EGCG對多肽淀粉樣蛋白的形成重定向后轉(zhuǎn)變成為無定形結(jié)構(gòu)，從而阻斷了寡聚體的形成富含6折疊的淀粉樣纖維或者聚集體的累積過程是非常復(fù)雜的，與細(xì)胞毒性相關(guān)的多級過程和許多人類蛋白錯(cuò)誤折疊病相關(guān)，包括：帕金森病、阿爾茲海默癥。這個(gè)過程涉及到各種各樣的中間體，例如：短暫的、永久的、on-andoff-pathway中間體的形成，這些中間體的結(jié)構(gòu)、大小、細(xì)胞毒性和規(guī)模都尚不清楚。在本文章中我們證明，通過一些小分子的反應(yīng)可以對淀粉樣纖維的形成進(jìn)行重定向，從而使得off-pathway，具有很高穩(wěn)定性的聚集體的生成。多酚化合物EGCG可以直接和自然為折疊的多肽結(jié)合，阻止了多肽進(jìn)一步轉(zhuǎn)化成為有毒性的、和on-pathway的中間聚集體，從而有效的抑制了@-突觸核蛋白和6-淀粉樣蛋白的原纖維的生成。這中無定形結(jié)構(gòu)的生長代替了富含6折疊的淀粉樣纖維，一種新型的沒有毒性的@-突觸核蛋白和6淀粉樣蛋白的聚集體被提出，表明在神經(jīng)退行性疾病中相似的聚合途徑是通用的。許多蛋白質(zhì)有不同的序列、結(jié)構(gòu)和自我組裝成形態(tài)上類似與富含6折疊的纖維聚集體，組裝形成的纖維聚集體統(tǒng)稱為淀粉樣纖維。淀粉樣纖維的形成與蛋白質(zhì)的錯(cuò)誤折疊有關(guān)，包含神經(jīng)退行性疾病。例如：阿爾茲海默癥、帕金森、亨廷頓。從功能上來看，這個(gè)過程包含了無數(shù)個(gè)生理學(xué)過程，例如：基因調(diào)控過程、長期記憶或黑色素體生物合成。盡管淀粉樣纖維的組裝對健康和疾病有非常重要的影響，對這個(gè)復(fù)雜的過程進(jìn)行一個(gè)全面的理解仍然存在許多困難。盡管會(huì)聯(lián)想到其他蛋白的聚合過程和聚合方法，例如：肌紅蛋白和微管蛋白，在大多數(shù)情況下淀粉樣纖維的形成不能簡單的用成核聚集模型進(jìn)行描述，如有些淀粉樣蛋白可以完全不用經(jīng)過成核階段聚集形成聚集體。事實(shí)上，通過觀察不同種類的蛋白中間體的聚集狀態(tài)，發(fā)現(xiàn)淀粉樣蛋白的自組裝更加的復(fù)雜。球形低聚物和蠕蟲狀的結(jié)構(gòu)經(jīng)常被認(rèn)做是原纖維，已經(jīng)被認(rèn)為是組裝過程中最關(guān)鍵的中間體。然而，這些有毒低聚物的結(jié)構(gòu)、大小、形態(tài)至今還沒有被充分的說明。然而，在這期間，off-pathway的低聚物和原纖維已經(jīng)被報(bào)道。最近提出的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，競爭自組裝途徑?jīng)Q定了6微球蛋白纖維的形態(tài)，表明淀粉樣纖維的形成不是一個(gè)線性過程而是一個(gè)多途徑過程，這個(gè)過程中涉及到數(shù)量不等、穩(wěn)定性不同、和許多亞穩(wěn)態(tài)的聚集產(chǎn)物。其最決定性作用的是原纖維中間體，它在纖維組裝過程中起著非常重要的作用，這些中間體已經(jīng)廣泛的被認(rèn)為與蛋白錯(cuò)誤折疊后的毒性相關(guān)聯(lián)。