低濃度條件下，對特異微生物（包括細菌、真菌、立克次體、支原體、衣原體等）的生長有抑制作用的次級代謝產物或化學半合成法制造的相同的和類似的化合物。第二節、抗生素產生菌的代謝與調節第十四頁，共六十頁，2022年，8月28日廣義抗生素：①由微生物產生的抗菌及抗其他病原微生物的物質；②與微生物產物相同的化學合成物。即首先發現于微生物代謝物中，如氯霉素；③以微生物產物為原料，經化學反應所得的衍生物或鹽類；④由以上三種來源的驅蟲物質。第十五頁，共六十頁，2022年，8月28日現代抗生素定義是生物在其生產活動過程中所產生，并能在低微濃度下有選擇性的抑制或殺滅其他微生物或腫瘤細胞的有機物。歷史：

1929年，英國費萊明發現青霉素，二戰期間，大規模發酵生產，也是世界上最早用于臨床的抗菌素。隨后，氯霉素（1947年）、新霉素（1949年）、土霉素（1950年）、紅霉素（1952年）、四環素（1953年）、頭孢菌素（1959年）、喹諾酮類（1980年）……也都相繼被發現。第十六頁，共六十頁，2022年，8月28日根據抗生素的作用機制分類抑制細胞壁合成：青霉素；抑制細胞膜功能：多烯類抗生素；抑制蛋白質合成：四環素；抑制核酸合成：絲裂霉素。第十七頁，共六十頁，2022年，8月28日根據抗生素的化學結構分類：β-內酰胺類β-lactam：青霉素類penicillins、頭孢霉素類cephalosporins；氨基糖苷類aminoglycosides：鏈霉素、慶大霉素；大環內酯類macrolides：紅霉素、麥迪加霉素；四環類tetracyclines：四環素、土霉素；多肽類polymyxin：多粘菌素。第十八頁，共六十頁，2022年，8月28日二、細胞生長期和抗生素生產期

的相互關系微生物的生長曲線可分為4個期：延滯期、對數期、穩定期和衰老期。抗生素發酵可分為2個代謝期：生長期（營養期）和生產期（抗生素分泌期）。不少抗菌素只能在生產期產生：鏈霉素、青霉素、金霉素、紅霉素等。也有的生產期和生長期平行，如氯霉素。第十九頁，共六十頁，2022年，8月28日

在生長期，微生物按一定比例吸收和利用主要營養物質而快速生長。生長期結束時，一種主要營養物質（如P，N或S）可能消耗殆盡或降低到一定程度，成為限制因素，使菌體的生長速度減慢或保持平衡狀態，轉入生產期。生長期中負責抗生素合成的酶處于被阻遏的狀態，如鏈霉素生物合成中的轉脒基酶，青霉素生物合成中的酰基轉移酶和苯乙酸活化酶。一旦菌體生長接近生長末期，解除對相關酶的阻遏。第二十頁，共六十頁，2022年，8月28日為什么抗生素發酵明顯分為兩個階段？為什么生長期負責抗生素合成的酶受到阻遏？由生長期過渡到生產期的因素是什么？

從微生物的遺傳控制來看，可根據操縱子學說和代謝調節機制來探討。問題：第二十一頁，共六十頁，2022年，8月28日R：阻遏基因P：啟動基因O：操縱基因S：結構基因E：酶第二十二頁，共六十頁，2022年，8月28日抗生素合成酶在生長期中被阻遏的可能機制：（1）阻遏蛋白有兩個位點，分別與操縱基因和誘導物結合。誘導物結合后，阻遏蛋白就發生變構，不能與操縱基因結合，結構酶解除阻遏，能夠合成。生長期中誘導物尚未積累，抗生素合成酶處于被阻遏狀態。生長末期，菌體代謝的變化使誘導物積累或外源加入誘導物，解除阻遏，從而合成抗生素。第二十三頁，共六十頁，2022年，8月28日（2）在生長期中，產生了易利用碳源的分解代謝產物，這些產物對生產期的基因產生分解代謝產物阻遏。當分解代謝產物被利用后，才解除對生產期基因的阻遏。例如：葡萄糖的分解代謝產物能阻遏合成放線菌素D的關鍵酶——吩噁嗪酮合成酶。當葡萄糖耗盡時，該酶才合成。第二十四頁，共六十頁，2022年，8月28日（3）初級代謝終產物對次級代謝產生反饋阻遏作用，當這種終產物耗盡時，生產期的結構基因的受阻遏狀態才被解除。（4）抗生素合成途徑受高能化合物的阻遏作用。當ATP量減少后，阻遏作用被解除。第二十五頁，共六十頁，2022年，8月28日（5）生長期RNA聚合酶只能啟動生長期基因的轉錄作用，不能附著在操縱生產期的啟動基因上，結果次級代謝產物的合成酶基因受阻遏。菌體停止生長后，酶的結構發生改變，允許RNA聚合酶啟動生長期基因的轉錄作用。第二十六頁，共六十頁，2022年，8月28日

