第八章液相色譜分析

第一節概述第二節柱色譜法第三節薄層色譜法第四節紙色譜法第八章液相色譜分析第一節概述1第八章液相色譜法-課件2色譜法(chromatography)概述歷史：1903年，俄國植物學家MikhailTswett最先發明。他采用填充有固體CaCO3細粒子的玻璃柱，將植物色素的混合物(葉綠素和葉黃素chlorophylls&xanthophylls)加于柱頂端，然后以石油醚淋洗，被分離的組份在柱中顯示了不同的色帶，他稱之為色譜(希臘語“chroma”=color;“graphein”=write)。色譜法(chromatography)概述歷史：1903年，3概述

在色譜法中，將填入玻璃管或不銹鋼管內靜止不動的一相（固體或液體）稱為固定相；自上而下運動的一相（一般是氣體或液體）稱為流動相；裝有固定相的管子（玻璃管或不銹鋼管）稱為色譜柱。當流動相中樣品混合物經過固定相時，就會與固定相發生作用，由于各組分在性質和結構上的差異，與固定相相互作用的類型、強弱也有差異，因此在同一推動力的作用下，不同組分在固定相滯留時間長短不同，從而按先后不同的次序從固定相中流出。概述在色譜法中，將填入玻璃管或不銹鋼管內靜止不動4色譜法的分類按兩相狀態分類

固定相

流動相1.氣體為流動相的色譜稱氣相色譜（gaschromatography,GC）固體液體液體氣體氣相色譜氣-固色譜（GSC）氣-液色譜（GLC）色譜法的分類按兩相狀態分類固體液體液體氣體氣相色譜氣-固色譜5第八章液相色譜法-課件6色譜法的分類2.液體為流動相的色譜稱液相色譜（liqudchromatography,LC）

液相色譜液-固色譜（LSC）液-液色譜（LLC）色譜法的分類2.液體為流動相的色譜稱液相色譜液相色譜液-固7色譜法的分類按分離機理分類

1.利用組分在吸附劑（固定相）上的吸附能力強弱不同而得以分離的方法，稱為吸附色譜法。2.利用組分在固定液（固定相）中溶解度不同而達到分離的方法稱為分配色譜法。3.利用組分在離子交換劑（固定相）上的親和力大小不同而達到分離的方法，稱為離子交換色譜法。色譜法的分類按分離機理分類8色譜法的分類4.利用大小不同的分子在多孔固定相中的選擇滲透而達到分離的方法，稱為凝膠色譜法或分子排阻色譜法。最近，又有一種新分離技術，利用不同組分與固定相（固定化分子）的高專屬性親和力進行分離的技術稱為親和色譜法，常用于蛋白質的分離。色譜法的分類4.利用大小不同的分子在多孔固9色譜法的分類吸附色譜：不同組份在固定相的吸附作用不同；分配色譜：不同組份在固定相上的溶解能力不同；離子交換色譜：不同組份在固定相（離子交換劑）上的親和力不同；凝膠色譜（尺寸排阻色譜）:不同尺寸分子在固定相上的滲透作用。色譜法的分類吸附色譜：不同組份在固定相的吸附作用不同；10色譜法的分類

按操作形式分類1.固定相裝于柱內的色譜法，稱為柱色譜。2.固定相呈平板狀的色譜，稱為平板色譜，它又可分為薄層色譜和紙色譜。色譜法的分類按操作形式分類11色譜法基本原理分配系數K在一定溫度和壓力下，組分在固定相和流動相之間分配達平衡時的濃度(或溶解度)之比值，即色譜法基本原理分配系數K12色譜法基本原理色譜機理不同，分配系數的含義不同：吸附色譜—K為吸附平衡常數分配色譜—K為分配系數離子交換色譜—K為交換系數分子排阻色譜—K為滲透系數色譜法基本原理色譜機理不同，分配系數的含義不同：13色譜法基本原理色譜分離過程的特點:1.差速遷移;2.譜帶擴展.色譜法的定義:色譜法是利用混合物各組分在兩相(固定相和流動相)中分布的差異，使固定相對各組分的保留作用不同產生差速遷移而得到分離的一種物理化學分離分析方法。色譜法基本原理色譜分離過程的特點:14色譜法基本原理分配系數與保留行為的關系溶質在色譜柱中被保留的程度常用保留比（retentionratio）R表示。R≤1色譜法基本原理分配系數與保留行為的關系15第二節柱色譜法一、液－固吸附柱色譜法二、液－液分配柱色譜法三、離子交換柱色譜法四、凝膠柱色譜法五、柱色譜法的應用第二節柱色譜法一、液－固吸附柱色譜法16第二節柱色譜法