許多研究表明，在蛋白質(zhì)聚集的過程中，淀粉樣纖維通過構(gòu)象轉(zhuǎn)變伴隨或者著淀粉樣纖維的自組裝。例如，自然未折疊的多肽淀粉樣6蛋白和@-突觸核蛋白，開始在溶液中是處于一種隨機(jī)卷曲的自然結(jié)構(gòu)。然而，在纖維化過程中，他們的結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變成為6折疊構(gòu)型，表明6折疊結(jié)構(gòu)的形成驅(qū)使了淀粉樣纖維的自組裝過程。這個(gè)結(jié)論通過分子動(dòng)力學(xué)自組裝模型證明，6折疊的構(gòu)象增加了淀粉樣原纖維的穩(wěn)定性。X衍射-纖維衍射研究揭示了合成的@-突觸核蛋白和A6淀粉樣蛋白的纖維絲是交錯(cuò)的6折疊構(gòu)象的特點(diǎn)，表明淀粉樣纖維通有的結(jié)構(gòu)組成是氫鍵連接的6折疊結(jié)構(gòu)，而6折疊結(jié)構(gòu)的趨勢是垂直于長纖維軸。研究發(fā)現(xiàn)表明，淀粉樣纖維的穩(wěn)定性的主要作用是涉及多肽鏈主鏈之間的氫鍵作用，這就可以解釋形成纖維的有不同序列的多肽鏈有相似的形態(tài)和結(jié)構(gòu)。實(shí)驗(yàn)證明，淀粉樣纖維的形成過程可以用分子伴侶和小分子進(jìn)行修改。分子伴侶Hsp104,對于酵母阮病毒的傳播是非常關(guān)鍵的，例如，分子伴侶Hsp可以在體外明顯的增強(qiáng)Sup35和Ure2自發(fā)的組裝。通過催化成核聚集為媒介形成種子，是淀粉樣纖維形成的關(guān)鍵步驟。亨廷頓淀粉樣蛋白的聚集體是亨廷頓疾病中最關(guān)鍵的疾病蛋白。與Hsp104相比，分子伴侶Hsp70和分子伴侶Hsp40阻止了與SDS穩(wěn)定的自組裝，在多聚反應(yīng)的滯后期這種反應(yīng)會(huì)增加。用Hsp70和Hsp40處理的聚集反應(yīng)中，可溶的無定形蛋白聚集體代替了淀粉樣纖維產(chǎn)生了非常有效的聚集，表明分子伴侶可以對淀粉樣蛋白或多肽的聚集過程重定向，轉(zhuǎn)變成為非淀粉樣蛋白自組裝。最近，在體實(shí)驗(yàn)顯示了分子伴侶TRIC對淀粉樣蛋白的形成是一種潛在的調(diào)節(jié)器。TRIC和Hsp70和分子伴侶Hsp40一起可以阻止亨廷頓原纖維的形成，但是卻刺激了一些可溶性的多聚谷氨酰胺包含有新型的亨廷頓低聚物的自組裝。這些結(jié)構(gòu)沒有毒性，但是可能會(huì)導(dǎo)致聚集通路的形成。一些小分子可以有效的影響淀粉樣纖維組裝的方式已經(jīng)被廣泛的證明。一些有機(jī)滲透劑，例如：三甲胺N-氧化物或甘油可以在體外大幅度的加速P原纖維的形成，這些化合物被認(rèn)為可以改變淀粉樣蛋白多肽之間的水合作用，創(chuàng)造一種熱力學(xué)不穩(wěn)定狀態(tài)從而增強(qiáng)了6折疊的形成。相反，一些化合物例如多巴胺和卡米達(dá)佐氯化物可以有效的阻止淀粉樣原纖維的生成。可能是通過穩(wěn)定原纖維聚集體，即生成成熟纖維最關(guān)鍵的前體。這些化合物可能會(huì)干擾淀纖維形成級聯(lián)系統(tǒng)的最后階段，也可能會(huì)增強(qiáng)纖維聚集通路、毒性聚集體中間體的積累。