1.2基因工程的基本操作程序目的基因的檢測與鑒定目的基因的獲取基因表達載體的構建將目的基因導入受體細胞基因工程的基本操作程序主要包括四個步驟1、原核細胞的基因結構非編碼區非編碼區編碼區編碼區上游編碼區下游與RNA聚合酶結合位點啟動子終止子啟動子：位于基因的首端的一段特殊的DNA片斷，它是RNA聚合酶識別和結合的部位，有了它才能驅動基因轉錄出mRNA，最終獲得蛋白質終止子：位于基因的尾端的一段特殊的DNA片斷，能終止mRNA的轉錄RNA聚合酶:能夠識別啟動子上結合位點的一種蛋白質.RNA聚合酶能夠識別調控序列中的結合位點，并與其結合。轉錄開始后，RNA聚合酶沿DNA分子移動，并以DNA分子的一條鏈為模板合成RNA。轉錄完畢后，RNA鏈釋放出來，緊接著RNA聚合酶也從DNA模板鏈上脫落下來。①不能轉錄為信使RNA，不能編碼蛋白質。：能轉錄相應的信使RNA，能編碼蛋白質編碼區非編碼區原核細胞基因結構②有調控遺傳信息表達的核苷酸序列.包括啟動子和終止子2.真核細胞的基因結構編碼區非編碼區非編碼區內含子

外顯子

轉錄mRNA前體加工翻譯肽鏈啟動子終止子成熟mRNA能夠編碼蛋白質的序列。不能夠編碼蛋白質的序列。

外顯子:

內含子:

真核細胞的基因結構編碼區非編碼區外顯子：能編碼蛋白質的序列內含子：不能編碼蛋白質的序列：有調控作用的核苷酸序列，包括位于編碼區上游的RNA聚合酶結合位點（啟動子）。非編碼序列：包括非編碼區和內含子原核細胞真核細胞不同點編碼區是_____的編碼區是間隔的、_____的相同點都由能夠編碼蛋白質的______和具有調控作用的______區組成的3、原核細胞與真核細胞的基因結構比較思考編碼相同數目氨基酸的蛋白質，原核細胞與真核細胞基因結構一樣長嗎？連續不連續編碼區非編碼閱讀與思考1、什么是目的基因？2、獲取目的基因的方法有哪些？其操作過程分別是怎樣的？請閱讀P9第一和二兩段1、目的基因概念：主要指的是編碼蛋白質的結構基因。也可以是一些具有調控作用的因子。2、目的基因獲取方法：Ⅰ、從基因文庫中獲取目的基因Ⅱ、利用PCR技術擴增目的基因Ⅲ、化學方法直接人工合成一、目的基因的獲取Ⅰ、從基因文庫中獲取目的基基因基因文庫基因組文庫部分基因文庫庫基因文庫的構構建過程限制酶拼接到載體上導入受體細胞擴增將含有某種生生物不同基因因的許多DNA片斷,導導入到受體菌的群體體中,各個受體體菌分別含有有這種生物的的不同基因,稱為基因文文庫。基因組文庫cDNA文庫庫的構建-----反轉錄法：以目的基因轉轉錄成的信使使RNA為模模板，反轉錄錄成互補的單單鏈DNA，，然后在酶的的作用下合成成雙鏈DNA，從而獲得得所需的基因因。目的基因的mRNA單鏈DNA反轉錄酶DNA聚合酶酶雙鏈DNA(目的基因)基因文庫的構構建過程真核生物的基基因用逆轉錄錄法得到的cDNA與原原基因相同嗎嗎？有哪些差差異？原核生生物基因呢？？思考？基因組文庫和和部分基因組組文庫(cDNA文庫)比較怎樣從基因文文庫中得到我我們所需的目目的基因呢?如何從基因文文庫中找到所所需要的基因因？依據------目的基基因的有關信信息。如：根據基因因的核苷酸序序列基因的功能基因在染色體體上的位置基因的轉錄產產物mRNA基因翻譯產物物蛋白質等特特性。