將固定相均勻填在金屬或玻璃制成的管中做成層析柱，并以此進行分離的方法叫柱色譜法。根據作用原理，可分為：吸附柱色譜法分配柱色譜法離子交換柱色譜法凝膠柱色譜法第二節柱色譜法將固定相均勻填在金屬或玻璃17第二節柱色譜法一、液－固吸附色譜法liquid-solidadsorptionchromatography固定相—固體吸附劑流動相—液體原理：利用吸附劑對不同組分的吸附能力的差異而實行分離。第二節柱色譜法一、液－固吸附色譜法18第二節柱色譜法吸附作用固體吸附劑是一些多孔性物質，表面上有許多吸附點或稱吸附中心。吸附劑之所以具有吸附作用，主要靠吸附劑表面的吸附點位。硅膠吸附劑：第二節柱色譜法吸附作用19第二節柱色譜法吸附平衡Xm+nYaXa+nYm吸附平衡常數式中：X—溶質分子；Y—流動相分子m—流動相；n—流動相分子系數；a—吸附劑表面

組分的吸附系數Ka越大，越容易被吸附，保留時間越長，流出色譜柱就越慢。第二節柱色譜法吸附平衡20第二節柱色譜法吸附劑極其選擇對吸附劑的要求：1.具有較大的表面積與適宜的活性。2.與流動相極其樣品中各組分不發生化學反應，在流動相中不溶解。3.吸附劑顆粒應有一定的細度，并且顆粒要均勻。第二節柱色譜法吸附劑極其選擇21第二節柱色譜法常用的吸附劑有：氧化鋁、硅膠、聚酰胺硅膠：呈微酸性適用于分離酸性和中性物質，如：有機酸、氨基酸、萜類、甾類等的分離。第二節柱色譜法常用的吸附劑有：22硅膠具有多孔性的硅氧交聯結構硅膠骨架表面有許多硅醇基硅膠骨架表面的羥基與水結合形成水合硅醇基第二節柱色譜法硅膠結構硅膠具有多孔性的硅氧交聯結構硅膠骨架表面有許多硅醇基硅膠骨架23

加熱500oC時，交聯內部的結構水不可逆的失去，硅醇結構變為硅氧烷結構。硅膠結構加熱500oC時，交聯內部的結構水不可逆的失24第二節柱色譜法氧化鋁堿性（pH=9~10）中性（pH≈7.5）酸性（pH=5~4）堿性氧化鋁適用于分堿性和中性物質分離，如生物堿。中性氧化鋁適用于分離生物堿、揮發油、萜類、甾類、酯類等。酸性氧化鋁適用于分離酸性氧化物，如氨基酸、酸性色素等。第二節柱色譜法氧化鋁25第二節柱色譜法氧化鋁的分離機理第二節柱色譜法氧化鋁的分離機理26第二節柱色譜法流動相的選擇應考慮以下三個方面：1.被分離物質的結構與性質2.吸附劑的性能3.流動相的極性選擇的規律:試樣組分的極性大，應選用吸附活性較弱的吸附劑，極性較大的流動相；試樣組分的極性較小，應選用吸附活性較強的吸附劑，極性較小的流動相；第二節柱色譜法流動相的選擇27第二節柱色譜法常見取代基的極性猶大到小的順序是：烷烴<烯烴<醚類<硝基化合物<二甲胺<酯類<酮類<醛類<硫醇<胺類<酰胺<醇類<酚類<羧酸類第二節柱色譜法常見取代基的極性猶大到小的順序是：28第二節柱色譜法常用流動相的極性由強到弱的順序為：石油醚<環己烷<四氯化碳<苯<甲苯<乙醚<氯仿<醋酸乙酯<正丁醇<丙酮<乙醇<甲醇<水第二節柱色譜法常用流動相的極性由強到弱的順序為：29第二節柱色譜法二、液－液分配色譜liquid-liquidpartitionchromatography固定相—液體流動相—液體原理：

利用混合物中不同的組分在兩相中有著不同的分配系數（溶解度）而實行分離的。第二節柱色譜法二、液－液分配色譜30第二節柱色譜法固定相分配柱色譜法的固定相由擔體和固定液組成。擔體（載體）：是一種惰性物質，不具吸附作用，只起負載固定液的作用。常用的擔體有：多孔硅藻土、纖維素、硅膠等。第二節柱色譜法固定相31第二節柱色譜法流動相分配色譜中的流動相與固定相的極性應相差很大，才能互不相溶。常用的流動相：石油醚、醇類、酮類、酯類、鹵代烷及苯或它們的混合物。第二節柱色譜法流動相32第二節柱色譜法三、離子交換色譜法ion-exchangechromatography固定相—離子交換樹脂流動相—水溶液分離對象：離子型化合物原理：