最近也有報(bào)道稱，一些物質(zhì)可以選擇性的抑制6淀粉樣低聚物的生成而不是原纖維，表明這個(gè)假說是不獨(dú)立的，競爭聚集通路與某些特殊的目標(biāo)化合物相關(guān)。在這項(xiàng)研究中，我們研究了淀粉樣纖維的形成通路是否可以在小分子的輔助下進(jìn)行重定向。最近的研究證明EGCG強(qiáng)有力的抑制亨廷頓蛋白和@突觸核蛋白的聚集，從而影響寡聚體的自組裝。怎么理解這些寡聚體的結(jié)構(gòu)和形成，然而，他們的on-pathway或off-pathway的聚集產(chǎn)物仍然是未知的。在本篇論文中，通過生物化學(xué)、生物物理學(xué)和細(xì)胞生物學(xué)的方法證明了EGCG可以調(diào)整@突觸核蛋白和A6淀粉樣蛋白的纖維形成過程。這個(gè)化合物可以直接和為折疊的天然多肽結(jié)合，阻止蛋白向淀粉樣纖維的低聚物和原纖維通路的轉(zhuǎn)變。反而是組裝成了包含EGCG更高穩(wěn)定性的球形低聚物。在淀粉樣纖維聚集的早期，這些物質(zhì)之間相互作用，對未折疊的蛋白質(zhì)分子進(jìn)行重定向，在他們形成淀粉樣纖維的前期提供了一條可能的聚集途徑。結(jié)論：EGCG可以促進(jìn)AS低聚物的組裝

的條件下進(jìn)行孵育（如圖,首先，我們運(yùn)用了THT結(jié)合技術(shù)分析了EGCG對AS聚集過程的影響，純化并經(jīng)過標(biāo)記的AS蛋白在添加了EGCG和沒有添加色研影長度為0.5-2um（如圖1C所示），EGCG我們檢測了在485nm處發(fā)所示）射的THT熒光的強(qiáng)度來檢測原纖維的生成。（如圖b所示）。在沒有EGCG的條件下，我們觀察到了THT熒光增加，說明在滯后期10h后富含。折疊的AS聚集體增多，這個(gè)過程符合核依賴聚合機(jī)制和以前的研究結(jié)論一致。相反，在存在EGCG分子的時(shí)候，AS蛋白的聚集被抑制（圖1b）的條件下進(jìn)行孵育（如圖,首先，我們運(yùn)用了THT結(jié)合技術(shù)分析了EGCG對AS聚集過程的影響，純化并經(jīng)過標(biāo)記的AS蛋白在添加了EGCG和沒有添加色研影長度為0.5-2um（如圖1C所示），我們檢測了在485nm處發(fā)接下來，我們通過EM染究了EGCG對as原纖維形成的響，我們觀察到初級as纖維的直徑為5-15nm支持了THT和以前的研究結(jié)果。相反，EGCG的摩爾比為1：1和10：1的時(shí)候明顯的降低了纖維的組裝，有效的支持了無定形蛋白聚集體和平均直徑大小為20nm的球形低聚物的（圖1C和支持材料1）。因此，EGCG有效的抑制as淀粉樣蛋白的生成，但是卻會(huì)刺激緊湊的球形低聚物的生成。（圖1C）

在其他實(shí)驗(yàn)中，EGCG對as聚集體的影響可以通過大小排阻色譜進(jìn)行分析，未處理的as蛋白洗脫后的分子質(zhì)量為51KDa（圖不存在預(yù)期的分子量為14KDa的球形蛋白，但似乎是自然未折疊的更大更穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)。增加as單體后EGCG—HOb'enl49—37.Id），支持了先前的結(jié)論即eEGCG處理過的樣品中，洗脫出的分子量為500-1500KDa的可溶性低聚物。通過SDS和免疫印跡法證明這些低聚物是SDS-抗性結(jié)構(gòu)，這種結(jié)構(gòu)可以在濃縮膠電泳上進(jìn)行染色（如圖1d。