構建基因組DNA文庫時時，首先應分分離細胞的A、染色體DNAB、線粒體體DNAC、總mRNAD、、tRNA目的基因可從從基因文庫中中獲得，下列列有關基因文文庫的描述正正確的是A、某生物的的全套基因就就是一個基因因文庫B、將含有某某種生物不同同的許多DNA片段，導導入某個生物物體內，則則這個生物就就是一個基因因文庫C、含有一種種生物所有基基因的基因文文庫叫做基因因組文庫D、含有一種種生物的一部部分基因的基基因文庫叫cDNA文庫庫ACⅡ、利用PCR技術擴增目的基因因PCR的全稱稱：聚合酶鏈式反反應PCR的原理理：DNA復制PCR技術擴擴增目的基因因的前提條件件：要有一段已知知的目的基因因的核苷酸序序列。選修3、P58模板原料引物酶控制溫度利用PCR技術擴增目的基因因——目的基因因DNA——四種脫氧氧核苷酸——如單鏈DNA分子片片段，使DNA聚合酶能能夠從引物的的3’端開始始連接脫氧核核苷酸——耐熱的DNA聚合酶酶——PCR儀儀自動調控PCR的條件件：過程：a、DNA變變性（90℃-95℃）：雙雙鏈DNA模模板在熱作用用下，_____斷裂，，形成________b、退火（復性55℃-65℃）：系統統溫度降低，，引物與DNA模板板結合，形成成局部________。c、延伸（70℃-75℃）：在在Taq酶的作用下，合合成與模板互互補的________。氫鍵單鏈DNA雙鏈DNA鏈d.重復a.b.c步驟：每每重復一次，，目的基因增增加___倍倍一加熱至95攝氏度的目的的是使DNA中的斷裂，這一過過程在細胞內內是通過的作用來完成成的。當溫度降低時時，引物與模模板末端結合合，在DNA聚合酶的作用用下，引物沿沿模板延伸，，最后合成2個DNA分子，此過程程中的原料是，遵循的原原則是。Taq酶的特點是是（））A.耐強酸B.耐強堿C.耐高溫D.最適溫度37攝氏度4.請指出PCR技術與DNA復制過程的的區別解旋酶C脫氧核苷酸酸堿基互補配配對原則DNA復制PCR技術場所原理條件解旋方式酶特點結果PCR技術擴增與與DNA復復制的比較較堿基互補配配對原則堿基互補配配對原則四種脫氧核核苷酸、模模板、酶、、ATP四種脫氧核核苷酸、模模板、酶、、引物DNA在高高溫下變性性解旋解旋酶催催化解旋旋半保留復復制、邊解旋變變復制半保留復復制、全解旋再再復制體外復制制主要在細細胞核內內大量的DNA片片段形成整個個DNA分子熱穩定的的DNA聚合酶酶細胞內的的DNA聚合酶酶、解旋旋酶、DNA連連接酶等等用化學方方法直接接人工合成成條件：基因較小，核苷酸酸序列已知。蛋白質的氨基酸序列mRNA的核苷酸序列基因的核苷酸序列目的基因化學合成推測推測化學法合合成的目目的基因因含內含子、、啟動子子和終止止子嗎？反轉錄法法目的基因因的信使使RNA目的基因因化學合成成法肽鏈氨基基酸序列列信使RNA序列列基因的核核苷酸序序列目的基因因合成人工合成成法（真核生物物）推測推測單鏈DNA合成2、下列列屬于獲獲取目的的基因的的方法的的是()①利用mRNA反轉錄錄形成②②從從基因組組文庫中中提取③從受體體細胞中中提取④④利用用PCR技術⑤利用DNA轉轉錄⑥⑥人工合合成A.①②②③⑤B.①②②⑤⑥C.①①②③④④D.①②④④⑥1．在已知知基因的的核苷酸酸序列的的情況下下，獲取取目的基基因的最最方便方方法是A、化學學合成法法B、基因因組文庫庫法C、CDNA文文庫法D、、聚合酶酶鏈反應應3、在在基因工工程中，，把選出出的一個個目的基基因（共共1000個脫脫氧核苷苷酸對，，其中腺腺嘌嶺脫脫氧核苷苷酸是460個個）放入入DNA擴增儀儀中擴增增4次，，那么，，在擴增增儀中應應放入胞胞嘧啶脫脫氧核苷苷酸的個個數是（（））個個A.540B.8100C.17280D.75604、在遺遺傳工程程中，若若有一個個控制有有利性狀狀的DNA分子子片段為為ATGTG／／TACAC，，要使其其數量增增多，可可用PCR技術術進行人人工復制制，復制制時應給給予的條條件是①雙鏈DNA分分子為模模板②②ATGTG或或TACAC模模板鏈③③四種種脫氧核核苷酸④④四種種核苷酸酸⑤DNA聚聚合酶⑥⑥熱穩穩定DNA聚合合酶⑦引引物⑧⑧溫度變變化⑨⑨恒溫A．