利用各種離子對交樹脂的競爭交換能力不同而實行分離的。第二節柱色譜法三、離子交換色譜法33第二節柱色譜法離子交換樹脂的分類陽離子交換樹脂陰離子交換樹脂離子交換樹脂第二節柱色譜法離子交換樹脂的分類陽離子交換樹脂陰離子交換34第二節柱色譜法陽離子交換樹脂在樹脂骨架結構上引入的是酸性基團，如磺酸基—SO3H，羧基—COOH和酚羥基—OH等。這些酸性基團上的H+可以和溶液中陽離子發生交換反應，故有陽離子交換樹脂之稱。陽離子交換反應為：nR—SO3H+Mn+(R—SO3)nM+nH+第二節柱色譜法陽離子交換樹脂35第二節柱色譜法陰離子交換樹脂在樹脂骨架結構上引入的是堿性基團，如季胺基—N(CH3)3+，伯胺基—NH2和仲胺基—NHCH3等。則這些堿性基團上的OH-可以和溶液中陰離子發生交換反應，故有陰離子交換樹脂之稱。陰離子交換反應為：R—N(CH3)3OH+Cl－R—N(CH3)3Cl+OH－第二節柱色譜法陰離子交換樹脂36第二節柱色譜法離子交換平衡離子交換反應用下面通式表示:當反應達到平衡時,可用交換平衡常數表示:[A+]r、[B+]r分別表示樹脂中A+、B+離子濃度[A+]、[B+]分別表示水溶液中A+、B+離子濃度第二節柱色譜法離子交換平衡[A+]r、[B+]r分別表示37第二節柱色譜法選擇系數與分配系數的關系可表示如下：

KB/A大；KB大；A+先出

KB/A小；KA大；B+先出第二節柱色譜法選擇系數與分配系數的關系可表示如下：38第二節柱色譜法四、凝膠柱色譜法size-exclusionchromatography固定相—交換樹脂流動相—水溶液分離對象：蛋白質及其它大分子化合物原理：按分子大小分離。小分子可以擴散到凝膠空隙，由其中通過，出峰最慢；中等分子只能通過部分凝膠空隙，中速通過；而大分子被排斥在外，出峰最快；溶劑分子小，故在最后出峰。第二節柱色譜法四、凝膠柱色譜法39親和色譜（AC）Affinitychromatograph（了解）原理：利用生物大分子和固定相表面存在的某種特異性親和力，進行選擇性分離。

先在載體表面鍵合上一種具有一般反應性能的所謂間隔臂(環氧、聯胺等)，再連接上配基(酶、抗原等)，這種固載化的配基將只能和具有親和力特性吸附的生物大分子作用而被保留。改變淋洗液后洗脫。親和色譜（AC）原理：利用生物大分子和固定相40第二節柱色譜法柱色譜法的應用1.分離純制2.鹽類的測定第二節柱色譜法柱色譜法的應用41第三節薄層色譜法基本原理吸附劑的選擇展開劑的選擇操作的方法定性和定量分析第三節薄層色譜法基本原理42第三節薄層色譜法

將固定相均勻地鋪在具有光潔表面的玻璃、塑料或金屬薄片表面上形成薄層，在此薄層上進行色譜分離的方法稱為薄層色譜法。根據作用原理，可分為：吸附柱色譜法分配柱色譜法離子交換柱色譜法凝膠柱色譜法第三節薄層色譜法將固定相均勻地鋪在具有光43第三節薄層色譜法薄層色譜法的特點：1.展開時間短；2.分離能力強；3.靈敏度高；4.顯色方便；5.設備簡單，操作方便。第三節薄層色譜法薄層色譜法的特點：44第三節薄層色譜法薄層色譜法的特點設備簡單，操作方便。只須一塊玻璃板和一個層析缸。分析原理與經典柱上色譜相同、但是在敞開的薄層上可以檢查混合物的成分是否分開可觀察。快速，展開的時間短。比紙上色譜快速。一般紙上色譜需要幾小時至幾十小時薄層色譜一般只需十幾分鐘或幾十分鐘。使用無機吸附劑，薄層色譜可以采用腐蝕性的顯色劑，如濃硫酸、濃鹽酸和濃磷酸。對于特別難以檢出的化合物，可以噴以濃硫酸，然后小心加熱，使有機物碳化，顯棕斑點，紙紙上色譜則無法檢出。廣泛地選用各種固定相，比紙上色譜有顯著的靈活性。廣泛地選用各流動相，比氣相色譜靈活。第三節薄層色譜法薄層色譜法的特點45第三節薄層色譜法紙上色譜法斑點的擴散作用嚴重，降低了單位面積小樣品的濃度，降低檢出靈敏度。薄層色譜法擴散作用較少，斑點比較密集，檢以靈敏度較高。薄層色譜法適于分析小量樣品(一般兒到幾十微克，甚至小到上述的l-11)，也適于大量樣品的分離（可以分離出幾毫克甚至幾十毫克組分）。可以采用多種展開方式：如，雙向展開，多次展開，分步展開，連續展開；分離原理是的物理化學原理，例如，吸附色譜，分配色譜，離于交換，薄層電泳，薄層等電聚焦。適于分析熱不穩定，難揮發的樣品。