3-7部分），表明通過EM染色觀察到的球形顆粒具有高度的穩(wěn)定性，在變性條件下不會(huì)進(jìn)行組裝。我們也檢測到了一些小的as蛋白復(fù)合物，在34、68、102（圖1d，8-13部分），表明用EGCG處理的樣品單體中，asEGCG—HOb'enl49—37.Id），支持了先前的結(jié)論即eEGCG直接結(jié)合在自然未折疊的as上為了檢測EGCG是否是直接結(jié)合在未折疊的as為了確認(rèn)低聚物形成的順序，我們采用了時(shí)間過程實(shí)驗(yàn)和通過SDS和銀染實(shí)驗(yàn)來檢測多聚體的形成。（圖1e和支持材料2）。除了在17kDa處有as單體的出現(xiàn)外，用EGCG處理的樣品孵育一小段時(shí)間后（2-8h）后，我們觀察到了階梯型的一系列分散的SDS結(jié)合的二聚體、三聚體和四聚體，分子量分別是在34、68、102.隨著時(shí)間的推移，這些結(jié)構(gòu)會(huì)自組裝形成更大的蛋白質(zhì)聚集體（＞250Kda），這個(gè)聚集體是一種亞穩(wěn)態(tài)聚集體的且分子量非常大，沒有辦法進(jìn)入凝膠色譜中進(jìn)行分離。（圖1e）這個(gè)說法也確認(rèn)了球形的EGCG聚集體引發(fā)的as自組裝會(huì)形成淀粉樣纖維形成的通路中形成一種亞穩(wěn)態(tài)的中間體。沒有EGCG加入的時(shí)間實(shí)驗(yàn)中，通過SDS和銀染的SDS-穩(wěn)定的asEGCG直接結(jié)合在自然未折疊的as上為了檢測EGCG是否是直接結(jié)合在未折疊的as上，我們采用了NBT染色檢測的方法，這個(gè)反應(yīng)可以檢測蛋白與EGCG分子結(jié)合的顏色反應(yīng)。如圖2a所示，當(dāng)有EGCG存在的時(shí)候，有一個(gè)紫色的as蛋白帶在分子量為17KDa。而當(dāng)EGCG不存在的時(shí)候，這個(gè)顏色反應(yīng)不會(huì)發(fā)生。這表明了EGCG直接結(jié)合在未折疊的as多肽上，相互作用點(diǎn)是SDS的切口。用NBT染色發(fā)現(xiàn)，當(dāng)一些蛋白折疊的過程中沒有觀察到EGCG的結(jié)合，例如：卵清蛋白、碳酸酐酶、糜蛋白酶原或溶菌酶，表明未折疊的多肽鏈對于EGCG的結(jié)合是必須的。為了調(diào)查這種可能性，用NBT染色檢測變性和非變性處理后的BSA，EGCG容易于尿素變性處理后的BSA結(jié)合，而不是未被處理的蛋白（圖2b）.為了研究EGCG是否直接與as單體的SDS-穩(wěn)定態(tài)進(jìn)行結(jié)合，時(shí)間分辨聚集反應(yīng)運(yùn)用NBT檢測。as單體和SDS-切口的低聚物的紫色聚集物可以明顯的可見。（圖2C，支持材料2）表明在低聚反應(yīng)階段，化合物可以和所有的結(jié)構(gòu)直接的結(jié)合。這些數(shù)據(jù)表明，在低聚物形成的過程中，as未折疊的自然構(gòu)象會(huì)被保留。