①③③④⑦⑧⑧⑨B．①②②④⑥⑦⑦⑧C．①②②⑤⑥⑦⑦D．．①③⑥⑥⑦⑧D5、下列列獲取目目的基因因的方法法中需要要模板鏈鏈的是①從從基基因因文文庫庫中中獲獲取取目目的的基基因因②②利利用用PCR技技術術擴擴增增目目的的基基因因③③反反轉轉錄錄法法④④通通過過DNA合合成成儀儀利利用用化化學學方方法法人人工工合合成成A．．①①②②③③④④B．．①①②②③③C．．②②③③④④D．．②②③③D（1））用用一一定定的的_________切切割割質質粒粒，，使使其其出出現現一一個個切切口口，，露露出出____________。。（2））用用__________切斷斷目目的的基基因因，，使使其其產產生生_________________。。（3））將將切切下下的的目目的的基基因因片片段段插插入入質質粒粒的的______處處，，再再加加入入適適量量___________，，形形成成了了一一個個重重組組DNA分分子子（（重重組組質質粒粒））限制制酶酶黏性性末末端端同一一種種限限制制酶酶的黏黏性性末末端端切口DNA連連接酶相同1.過程程:二、基因因表達載載體的構構建—核核心質粒目的基因因限制酶處處理一個切口口兩個黏性性末端兩個切口口獲得目的的基因DNA連連接酶表達載體同一種2、基因表表達載體的的組成目的基因啟動子:終止子:標記基因等等一段有特殊殊結構的DNA片段段。位于基因的的首端。一段有特殊殊結構的DNA片段段。位于基因的的尾端。啟動子的作作用：終止子作用用：使轉錄在所所需要的地地方停止。標記基因作作用：是為了鑒別別受體細胞胞中是否含含有目的基基因，，從而將有有目的基因因的細胞篩篩選出來，，如青霉素素基因。是RNA聚合合酶識別和和結合的部部位，有了它才才能驅動基基因轉錄出出mRNA，最終獲獲得蛋白質質。3、基因表表達載體的的構建目的的：a.使目的的基因在受受體細胞中中穩定存在在，并且可可以遺傳給給下一代。。b.使目的的基因能夠夠表達和發發揮作用。。思考：作為基因工工程表達載載體，只需需含有目的的基因就可可以完成任任務嗎？為為什么？不可以。因因為目的基基因在表達達載體中得得到表達并并發揮作用用，還需要要有其他控控制元件，，如啟動子子、終止子子和標記基基因等。必必須構建上上述元件的的主要理由由是：（1）生生物之間進進行基因交交流，只有有使用受體體生物自身身基因的啟啟動子才能能比較有利利于基因的的表達；（2）通過過cDNA文文庫獲得的目目的基因沒有有啟動子，只只將編碼序列列導入受體生生物中無法轉轉錄；（3）目的的基因是否導導入受體生物物中需要有篩篩選標記；（4）為了了增強目的基基因的表達水水平，往往還還要增加一些些其他調控元元件，如增強強子等；（5）有時時需要確定目目的基因表達達的產物存在在于細胞的什什么部位，往往往要加上可可以標識存在在部位的基因因（或做成目目的基因與標標識基因的融融合基因），，如綠色熒光光蛋白基因等等。①載體與表達載體的區別：二者者都有標記基基因和復制原原點兩部分DNA片段。。表達載體在在載體基礎上上增加了目的的基因、啟動動子、終止子子三部分結構構②用到的工具酶酶：既用到限制酶酶切割載體，，又用到DNA連接酶將將目的基因和和載體拼接，，兩種酶作用用的化學鍵都都是磷酸二酯酯鍵③啟動子、終止止子對于目的基因因表達必不可可少④目的基因不能能單獨進入受受體細胞，必需以表達載載體的方式攜攜帶進去。