第三節薄層色譜法紙上色譜法斑點的擴散作用嚴重，降低了單位46第三節薄層色譜法薄層色譜法分離原理薄層色譜分離法是將固定相吸附劑均勻地涂在玻璃上制成薄層板，試樣中的各組分在固定相和作為展開劑的流動相之間不斷地發生溶解、吸附、再溶解、再吸附的分配過程。不同物質上升的距離不一樣而形成相互分開的斑點從而達到分離。第三節薄層色譜法薄層色譜法分離原理47BAabcRf值的測量示意圖比移值與相對比移值比移值試樣展開后各組分斑點在薄板上的位置可用比移值Rf來表示。第三節薄層色譜法BAabcRf值的測量示意圖比移值與相對比移值第三節薄層48第三節薄層色譜法Rf取值范圍:0~1Rf可用范圍:0.2~0.8Rf最佳范圍:0.3~0.5第三節薄層色譜法Rf取值范圍:0~149第三節薄層色譜法相對比移值第三節薄層色譜法相對比移值50第三節薄層色譜法吸附劑的選擇硅膠：微酸性極性固定相，常用吸附劑，其活度與含水量有關，適用于酸性、中性物質分離。氧化鋁：堿性極性固定相，適用于堿性、中性物質分離，根據制備時的pH不同，又分為堿性、中性和酸性。聚酰胺：含有酰胺基極性固定相，適用于酚類、醇類化合物的分離(分離易生成氫鍵的極性化合物)。纖維素：含有羥基的極性固定相，適用于分離親水性物質(極性有機化合物及金屬陽離子、陰離子分離)。第三節薄層色譜法吸附劑的選擇51第三節薄層色譜法展開劑的選擇

在吸附薄層色譜中，選擇展開劑的一般原則和吸附柱色譜中選則流動相的原則相似。即極性大的組分需用極性大展開劑，極性小的組分需用極性小展開劑。第三節薄層色譜法展開劑的選擇52第三節薄層色譜法吸附劑和展開劑的一般選擇原則是：非極性組分的分離選用活性強的吸附劑，用非極性展開劑；極性組分的分離，選用活性弱的吸附劑，用極性展開劑。實際工作中要經過多次實驗來確定。第三節薄層色譜法吸附劑和展開劑的一般選擇原則是：非極53第三節薄層色譜法薄層色譜法中常用的溶劑，按由弱到強的極性順序排列是：石油醚<環己烷<二硫化碳<四氯化碳<三氯乙烷<苯<甲苯<二氯甲烷<氯仿<乙醚<乙酸乙酯<丙酮<正丙醇<乙醇<甲醇<吡啶<酸<水第三節薄層色譜法薄層色譜法中常用的溶劑，按由弱到強的極性54第三節薄層色譜法操作方法薄層色譜法的一般操作程序:1.制板2.點樣定性分析用玻璃毛細管點樣定量用微量注射器3.展開4.顯色第三節薄層色譜法操作方法55第三節薄層色譜法展開方式

上行法：展開速度慢、容易達到平衡，分離效果好下行法：展開速度快、適用于易分離的組分分離

雙向法：使用兩種展開劑、90度展開、適用于難分離的混合物的分離第三節薄層色譜法展開方式

上行法：展開速度慢、容易達到平56第三節薄層色譜法定性和定量的分析定性分析定量分析1.目視比較法2.斑點洗脫法3.薄層掃描法第三節薄層色譜法定性和定量的分析57第四節紙色譜法紙色譜分離法1．方法原理

原理：紙上色譜分離法是根據不同物質在固定相和流動相間的分配比不同而進行分離的。

固定相：濾紙——利用紙上吸著的水分(一般的紙吸著約等于自身質量20％的水分)

流動相：有機溶劑

操作：點樣、展開、干燥、顯色、測定（定性和定量）第四節紙色譜法紙色譜分離法58第四節紙色譜法.應用

甘氨酸、丙氨酸和谷氨酸混合氨基酸的分離

展開劑：正丁醇：冰醋酸：水＝4：1：2

顯色：茚三酮

葡萄糖、麥芽糖和木糖混合糖類的分離

展開劑：正丁醇：冰醋酸：水＝4：1：5

顯色：用硝酸銀氨溶液噴灑，即出現Ag的褐色斑點。

定性：由Rf值可判斷是哪種糖；葡萄糖的Rf為0.16，麥芽糖的Rf為0.11．木糖的Rf是0.2第四節紙色譜法.應用

甘氨酸、丙氨酸和谷氨酸混合氨基酸59第四節紙色譜法第四節紙色譜法60習題6.在吸附色譜中，以硅膠為固定相，當用氯仿為固定相時，樣品中某些組分保留時間太短，若改用氯仿-甲醇（1:1）時，則樣品中各組分的保留時間是變長，還是變得更短？為什么？解：變得更短，因為流動相的極性增大。習題6.在吸附色譜中，以硅膠為固定相，當61習題7.已知某混合物中A、B、C三組分的分配系數分別為440、480及520，問三組分在吸附薄層上的Rf值順序如何？解：Rf(C)<Rf(B)<