EGCG直接結(jié)合在as多肽的主鏈上CcEGCG1?024812'Time(h)IMW{kDa)116—82-64一4937一26CcEGCG1?024812'Time(h)IMW{kDa)116—82-64一4937一26-19-當(dāng)as和BSA相比較時(shí)，我們的數(shù)據(jù)表明所有的蛋白都可以被EGCG所識(shí)別，盡管每種蛋白都有不同的氨基端序列。（如圖2所示）這表明，這些化合物不會(huì)識(shí)別特定的序列，對所有蛋白來說都可以直接與多肽主鏈的結(jié)合是相同的。為了解決這個(gè)問題，我們采用了核磁共振技術(shù)（NMR）。首先，我們記錄了存在和沒有存在EGCG的條件下的as的一維光譜。與先前的數(shù)據(jù)一致，NMR分析證明了未處的）理的as是自然松散的蛋白。（如圖3a）as這個(gè)現(xiàn)象對EGCG的共振的影響最為明顯，在5.5、6.1、6.5ppm處。所觀察到的逐步增寬現(xiàn)象是直接加入EGCG的結(jié)果。而兩種化合物的光譜沒有隨著不同的時(shí)間變化，這個(gè)現(xiàn)象表明了EGCG和as是直接相互作用。（圖2所示）在第二個(gè)實(shí)驗(yàn)中，我們記錄了as和不同比例的EGCG二維的H1和15N光譜，（如圖3b），通過僅僅控制包含的as的疊加光譜，揭示了共振逐漸變寬，這個(gè)現(xiàn)象在EGCG超過5倍和10倍的時(shí)候最明顯。在等摩爾濃度下，as的C端共振濃度消失，表明化合物易于與蛋白質(zhì)高自由度的區(qū)域進(jìn)行結(jié)合。在EGCG：as的比例為5：1時(shí)，有一半的光譜消失，正如預(yù)期的一樣，有聚集體的形成，這些聚集體的光譜太寬以至于無法看到。位于as中間部分序列的共振信號(hào)依然保持可見，尤其是EGCG產(chǎn)生的所有小的選擇諧振都向上場移動(dòng)，表明一旦與化合物的環(huán)發(fā)生作用，由于受到特殊的幾何學(xué)轉(zhuǎn)變的影響，受到當(dāng)前轉(zhuǎn)變的影響。等摩爾率條件下的多種化學(xué)轉(zhuǎn)變在已經(jīng)觀察到，但是隨著EGCG的過量而增加受影響的共振沿著在AS序列擴(kuò)展而不與氨基酸類型的任何明顯的相關(guān)性，這表明，在過量，EGCG不形成在AS分子的特定區(qū)域局部相互作用而是隨機(jī)地結(jié)合到蛋白質(zhì)的主鏈基團(tuán)。所有的蛋白都向上場移動(dòng)，沒有表現(xiàn)出特殊的情況，說明沒有跟特定的氨基酸序列有關(guān)。EGCG阻止了^折疊的形成先前的實(shí)驗(yàn)和理論研究表明，6折疊結(jié)構(gòu)的形成在淀粉樣纖維階段是非常關(guān)鍵的（圖1a）。我們研究表明EGCG通過阻止蛋白的隨機(jī)結(jié)構(gòu)向淀粉樣?折疊的構(gòu)象轉(zhuǎn)變，阻礙了as原纖維的形成。為了檢測這種假設(shè)，我們將用EGCG和未被EGCG處理的樣品使用圓二色譜實(shí)驗(yàn)檢測，和先前的實(shí)驗(yàn)結(jié)果相似，我們發(fā)現(xiàn)未被處理的as和處理后的蛋白在200nm-210nm之間有一個(gè)明顯的負(fù)峰（圖4a）。然而，as蛋白聚集體在220nm處的負(fù)峰逐漸的消失。因此，在as的圓二色譜中，as經(jīng)歷了聚集構(gòu)象的從隨機(jī)結(jié)構(gòu)到富含6折疊的轉(zhuǎn)變。