參與抗生素生物合成的酶什么時候出現？其合成如何控制？哪些初級代謝活動能供給抗生素生物合成的前體物質？上述兩種系統如何協調以保證抗生素合成高效進行？三、抗生素生物合成的調節與控制第二十七頁，共六十頁，2022年，8月28日酶的誘導及解除阻遏；碳源分解代謝產物調節；氮源分解代謝產物調節；磷酸鹽的調節；反饋調節；細胞膜透性的調節；抗生素生物合成的終止。第二十八頁，共六十頁，2022年，8月28日1、參與抗生素合成的酶的誘導及解除阻遏：很多參與抗生素合成的酶由誘導作用產生：

誘導酶需要誘導物存在才能形成，如：甘露糖鏈霉素酶的形成需要α-甲基甘露糖苷、甘露聚糖等誘導；6-氨基-葡萄糖-2-去氧鏈酶胺是卡那霉素生物合成中卡那霉素乙酰轉移酶的誘導物。具有誘導作用的物質只有在菌體生長末期加入才有誘導作用，在菌的旺盛生長期及次級代謝合成期加入不起作用，說明酶的誘導與生長速率有關。第二十九頁，共六十頁，2022年，8月28日為什么酶的誘導與生長速率有關？微生物生長速率的降低證明微生物的生長受到了外界環境條件（多為營養條件）限制，初級代謝活動不能平衡進行，造成中間產物的積累，誘導了次級代謝合成酶的合成。生長速率降低，可能使已合成的生物大分子轉化作用加強，造成具有誘導作用的低分子物質的濃度升高而產生作用。第三十頁，共六十頁，2022年，8月28日2、碳源分解代謝產物調節碳分解代謝產物調節分為分解產物阻遏和分解產物抑制兩種。分解產物的調節機制至今尚不完全清楚（在E.coli中與cAMP有關），可能與具有調節作用的底物的代謝速率有關。第三十一頁，共六十頁，2022年，8月28日在抗生素的生物合成中這兩種調節方式都是存在的。葡萄糖對放線菌素、嘌呤霉素的合成產生分解產物阻遏。葡萄糖對青霉素、新霉素合成的影響可能是由于葡萄糖的分解產物抑制作用。第三十二頁，共六十頁，2022年，8月28日抗生素產生菌抗生素產生菌放線菌素桿菌肽頭孢菌素氯霉素鏈霉菌地衣型芽孢桿菌丁頭霉菌委內瑞拉鏈霉菌卡那霉素絲裂霉素鏈霉素青霉素卡那霉素鏈霉菌頭狀鏈霉菌灰色鏈霉菌產黃青霉表受葡萄糖抑制的抗生素生產第三十三頁，共六十頁，2022年，8月28日3、氮源分解代謝產物調節（1）氮源與抗生素的合成有些抗生素的合成受氨和其他能被迅速利用的氮源的阻遏。例如：紅霉素的合成在氮受限制的情況下可一直進行到發酵液中的氮源耗竭為止。如在生產中添加利用的氮源，紅霉素的合成會立即停止。因此抗生素發酵宜選用較難消化的氮源。黃豆餅粉降解成氨基酸或氨的速度很慢，不至于抑制抗生素的合成，因此常作為抗生素工業發酵的氮源。第三十四頁，共六十頁，2022年，8月28日（2）抗生素分子中的氮原子的來源直接前體氨基酸、嘌呤和嘧啶的代謝過程為抗生素的生物合成提供含氮前體。氮轉移反應