Rf(A)習題7.已知某混合物中A、B、C三組分的62習題8.在硅膠薄層板A上，以苯-甲醇(1:3)為展開劑，某物質的Rf值為0.50；在硅膠薄層板B上，用相同的展開劑，該物質的Rf值降為0.40。問A、B兩種硅膠板，哪一種板的活性大些？解：A<BBAabcRf值的測量示意圖習題8.在硅膠薄層板A上，以苯-甲醇(163習題9.某一色譜柱長10cm，流動相流速為0.01cm/sec，組分A的洗脫時間為40分鐘。問A在流動相中消耗的時間及Rf值各是多少？解：習題9.某一色譜柱長10cm，流動相流速為0.01cm/64習題10.已知化合物A在薄層板上從樣品原點遷移7.6cm，樣品原點至溶劑前沿16.2cm，試計算(a)化合物A的Rf值，(b)在相同的薄層板上，展開系統相同時，樣品原點至溶劑前沿14.3cm，化合物A的斑點應在此薄層板上何處？解：習題10.已知化合物A在薄層板上從樣品原點65習題11.已知A與B兩物質的相對比移值為1.5。當B物質在某薄層板上展開后，斑點距原點9cm，此時溶劑前沿到原點為18cm，問A若在此板上同時展開，A物質的展距應為多少？A物質的Rf值應為多少？解：習題11.已知A與B兩物質的相對比移值為66習題12.今有兩種性質相似的組分A和B，共存于同一溶液中。用紙色譜分離時，它們的Rf值分別為0.45、0.63，欲使分離后兩斑點中心間的距離為2cm，問濾紙條應取多長？解:習題12.今有兩種性質相似的組分A和B，共67第八章液相色譜分析

第一節概述第二節柱色譜法第三節薄層色譜法第四節紙色譜法第八章液相色譜分析第一節概述68第八章液相色譜法-課件69色譜法(chromatography)概述歷史：1903年，俄國植物學家MikhailTswett最先發明。他采用填充有固體CaCO3細粒子的玻璃柱，將植物色素的混合物(葉綠素和葉黃素chlorophylls&xanthophylls)加于柱頂端，然后以石油醚淋洗，被分離的組份在柱中顯示了不同的色帶，他稱之為色譜(希臘語“chroma”=color;“graphein”=write)。色譜法(chromatography)概述歷史：1903年，70概述

在色譜法中，將填入玻璃管或不銹鋼管內靜止不動的一相（固體或液體）稱為固定相；自上而下運動的一相（一般是氣體或液體）稱為流動相；裝有固定相的管子（玻璃管或不銹鋼管）稱為色譜柱。當流動相中樣品混合物經過固定相時，就會與固定相發生作用，由于各組分在性質和結構上的差異，與固定相相互作用的類型、強弱也有差異，因此在同一推動力的作用下，不同組分在固定相滯留時間長短不同，從而按先后不同的次序從固定相中流出。概述在色譜法中，將填入玻璃管或不銹鋼管內靜止不動71色譜法的分類按兩相狀態分類

固定相

流動相1.氣體為流動相的色譜稱氣相色譜（gaschromatography,GC）固體液體液體氣體氣相色譜氣-固色譜（GSC）氣-液色譜（GLC）色譜法的分類按兩相狀態分類固體液體液體氣體氣相色譜氣-固色譜72第八章液相色譜法-課件73色譜法的分類2.液體為流動相的色譜稱液相色譜（liqudchromatography,LC）

液相色譜液-固色譜（LSC）液-液色譜（LLC）色譜法的分類2.液體為流動相的色譜稱液相色譜液相色譜液-固74色譜法的分類按分離機理分類

1.利用組分在吸附劑（固定相）上的吸附能力強弱不同而得以分離的方法，稱為吸附色譜法。2.利用組分在固定液（固定相）中溶解度不同而達到分離的方法稱為分配色譜法。3.利用組分在離子交換劑（固定相）上的親和力大小不同而達到分離的方法，稱為離子交換色譜法。色譜法的分類按分離機理分類75色譜法的分類4.利用大小不同的分子在多孔固定相中的選擇滲透而達到分離的方法，稱為凝膠色譜法或分子排阻色譜法。最近，又有一種新分離技術，利用不同組分與固定相（固定化分子）的高專屬性親和力進行分離的技術稱為親和色譜法，常用于蛋白質的分離。色譜法的分類4.利用大小不同的分子在多孔固76色譜法的分類吸附色譜：不同組份在固定相的吸附作用不同；分配色譜：不同組份在固定相上的溶解能力不同；離子交換色譜：不同組份在固定相（離子交換劑）上的親和力不同；凝膠色譜（尺寸排阻色譜）:不同尺寸分子在固定相上的滲透作用。色譜法的分類吸附色譜：不同組份在固定相的吸附作用不同；77色譜法的分類