然而，用EGCG處理的樣品中，會(huì)以劑量依賴的方式阻止構(gòu)象的轉(zhuǎn)變。EGCG會(huì)促進(jìn)無毒、off-pathway低聚物的形成先前的研究已經(jīng)說明，預(yù)形成的淀粉樣蛋白原纖維中的6折疊結(jié)構(gòu)具有傳播纖維種子的能力，也可以轉(zhuǎn)變成為非聚集的、同源的多肽在水溶液中形成穩(wěn)定的聚集體。為了檢測EGCG-as纖維聚集體是否是纖維形成中的必須的，還是阻止纖維形成的聚集體產(chǎn)物。我們采用了在原有的as纖維和EGCG-穩(wěn)定的低聚物中加入纖維種子的實(shí)驗(yàn)。兩種等量結(jié)構(gòu)中加入過量的as蛋白的多聚物和形成淀粉樣纖維使用THT實(shí)驗(yàn)檢測。as低聚物形成的淀粉樣纖維經(jīng)過超聲后可以形成有效的纖維種子而EGCG穩(wěn)定后的低聚物沒有這樣的效應(yīng)。這表明EGCG作用產(chǎn)生的低聚物并非是未聚集蛋白轉(zhuǎn)變成為淀粉樣纖維的功能模體，因此，很可能是一種0ff-pathway的聚集體。最近的研究表明，原纖維as寡聚體可以被特異性結(jié)構(gòu)的抗體A11檢測。因此，我們檢測在用EGCG處理過這個(gè)反應(yīng)后，是否還會(huì)有這個(gè)結(jié)構(gòu)的產(chǎn)生。運(yùn)用時(shí)間分辨的斑點(diǎn)印跡實(shí)驗(yàn)，我們發(fā)現(xiàn)加入EGCG的與A11反應(yīng)的纖維寡聚體的形成能夠有效的被抑制，但是在沒有加入EGCG的樣品中卻沒有相同的現(xiàn)象。（圖5b）。在孵育4-6小時(shí)后的階段中，淀粉樣低聚物的含量會(huì)劇增，經(jīng)過24小時(shí)之后，這中低聚物無法再被檢測到，而此時(shí)纖維的組裝也達(dá)到了它的高峰期。這個(gè)現(xiàn)象支持了以前的研究結(jié)果，他們是瞬間的聚集中間體，這些中間體隨著時(shí)間會(huì)進(jìn)化，并且會(huì)伴隨著成熟纖維的形成而減少。運(yùn)用可多克隆控制抗體as-D可以識(shí)別as的獨(dú)立構(gòu)象，對EGCG處理和EGCG未處理的as蛋白進(jìn)行檢測。

為了調(diào)查，EGCG處理得到的低聚物是否會(huì)對哺乳動(dòng)物的細(xì)胞的有毒性作用，我們進(jìn)行了標(biāo)準(zhǔn)化的3-（4,5-二甲基-2-基）-2,5-二苯基漠（MTT）與PC12細(xì)胞37的還原測定。我們在體外制出有很低THT熒光強(qiáng)度的球形as-EGCG低聚物和有很高的THT熒光強(qiáng)度的富含6折疊的淀粉樣纖維。在這些結(jié)構(gòu)中添加了不同濃度的PC12細(xì)胞。和先前的實(shí)驗(yàn)結(jié)論相同，了不同濃度的PC12細(xì)胞。和先前的實(shí)驗(yàn)結(jié)論相同，as原纖維、纖維和THT反應(yīng)的混合物會(huì)引起MTT明顯的減小，顯示出了細(xì)胞毒性。（圖5C），已經(jīng)有強(qiáng)烈的對比，我們觀察到在PC12細(xì)胞中添加了一定數(shù)量的熒光強(qiáng)度比較低EGCG-產(chǎn)生的低聚物或者as蛋白單體（支持材料6），表明基于細(xì)胞檢測實(shí)驗(yàn)中EGCG穩(wěn)定產(chǎn)生的結(jié)構(gòu)與不容的富含6折疊淀粉樣纖維有更小的毒性。