氨基糖苷類抗生素的生物合成包括多步氮轉移反應，包括轉氨基，轉脒基，轉氨甲酰基等。如果這些抗生素合成酶受氮源阻遏，須補加適當濃度的氨基或脒基供體（如Gln，Ala，Glu，Arg等）。第三十五頁，共六十頁，2022年，8月28日絲裂霉素C的生物合成PEP+E-4-P由莽草酸途徑合成PEP：磷酸烯醇式丙酮酸E-4-P：赤蘚糖-4-磷酸與D-葡萄糖胺有關精氨酸瓜氨酸第三十六頁，共六十頁，2022年，8月28日（3）初級氮代謝物及氨鹽的調節某些氨基酸除了直接參與生長和作為次級代謝產物的前體外，還有調節次級代謝物合成的功能。

例如：色氨酸可誘導麥角堿生物合成酶二甲烯基丙基色氨酸合成酶的合成，增加該酶的活力；諾爾思鏈霉菌谷胺酰胺合成酶受到高濃度銨離子的阻遏。第三十七頁，共六十頁，2022年，8月28日4、磷酸鹽的調節磷酸鹽不僅是菌體生長的主要限制性營養成分，還是調節抗生素生物合成的重要參數。表現在：過量磷酸鹽對四環類、氨基糖苷類和多烯大環內酯類等32種抗生素的生物合成產生抑制作用。工業生產中常需控制在亞適量。當磷酸鹽0.3～300mmol/L時明顯促進菌體生長；濃度為10mmol/L或大于10mmol/L時對許多抗生素的合成產生抑制。第三十八頁，共六十頁，2022年，8月28日磷酸鹽的調節作用歸納如下：無機磷促進初級代謝，抑制次級代謝無機磷過量，葡萄糖代謝速率加快，胞內DNA，RNA和蛋白質的量增加，呼吸速率上升，次級代謝的合成受阻，或使其生物合成馬上停止。無機磷對比生長速率、產物合成速率的影響生二素鏈霉菌的螺旋霉素生產能力受其生長速率的影響，而生長速率又取決于初磷濃度。螺旋霉素的比生長速率隨初磷濃度升高，與比生產速率成反比。第三十九頁，共六十頁，2022年，8月28日無機磷與糖分解代謝途徑的影響無機磷濃度增加時磷酸戊糖途徑的代謝活性降低，而酵解途徑活性增加。HMP途徑提供NADH2或前體不足，會影響次級代謝產物合成。磷限制次級代謝產物合成的誘導物的合成磷通過抑制麥角堿生物合成的誘導物色氨酸來抑制麥角堿的生物合成，其原因是高濃度的磷抑制HMP途徑，使色氨酸生成減少。第四十頁，共六十頁，2022年，8月28日過量磷抑制次級代謝產物的前體的生成磷抑制或阻遏次級代謝產物合成所必需的磷酸酯酶

鏈霉素、新霉素、紫霉素等合成途徑的中間物均為磷酸化物，需要磷酸酯酶的參加，該酶受到磷酸的抑制或阻遏。第四十一頁，共六十頁，2022年，8月28日5、反饋調節抗生素的生物合成途徑中，反饋調節起著重要作用。抗生素本身的積累起反饋調節作用。

如：青霉素，氯霉素抗生素的前體是初級代謝產物時，初級代謝產物的形成受到反饋調節，會影響抗生素的形成。

如：青霉素前體物是纈氨酸，纈氨酸的合成受到的反饋調節就會影響青霉素的合成。第四十二頁，共六十頁，2022年，8月28日初級與次級代謝間存在分叉中間體，由交叉中間體產生的初級代謝終產物的反饋調節可影響次級代謝產物的形成。分叉中間體主要有：莽草酸，乙酰CoA和α-氨基己二酸。丙二酰CoA既可以在初級代謝中合成脂肪酸，也可以經縮合，環化或閉環生成四環素類或其他類抗生素。如青霉素合成中賴氨酸的反饋抑制。Lys抑制青霉素前體之一的a-氨基己二酸的合成途徑的酶的活性或酶量。第四十三頁，共六十頁，2022年，8月28日6、細胞膜透性的調節細胞膜透性的調節是代謝調節的一個重要方面。在青霉素發酵中，產生菌細胞膜輸入硫化物能力的大小是影響青霉素發酵單位高低的一個因素，因為菌體需要足夠的硫源來合成青霉素，如輸入硫化物的能力增大，硫源供應充足，合成青霉素的量就增多。誘變獲得的青霉素高產菌中，有的菌株提高了膜攝取無機硫酸鹽的濃度。第四十四頁，共六十頁，2022年，8月28日7、抗生素生物合成的終止抗生素生產周期取決于產生菌的遺傳特性和環境條件。在抗生素合成酶形成后抗生素生物合成的速率在一定時間里直線上升，但不同菌種維持時間不同。抗生素合成的終止有以下機制：第四十五頁，共六十頁，2022年，8月28日（1）抗生素合成酶的不可逆衰退

