血清γ-球蛋白的分離純化

與鑒定指導(dǎo)教師：夏洪李曉梅本次實驗內(nèi)容（一）血清γ-球蛋白的分離與純化（二）血清γ-蛋白的鑒定——醋酸纖維素薄膜電泳

（一）血清γ-球蛋白的分離與純化實驗17【儀器試劑】試管、刻度吸管、吸耳球、膠頭滴管、層析柱、反應(yīng)板；血清、PBS液、葡聚糖凝膠G-25、納氏試劑、雙縮尿試劑、飽和硫酸銨溶液。

【實驗原理

】1.鹽析

：是使蛋白質(zhì)從溶液中沉淀的一種方法。（1）蛋白質(zhì)作為膠體在水中的穩(wěn)定存在的因素①電荷(同種電荷相斥）②水化膜（隔離）Pr++++++Pr++++++中性鹽破壞了這兩個穩(wěn)定性因素，使蛋白質(zhì)沉淀。中性鹽加入蛋白質(zhì)溶液，中性鹽對水分子的親和力大于蛋白質(zhì)，于是蛋白質(zhì)分子周圍的水化膜層減弱乃至消失。同時，中性鹽加入蛋白質(zhì)溶液后，由于離子強度發(fā)生改變，蛋白質(zhì)表面電荷大量被中和，更加導(dǎo)致蛋白溶解度降低，使蛋白質(zhì)分子之間聚集而沉淀。沉淀蛋白質(zhì)的方法還有哪些？（2）鹽析的影響因素蛋白質(zhì)的濃度、鹽濃度、pH值、溫度等。本實驗球蛋白在半飽和硫酸銨溶液中沉淀而清蛋白溶解，γ-球蛋白在33%濃度的硫酸銨溶液中沉淀。

3.檢測分離效果（1）納氏試劑：鹽存在時，NH4+與其反應(yīng)呈現(xiàn)黃色或橙色。（2）雙縮尿試劑檢測：蛋白質(zhì)與其呈現(xiàn)紅色或紫紅色。⑵將離心管中的沉淀用1mlPBS攪拌溶解，再逐滴加入飽和硫酸銨溶液0.5ml，邊加邊搖勻。靜置10分鐘后，離心3000rpm10分鐘（注意離心機使用時需要配平并且離心時將蓋子蓋好）。傾上清液（上清中主要含清蛋白α、β球蛋白），沉淀即為初步純化的γ-球蛋白。（2）加樣：向裝有γ-球蛋白的離心管內(nèi)加入PBS10滴，用玻璃棒攪拌使之溶解。再用乳頭吸管吸出γ-球蛋白液，加到層析柱內(nèi)凝膠表面。待γ-球蛋白液全部進(jìn)入凝膠柱內(nèi)時，再用乳頭吸管小心加入PBS約1cm高，待大部分液體進(jìn)入凝膠柱后，再繼續(xù)加PBS直至洗脫完畢（加液時注意不要沖擊凝膠表面）。在整個洗脫過程中不能讓液面降至凝膠面以下。（3）收集：加樣同時可進(jìn)行收集，每管收集1ml。收集12管后加緊螺旋夾。回收凝膠和尼龍布等。⑷檢測：準(zhǔn)備反應(yīng)板兩塊。將12管收集液各取1滴分別放入反應(yīng)板的12個凹孔。一塊板的各孔內(nèi)加納氏試劑1滴，有NH4+者呈黃色至橙色。可用＋、－號表示有無呈色或顏色深淺。再向另一塊板的各孔內(nèi)加雙縮脲試劑1滴，有蛋白者呈藍(lán)紫色。【實驗結(jié)果】可用＋、－號表示有無呈色或顏色深淺。將雙色脲反應(yīng)呈色最深的一管收集液保留供下次實驗使用。利用醋酸纖維素薄膜電泳檢測本次實驗所提γ-球蛋白的純度。1．

使用離心機前注意配平；2．

裝柱要均勻，不要有氣泡和分層，凝膠面要平整；3．凝膠高度要在柱高的1/3~3/4之間；4．脫鹽時不能沖擊凝膠面，PBS液面不能降到凝膠面以下；5．實驗后將凝膠中鹽洗脫干凈后回收再利用。【實驗注意事項】【思考題】1.裝柱不均勻，凝膠面不平整對實驗結(jié)果有什么影響？2.鹽析與變性的異同？3．凝膠層析的原理？濃縮（Anti-dialysis）濃縮將凝膠過濾得到的γ－球蛋白液倒入透析袋內(nèi)，懸于盛有濃蔗糖溶液的小燒杯內(nèi)，振蕩1小時以上，觀察袋內(nèi)液體體積變化（二）血清γ-蛋白的鑒定——醋酸纖維素薄膜電泳實驗8【儀器試劑】電泳儀、點樣器、鑷子、醋酸纖維素薄膜；巴比妥緩沖液、染色液、漂洗掖。

【實驗原理

】1.蛋白質(zhì)是兩性電解質(zhì)，在同一個PH環(huán)境下，混合蛋白質(zhì)中各種成分帶電量不同、分子大小不同，在同一電場中泳動的速度不同，導(dǎo)致相同的時間遷移的距離不同而把它們分開。（1）分子越小，泳動速度越快（2）帶電量越多，泳動速度越快反之，越慢。1.準(zhǔn)備與點樣：用巴比妥緩沖液將醋酸纖維素薄膜充分浸透，在毛面距一端1.5厘米處點樣，即上述實驗得到的γ-蛋白，另取薄膜一點全血清。2.電泳：點樣面朝下，點樣端靠近負(fù)極，電流1mA/條，通電40-45min；3．染色：2-5min；4.脫色：直至背景漂凈為止。【實驗操作】【實驗結(jié)果】根據(jù)電泳區(qū)帶出現(xiàn)的位置和條數(shù)判斷是何種血清蛋白，如果只是一條γ-蛋白說明上個實驗分離純化的較好。1．不要用手觸摸纖維素膜；2