EGCG阻止。淀粉樣原纖維的形成我們的研究表明：EGCG可以識(shí)別未折疊的多肽，對于所有蛋白來說都是直接結(jié)合在主鏈上。這表明EGCG可能會(huì)抑制其他有聚集傾向的自然沒有折疊的多肽形成原纖維，例如：A6、單獨(dú)的淀粉樣多肽或者是牛磺酸。這里我們檢測了EGCG對淀粉樣01-42（選擇這個(gè)蛋白質(zhì)有一定的原因）原纖維形成的影響，P1-42被認(rèn)為是AD的發(fā)病機(jī)理。我們在未聚合的A6多肽中加入不同濃度的EGCG，用THT熒光檢測淀粉樣纖維的形成。在沒有EGCG的時(shí)候，在1h的滯后期A042形成了THT聚集體的熒光，而在有EGCG的時(shí)候，我們即使是在A0超過EGCG10倍的時(shí)候，觀察到一個(gè)延長的滯后期且熒光強(qiáng)度消失。（圖6a）接下來，我們通過電子顯微鏡研究了A642聚集體的形態(tài)。經(jīng)過EGCG與A642（1：1、10：1）摩爾比處理72h，我們主要觀察到了大部分的球狀粒子和無定形結(jié)構(gòu)。（圖6b），相反的是，沒有處理過的聚集反應(yīng)觀察到了典型的A642原纖維和纖維。支持了先前的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。、用SDS和銀染的方法對聚集反應(yīng)進(jìn)行隨著時(shí)間的變化進(jìn)行研究，表明EGCG結(jié)合的A642低聚物是保持在凝膠中的高分子量的SDS-穩(wěn)定結(jié)構(gòu)。（圖6c）。總之，在低聚反應(yīng)過程中，一些小分子低聚物可以進(jìn)入凝膠檢測。在沒有EGCG存在的情況下，在相同的條件下，24小時(shí)內(nèi)沒有檢測到SDS-穩(wěn)定的A642結(jié)構(gòu)。NBT染色實(shí)驗(yàn)證明EGCG是直接與未折疊的A042單體結(jié)合且有SDS-穩(wěn)定的低聚物，與

未折疊的as蛋白有相同的現(xiàn)象。我們又運(yùn)用了纖維種子實(shí)驗(yàn)檢測EGCG與AP結(jié)合形成的低聚物是on或者是off-pathway的聚集產(chǎn)物。超聲過的A。纖維可以促進(jìn)了原纖維的生成，0Noseeds■Fibrillarseeds鼻EGCGstabilized而EGCG-結(jié)合的聚合物不會(huì)。（圖7a），我們運(yùn)用THT檢測包含超聲反應(yīng)的淀粉纖維與未折疊的AP42單體與不同濃度的EGCG0Noseeds■Fibrillarseeds鼻EGCGstabilized*EGCGstabilizedEGCG超過AP42淀粉樣纖o111圳9響8「時(shí)網(wǎng)維5倍時(shí)，能夠完全抑制AP42淀粉樣纖維的生成，而在反應(yīng)物濃度等摩爾比的條件下，聚合作用被部分抑制，表明EGCG阻止纖維種子AP42纖維的形成具有濃度依賴的效應(yīng)。我們也通過特異性結(jié)合抗體A11斑點(diǎn)雜交實(shí)驗(yàn)，檢測了是否有EGCG-結(jié)合的AP低聚物。在用EGCG處理過的樣品中，沒有A11免疫性單體的出現(xiàn)。但是在未被處理的聚集反應(yīng)中經(jīng)過6-24h后就能很容易的被檢測到。