多肽類抗生素合成酶的活力在抗生素生產開始后幾小時就開始下降，其機制尚不清楚，短桿菌肽S合成酶失活的機制可能是：酶被蛋白水解酶分解為大小不同的兩個亞單位。酶的失活與氧有關，氧使酶的巰基氧化鈍化。通入氮可除去氧防止酶失活，指數期供給大量氧而后期維持適當水平也有利于抗生素生成。第四十六頁，共六十頁，2022年，8月28日（2）受自身合成的抗生素反饋調節

已證實氯霉素、環己酰亞胺、嘌呤霉素、制霉菌素、霉酚酸和青霉素等抑制自身的生物合成。產生菌的抗生素抑制其生物合成的程度一般與該菌株的生產能力有關。第四十七頁，共六十頁，2022年，8月28日四、人工克服微生物次級代謝

調控作用的限制改進發酵條件：添加誘導物，控制磷的含量，控制葡萄糖的濃度等。誘變育種：回復突變解除反饋調節，抗結構類似物突變株。基因工程在提高生產性能上的應用：強化網絡調控機構；改變表達體系；擴增抗生素產生菌的抗性基因；提高編碼關鍵酶的基因劑量；提高轉譯水平的表達效率；增強重組菌的生長能力；調節性啟動子。第四十八頁，共六十頁，2022年，8月28日1、強化網絡調控機構途徑特定調控基因：基因產物為途徑特異的激活蛋白，如使其在對數生長期表達，可使抗生素合成提前。如放線紫紅素調節基因：act-ORF4。多效調控基因：多種基因的協調作用。如：天藍色鏈霉菌的基因：afsR、afsB和bldA之間的協調作用。強化中間體的表達：波賽鏈霉菌轉入dnrR1和dnrR2多拷貝質粒，可使柔紅霉素中間體紫紅霉酮大量增加。基因工程在提高生產性能上的應用：第四十九頁，共六十頁，2022年，8月28日2、改變表達體系引入全部結構基因的克隆：

將結構基因克隆，導入生產菌表達。如：將酚霉素（肽類抗生素，含89個L-氨基酸）的結構基因PHM插入質粒中，轉化大腸桿菌，可使產量提高。引入通用調節基因：

通用調節基因可以調控多種抗生素的生物合成。如變鉛青鏈霉菌調節基因afsR2可以誘導變鉛青鏈霉菌和天藍色鏈霉菌的兩種結構不相干的抗生素——放線紫紅素和十一烷基靈桿菌素的生物合成。將afsR2引入S.avermitilis菌可促進阿凡曼菌素生產。第五十頁，共六十頁，2022年，8月28日3、擴增抗生素產生菌的抗性基因提高菌種對其自身抗生素的耐受能力是高產的先決條件。如使卡那霉素鏈霉菌編碼乙酰基轉移酶的基因在卡那霉素鏈霉菌中表達可使卡那霉素產量比野生型提高4.5倍。第五十一頁，共六十頁，2022年，8月28日4、提高編碼關鍵酶的基因劑量通過定點誘變或增加基因劑量有可能提高關鍵酶的活性，從而提高產物的表達量。乙酰氧頭孢菌素C合成酶是抗生素合成的限制步驟，克隆該酶的基因cefCF并轉化到頭孢霉中可使頭孢菌素C產量提高25％。第五十二頁，共六十頁，2022年，8月28日5、提高轉譯水平的表達效率重組頭孢菌素C的脫乙酰基酶（