注意目的基因與運運載體結合所所需的條件有有①同一種限制制酶②具具有抗性基因因的質粒③RNA聚合合酶④④目的基基因⑤DNA連接接酶⑥⑥四種脫脫氧核苷酸⑦ATPA．①②③④④⑤⑥⑦B．①①②④⑤⑥⑦⑦C．①②③④④⑤D．①②④⑤⑤⑦（多選）一個個基因表達載載體的構建應應包括A．目的基因因B．啟動子C．終止子D．標標記基因ABCDD下列關于基因因表達載體的的敘述不正確確的是A．啟動子是是與RNA聚聚合酶識別和和結合的部位位，是起始密密碼B．啟動子和和終止子都是是特殊結構的的DNA短片片段，對mRNA的轉錄錄起調控作用用C．標記基因因是為了鑒別別受體細胞中中是否有目的的基因從而便便于篩選D．基因表達達載體的構建建視受體細胞胞及導入方式式不同而有所所差別A1、什么是轉轉化？2、目的基因因導入植物細細胞常用的方方法是什么？？具體過程是是怎樣的？3、目的基因因導入動物細細胞常用的方方法是什么？？基本操作程程序是怎樣的的？4、目的基因因導入大腸桿桿菌的方法是是怎樣的？鈣鈣離子有什么么作用？三、目的基因因導入受體細細胞轉化目的基因進入受體細胞內，，并且在受體體細胞內維持穩定和表表達的過程。三、目的基因因導入受體細細胞常用的受體細細胞：原核生物：大大腸桿菌、枯枯草桿菌、、土壤農桿桿菌真核生物：酵酵母菌和動植植物細胞將目的基因導導入受體細胞胞的原理借鑒細菌或病毒侵侵染細胞的途徑。1.目的基因因導入植物細細胞常用的方法:農桿菌轉化法法、基因槍法、、花粉管通道道法農桿菌的特點點:c.Ti質粒粒上的T-DNA可轉移移到受體細胞胞，并整合到到受體細胞染染色體的DNA上。b.具有趨化化性。a.易感染雙雙子葉植物和和祼子植物。。（1）、農桿桿菌轉化法整合到染色體上轉移至受體細胞根據據農農桿桿菌菌可可將將目目的的基基因因導導入入雙雙子子葉葉植植物物的的機機理理，，你你能能分分析析出出農農桿桿菌菌不不能能將將目目的的基基因因導導入入單單子子葉葉植植物物的的原原因因嗎嗎？？若若想想將將一一個個抗抗病病基基因因導導入入單單子子葉葉植植物物(如如小小麥麥）），，從從理理論論上上說說，，你你認認為為應應該該怎怎么么做做？？P15-2思考考與與探探究究因為為單單子子葉葉植植物物不不能能分分泌泌出出大大量量的的酚酚類類化化合合物物來來吸吸引引農農桿桿菌菌，，向向單單子子葉葉植植物物的的傷傷口口處處噴噴灑灑酚酚類類化化合合物物，，使使用用基基因因槍槍法法及及花花粉粉管管道道法法。。（2））基基因因槍槍法法基因因槍槍法法又又稱稱微微彈彈轟轟擊擊法法，，是是利利用用壓壓縮縮氣氣體體產產生生的的動動力力，，將將包包裹裹在在金金屬屬顆顆粒粒表表面面的的表表達達載載體體DNA打打入入受受體體細細胞胞中中，，使使目目的的基基因因與與其其整整合合并并表表達達的的方方法法。。1、、常常用用于于單單子子葉葉植植物物的的轉轉化化方方法法2、、特特點點：：成成本本高高（3））花花粉粉通通道道法法植物物花花粉粉在在柱柱頭頭上上萌萌發發后后，，花花粉粉管管要要穿穿過過花花柱柱直直通通胚胚囊囊。。花花粉粉管管通通道道法法就就是是在在植植物物受受粉粉后后，，花花粉粉形形成成的的花花粉粉管管還還未未愈愈合合前前，，剪剪去去柱柱頭頭，，然然后后，，滴滴加加DNA（（含含目目的的基基因因）），，使使目目的的基基因因借借助助花花粉粉管管通通道道進進入入受受體體細細胞胞。。我國國轉轉基基因因抗抗蟲蟲棉棉就就是是用用這這種種方方法法獲獲得得２.