按操作形式分類1.固定相裝于柱內的色譜法，稱為柱色譜。2.固定相呈平板狀的色譜，稱為平板色譜，它又可分為薄層色譜和紙色譜。色譜法的分類按操作形式分類78色譜法基本原理分配系數K在一定溫度和壓力下，組分在固定相和流動相之間分配達平衡時的濃度(或溶解度)之比值，即色譜法基本原理分配系數K79色譜法基本原理色譜機理不同，分配系數的含義不同：吸附色譜—K為吸附平衡常數分配色譜—K為分配系數離子交換色譜—K為交換系數分子排阻色譜—K為滲透系數色譜法基本原理色譜機理不同，分配系數的含義不同：80色譜法基本原理色譜分離過程的特點:1.差速遷移;2.譜帶擴展.色譜法的定義:色譜法是利用混合物各組分在兩相(固定相和流動相)中分布的差異，使固定相對各組分的保留作用不同產生差速遷移而得到分離的一種物理化學分離分析方法。色譜法基本原理色譜分離過程的特點:81色譜法基本原理分配系數與保留行為的關系溶質在色譜柱中被保留的程度常用保留比（retentionratio）R表示。R≤1色譜法基本原理分配系數與保留行為的關系82第二節柱色譜法一、液－固吸附柱色譜法二、液－液分配柱色譜法三、離子交換柱色譜法四、凝膠柱色譜法五、柱色譜法的應用第二節柱色譜法一、液－固吸附柱色譜法83第二節柱色譜法

將固定相均勻填在金屬或玻璃制成的管中做成層析柱，并以此進行分離的方法叫柱色譜法。根據作用原理，可分為：吸附柱色譜法分配柱色譜法離子交換柱色譜法凝膠柱色譜法第二節柱色譜法將固定相均勻填在金屬或玻璃84第二節柱色譜法一、液－固吸附色譜法liquid-solidadsorptionchromatography固定相—固體吸附劑流動相—液體原理：利用吸附劑對不同組分的吸附能力的差異而實行分離。第二節柱色譜法一、液－固吸附色譜法85第二節柱色譜法吸附作用固體吸附劑是一些多孔性物質，表面上有許多吸附點或稱吸附中心。吸附劑之所以具有吸附作用，主要靠吸附劑表面的吸附點位。硅膠吸附劑：第二節柱色譜法吸附作用86第二節柱色譜法吸附平衡Xm+nYaXa+nYm吸附平衡常數式中：X—溶質分子；Y—流動相分子m—流動相；n—流動相分子系數；a—吸附劑表面

組分的吸附系數Ka越大，越容易被吸附，保留時間越長，流出色譜柱就越慢。第二節柱色譜法吸附平衡87第二節柱色譜法吸附劑極其選擇對吸附劑的要求：1.具有較大的表面積與適宜的活性。2.與流動相極其樣品中各組分不發生化學反應，在流動相中不溶解。3.吸附劑顆粒應有一定的細度，并且顆粒要均勻。第二節柱色譜法吸附劑極其選擇88第二節柱色譜法常用的吸附劑有：氧化鋁、硅膠、聚酰胺硅膠：呈微酸性適用于分離酸性和中性物質，如：有機酸、氨基酸、萜類、甾類等的分離。第二節柱色譜法常用的吸附劑有：89硅膠具有多孔性的硅氧交聯結構硅膠骨架表面有許多硅醇基硅膠骨架表面的羥基與水結合形成水合硅醇基第二節柱色譜法硅膠結構硅膠具有多孔性的硅氧交聯結構硅膠骨架表面有許多硅醇基硅膠骨架90