這表明EGCG穩(wěn)定的AP42單體在結(jié)構(gòu)上與之前描述的淀粉樣單體的結(jié)構(gòu)不同。最后，我們通過MTT檢測了EGCG-Ap結(jié)合單體的毒性。預(yù)成型的纖維、具有THT反應(yīng)活性的AP42原纖維會(huì)控制MTT的減少，但是當(dāng)細(xì)胞與EGCG-處理后寡聚體和AP42單體一起孵育后，卻沒有觀察到這個(gè)現(xiàn)象。（圖7d所示）。基于這些結(jié)果，我們研究證明EGCG是屬于通用型的淀粉樣纖維形成過程中的調(diào)節(jié)器，它可以結(jié)合到未折疊的具有以及氨基酸序列的多肽鏈上，而且可以將他們轉(zhuǎn)化成為一種新型的無毒性的、無定形的、off-pathway低聚物。討論：as聚集過程的重定向以前的研究認(rèn)為蛋白質(zhì)的疏水核心是主要驅(qū)使as發(fā)生纖維化。相對穩(wěn)定的as結(jié)構(gòu)類似環(huán)狀結(jié)構(gòu)，這樣可以將聚集區(qū)域NAC與環(huán)境屏蔽開阻止了原纖維的生成。我們的研究證明EGCG可以穩(wěn)定未折疊并自然展開的as蛋白，增強(qiáng)了蛋白中分子之間的自抑制作用。因此形成了高穩(wěn)定性的球形低聚物。表明：化合物對易發(fā)型聚集分子的聚集方式進(jìn)行重定向。與淀粉樣串聯(lián)反應(yīng)不同。自發(fā)性的as聚集過程與EGCG介導(dǎo)的低聚反應(yīng)相比，反應(yīng)過程較慢，推測是兩條聚集路徑對未折疊的、單體as分子的競爭。富含P折疊的分子降低的可以解釋為EGCG-蛋白復(fù)合物的快速組裝的形成低聚物造成的。EGCG對自然為折疊的as分子形成SDS-穩(wěn)定性低聚物的機(jī)理不穩(wěn)定。用EGCG處理的as蛋白的C端共振信號(hào)消失。這表明，化學(xué)物易于與蛋白中長期存在的中間分子結(jié)合。EGCG是一種芳香族化合物有大量的羥基，表明EGCG也許會(huì)引起在as單體之間的分子之間的反應(yīng)，通過涉及到的羥基形成的氫鍵連接。在這種方式中，這個(gè)化合物的作為一個(gè)分子拉鏈和種子的作用驅(qū)使EGCG包含的的球形as低聚物的自我組裝。然而，也可能與其他作用力因素有關(guān)，例如：氫鍵堆積和疏水作用。我們的NMR表明，EGCG的介導(dǎo)as低聚反應(yīng)中，NAC的共振信號(hào)在很長的一段時(shí)間內(nèi)都能看見，這表明在as的疏水中心驅(qū)使原纖維的形成并對成熟的纖維有一定的保護(hù)能力，但是不會(huì)刺激EGCG為中介物的低聚物的生成。包含EGCG的低聚物的NAC易于聚集端也許會(huì)形成一個(gè)擁有蛋白C端的疏水簇，這個(gè)疏水簇使得蛋白與蛋白分子之間不能很好的接觸。除了自發(fā)的纖維化，EGCG以濃度依賴的方式阻止了AP和as的種子聚集，這和我們的研究結(jié)果是非常接近的，這表明EGCG穩(wěn)定的單體和低聚物沒有和纖維種子一樣的結(jié)構(gòu)并且不會(huì)形成淀粉樣6折疊結(jié)構(gòu)。這種結(jié)論對EGCG作為潛在的藥物研究有非常重要的作用，因?yàn)檫@個(gè)實(shí)驗(yàn)表明化合物可以抑制淀粉樣纖維化，即使在人體中已