目目的的基基因因導導入入動動物物細細胞胞常用用的的方方法法:顯微微注注射射技技術術操作作程程序序：：a.先先提提純純含含目目的的基基因因的的表表達達載載體體b.從從雌雌性性動動物物體體內內取取出出卵卵（（受受精精卵卵））c.顯顯微微注注射射儀儀進進行行顯顯微微注注射射d.將將含含目目的的基基因因的的受受精精卵卵移移植植到到輸輸卵卵管管或或子子宮宮中中發發育育成成新新個個體體常用法：：Ca2+處理常用菌：：大腸桿菌菌3.目的的基因導導入微生生物細胞胞原核生物物的特點點:繁殖快，，多為單單細胞，，遺傳物物質相對對較少。。大腸桿菌菌的轉化化過程:用Ca2+處理細胞胞→感受態細細胞→重重組表達達載體DNA分分子與感感受態細細胞混合合→感受態態細胞吸吸收DNA分子子。增加細胞胞壁的透透性，與與細胞膜膜無關將目的基基因導入入受體細細胞1.將目的基基因導入入植物細細胞轉化農桿菌轉轉化法基因槍法法花粉管通通道法2.將目的基基因導入入動物細細胞顯微注注射技技術3.將目的的基因因導入入微生生物細細胞Ca2+處理植物基因工程動物基因工程微生物基因工程常用方法受體細胞比較目目的基基因導導入不不同細細胞的的方法法農桿菌菌轉化化法顯微注注射法法Ca2+處理法法體細胞胞受精卵卵原核細細胞1、基基因工工程中中科學學家常常用細細菌、、酵母母菌等等微生生物作作為受受體細細胞，，原因因是A．結結構簡簡單、、操作作方便便B．．繁殖殖速度度快C．遺遺傳物物質含含量少少、簡簡單D．性性狀穩穩定、、變異異少2、基基因工工程常常用的的受體體細胞胞有①大腸腸桿菌菌②②枯枯草桿桿菌③③支原原體④④動植植物細細胞A．①①②③③④B．．①②②③C．②②③④④D．．①②②④BD1、導導入目目的基基因后后需要要檢測測哪些些方面面？各各采取取什么么方法法？2、什什么是是DNA分分子探探針？？檢測測時的的DNA探探針通通過什什么原原理來來檢測測目的的基因因和相相應的的mRNA？3、利用抗抗體－抗原原雜交檢測測的原理是是什么？四、目的基基因檢測與與鑒定檢測內容檢測方法1.目的基因是否插入受體細胞染色體的DNA上2.目的基因是否轉錄出mRNA3.目的基因是否翻譯出蛋白質4、個體生物學水平的鑒定分子雜交技技術抗原—抗體體雜交DNA分子子雜交技術術抗蟲鑒定、、抗病鑒定定、活性鑒鑒定等DNA探針針：用放射性同同位素等作作標記的含含有目的基基因的DNA片段。。（一）、檢檢測1、檢測轉轉基因生物物染色體的的DNA上上是否插入入了目的基基因(關鍵步驟驟)①.首先取取出轉基因因生物的基基因組DNA②.用含目目的基因的的DNA片片段用放射射性同位素素等作標記記,以此做做探針③.使探針針和轉基因因生物的基基因組雜交交,若顯示示出雜交帶帶,表明染染色體已插插入染色體體DNA中中（1）方法:DNA分子子雜交（2）過程程:DNA分子子雜交示意意圖采用用一一定定的的技技術術手手段段，，將將兩兩種種生生物物的的DNA分分子子的的單單鏈鏈放放在在一一起起，，如如果果這這兩兩個個單單鏈鏈具具有有互互補補的的堿堿基基序序列列，，那那么么，，互互補補的的堿堿基基序序列列就就會會結結合合在在一一起起，，形形成成雜雜合合雙雙鏈鏈區區；；在在沒沒有有互互補補堿堿基基序序列列的的部部位位，，仍仍然然是是兩兩條條游游離離的的單單鏈鏈。。P15思考考與與探探究究（二二））、、鑒鑒定定（（個個體體生生物物學學水水平平））2、、檢檢測測目目的的基基因因是是否否轉轉錄錄出出了了mRNA3、、檢檢測測目目的的基基因因是是否否翻翻譯譯成