加熱500oC時，交聯內部的結構水不可逆的失去，硅醇結構變為硅氧烷結構。硅膠結構加熱500oC時，交聯內部的結構水不可逆的失91第二節柱色譜法氧化鋁堿性（pH=9~10）中性（pH≈7.5）酸性（pH=5~4）堿性氧化鋁適用于分堿性和中性物質分離，如生物堿。中性氧化鋁適用于分離生物堿、揮發油、萜類、甾類、酯類等。酸性氧化鋁適用于分離酸性氧化物，如氨基酸、酸性色素等。第二節柱色譜法氧化鋁92第二節柱色譜法氧化鋁的分離機理第二節柱色譜法氧化鋁的分離機理93第二節柱色譜法流動相的選擇應考慮以下三個方面：1.被分離物質的結構與性質2.吸附劑的性能3.流動相的極性選擇的規律:試樣組分的極性大，應選用吸附活性較弱的吸附劑，極性較大的流動相；試樣組分的極性較小，應選用吸附活性較強的吸附劑，極性較小的流動相；第二節柱色譜法流動相的選擇94第二節柱色譜法常見取代基的極性猶大到小的順序是：烷烴<烯烴<醚類<硝基化合物<二甲胺<酯類<酮類<醛類<硫醇<胺類<酰胺<醇類<酚類<羧酸類第二節柱色譜法常見取代基的極性猶大到小的順序是：95第二節柱色譜法常用流動相的極性由強到弱的順序為：石油醚<環己烷<四氯化碳<苯<甲苯<乙醚<氯仿<醋酸乙酯<正丁醇<丙酮<乙醇<甲醇<水第二節柱色譜法常用流動相的極性由強到弱的順序為：96第二節柱色譜法二、液－液分配色譜liquid-liquidpartitionchromatography固定相—液體流動相—液體原理：

利用混合物中不同的組分在兩相中有著不同的分配系數（溶解度）而實行分離的。第二節柱色譜法二、液－液分配色譜97第二節柱色譜法固定相分配柱色譜法的固定相由擔體和固定液組成。擔體（載體）：是一種惰性物質，不具吸附作用，只起負載固定液的作用。常用的擔體有：多孔硅藻土、纖維素、硅膠等。第二節柱色譜法固定相98第二節柱色譜法流動相分配色譜中的流動相與固定相的極性應相差很大，才能互不相溶。常用的流動相：石油醚、醇類、酮類、酯類、鹵代烷及苯或它們的混合物。第二節柱色譜法流動相99第二節柱色譜法三、離子交換色譜法ion-exchangechromatography固定相—離子交換樹脂流動相—水溶液分離對象：離子型化合物原理：

利用各種離子對交樹脂的競爭交換能力不同而實行分離的。第二節柱色譜法三、離子交換色譜法100第二節柱色譜法離子交換樹脂的分類陽離子交換樹脂陰離子交換樹脂離子交換樹脂第二節柱色譜法離子交換樹脂的分類陽離子交換樹脂陰離子交換101第二節柱色譜法陽離子交換樹脂在樹脂骨架結構上引入的是酸性基團，如磺酸基—SO3H，羧基—COOH和酚羥基—OH等。這些酸性基團上的H+可以和溶液中陽離子發生交換反應，故有陽離子交換樹脂之稱。陽離子交換反應為：nR—SO3H+Mn+(R—SO3)nM+nH+第二節柱色譜法陽離子交換樹脂102第二節柱色譜法陰離子交換樹脂在樹脂骨架結構上引入的是堿性基團，如季胺基—N(CH3)3+，伯胺基—NH2和仲胺基—NHCH3等。則這些堿性基團上的OH-可以和溶液中陰離子發生交換反應，故有陰離子交換樹脂之稱。陰離子交換反應為：R—N(CH3)3OH+Cl－R—N(CH3)3Cl+OH－第二節柱色譜法陰離子交換樹脂103第二節柱色譜法離子交換平衡離子交換反應用下面通式表示:當反應達到平衡時,可用交換平衡常數表示:[A+]r、[B+]r分別表示樹脂中A+、B+離子濃度[A+]、[B+]分別表示水溶液中A+、B+離子濃度第二節柱色譜法離子交換平衡[A+]r、[B+]r分別表示104第二節柱色譜法選擇系數與分配系數的關系可表示如下：

KB/A大；KB大；A+先出

KB/A小；KA大；B+先出第二節柱色譜法選擇系數與分配系數的關系可表示如下：105第二節柱色譜法四、凝膠柱色譜法size-exclusionchromatography固定相—交換樹脂流動相—水溶液分離對象：蛋白質及其它大分子化合物原理：按分子大小分離。小分子可以擴散到凝膠空隙，由其中通過，出峰最慢；中等分子只能通過部分凝膠空隙，中速通過；而大分子被排斥在外，出峰最快；溶劑分子小，故在最后出峰。第二節柱色譜法四、凝膠柱色譜法106親和色譜（AC）Affinitychromatograph（了解）原理：利用生物大分子和固定相表面存在的某種特異性親和力，進行選擇性分離。

先在載體表面鍵合上一種具有一般反應性能的所謂間隔臂(環氧、聯胺等)，再連接上配基(酶、抗原等)，這種固載化的配基將只能和具有親和力特性吸附的生物大分子作用而被保留。改變淋洗液后洗脫。親和色譜（AC）原理：利用生物大分子和固定相107第二節柱色譜法柱色譜法的應用1.分離純制2.鹽類的測定第二節柱色譜法柱色譜法的應用108第三節薄層色譜法基本原理吸附劑的選擇展開劑的選擇操作的方法定性和定量分析第三節薄層色譜法基本原理109第三節薄層色譜法

將固定相均勻地鋪在具有光潔表面的玻璃、塑料或金屬薄片表面上形成薄層，在此薄層上進行色譜分離的方法稱為薄層色譜法。根據作用原理，可分為：吸附柱色譜法分配柱色譜法離子交換柱色譜法凝膠柱色譜法第三節薄層色譜法將固定相均勻地鋪在具有光110第三節薄層色譜法薄層色譜法的特點：1.展開時間短；2.分離能力強；3.靈敏度高；4.顯色方便；5.設備簡單，操作方便。第三節薄層色譜法薄層色譜法的特點：111第三節薄層色譜法薄層色譜法的特點設備簡單，操作方便。只須一塊玻璃板和一個層析缸。分析原理與經典柱上色譜相同、但是在敞開的薄層上可以檢查混合物的成分是否分開可觀察。快速，展開的時間短。比紙上色譜快速。一般紙上色譜需要幾小時至幾十小時薄層色譜一般只需十幾分鐘或幾十分鐘。使用無機吸附劑，薄層色譜可以采用腐蝕性的顯色劑，如濃硫酸、濃鹽酸和濃磷酸。對于特別難以檢出的化合物，可以噴以濃硫酸，然后小心加熱，使有機物碳化，顯棕斑點，紙紙上色譜則無法檢出。廣泛地選用各種固定相，比紙上色譜有顯著的靈活性。廣泛地選用各流動相，比氣相色譜靈活。第三節薄層色譜法薄層色譜法的特點112第三節薄層色譜法紙上色譜法斑點的擴散作用嚴重，降低了單位面積小樣品的濃度，降低檢出靈敏度。薄層色譜法擴散作用較少，斑點比較密集，檢以靈敏度較高。薄層色譜法適于分析小量樣品(一般兒到幾十微克，甚至小到上述的l-11)，也適于大量樣品的分離（可以分離出幾毫克甚至幾十毫克組分）。可以采用多種展開方式：如，雙向展開，多次展開，分步展開，連續展開；分離原理是的物理化學原理，例如，吸附色譜，分配色譜，離于交換，薄層電泳，薄層等電聚焦。適于分析熱不穩定，難揮發的樣品。

第三節薄層色譜法紙上色譜法斑點的擴散作用嚴重，降低了單位113第三節薄層色譜法薄層色譜法分離原理薄層色譜分離法是將固定相吸附劑均勻地涂在玻璃上制成薄層板，試樣中的各組分在固定相和作為展開劑的流動相之間不斷地發生溶解、吸附、再溶解、再吸附的分配過程。不同物質上升的距離不一樣而形成相互分開的斑點從而達到分離。第三節薄層色譜法薄層色譜法分離原理114BAabcRf值的測量示意圖比移值與相對比移值比移值試樣展開后各組分斑點在薄板上的位置可用比移值Rf來表示。第三節薄層色譜法BAabcRf值的測量示意圖比移值與相對比移值第三節薄層115第三節薄層色譜法Rf取值范圍:0~1Rf可用范圍:0.2~0.8Rf最佳范圍:0.3~0.5第三節薄層色譜法Rf取值范圍:0~1116第三節薄層色譜法相對比移值第三節薄層色譜法相對比移值117第三節薄層色譜法吸附劑的選擇硅膠：微酸性極性固定相，常用吸附劑，其活度與含水量有關，適用于酸性、中性物質分離。氧化鋁：堿性極性固定相，適用于堿性、中性物質分離，根據制備時的pH不同，又分為堿性、中性和酸性。聚酰胺：含有酰胺基極性固定相，適用于酚類、醇類化合物的分離(分離易生成氫鍵的極性化合物)。纖維素：含有羥基的極性固定相，適用于分離親水性物質(極性有機化合物及金屬陽離子、陰離子分離)。第三節薄層色譜法吸附劑的選擇118第三節薄層色譜法展開劑的選擇

在吸附薄層色譜中，選擇展開劑的一般原則和吸附柱色譜中選則流動相的原則相似。即極性大的組分需用極性大展開劑，極性小的組分需用極性小展開劑。第三節薄層色譜法展開劑的選擇119第三節薄層色譜法吸附劑和展開劑的一般選擇原則是：非極性組分的分離選用活性強的吸附劑，用非極性展開劑；極性組分的分離，選用活性弱的吸附劑，用極性展開劑。實際工作中要經過多次實驗來確定。第三節薄層色譜法吸附劑和展開劑的一般選擇原則是：非極120第三節薄層色譜法薄層色譜法中常用的溶劑，按由弱到強的極性順序排列是：石油醚<環己烷<二硫化碳<四氯化碳<三氯乙烷<苯<甲苯<二氯甲烷<氯仿<乙醚<乙酸乙酯<丙酮<正丙醇<乙醇<甲醇<吡啶<酸<水第三節薄層色譜法薄層色譜法中常用的溶劑