鏈霉菌的基因組

及其抗生素生物合成基因研究

吳雪昌

浙江大學遺傳學研究所

InstituteofGeneticsZhejiangUniversity

鏈霉菌的基因組

1

鏈霉菌是一類主要來源于土壤的革蘭氏陽性菌，約占土壤可培養微生物的1—20%。在系統生物學上它歸于鏈霉菌屬（Streptomyces），鏈霉菌屬中的鏈霉菌，迄今有約500個種。它與其它原核生物相比，鏈霉菌具有比較復雜的形態結構、生活周期與遺傳特性。其重要特點之一是具有豐富的次級代謝多樣性。鏈霉菌是一類主要來源于土壤的革蘭氏陽性菌，約占2

在已知的微生物所產生的抗生素中，約2／3由放線菌產生，而其中的80％來源于鏈霉菌，可見鏈霉菌在醫藥上的重要性。鏈霉菌由于它與我們人類健康的密切關系及商業上的重要價值而成為當代生命科學中的研究熱點之一。下面擇幾個較重要問題加以探討：

在已知的微生物所產生的抗生素中，約2／3由放線菌3鏈霉菌的基因組及其抗生素生物合成基因研究課件4鏈霉菌的基因組及其抗生素生物合成基因研究課件5

這一研究計劃共有44位學者參與完成，涉及四個單位。主要完成單位是WellcomeTrustSangerInstitute,Hinxton,Cambridge，UK.，世界著名的鏈霉菌遺傳學學者D.A.Hopwood及他所在的JohnInnesCenter(Norwich,UK)也參與了研究，這一研究計劃共有44位學者參與完成，涉及四個單位。主要6

參與研究的還有Departmentofchemistry,UniversityofWarwich,Coventry,UK.，

我國臺灣的InstituteofGenetics,NationalYang-MingUniversity也有一位學者（C.W.Chen）參與了這一計劃的研究工作［1］。

已公布的鏈霉菌的基因組的基本信息見Table1：參與研究的還有Departmentofchemis7表表8

從上表可見，鏈霉菌的基因組是目前已完成測序的原核生物基因組中生物信息量較大的基因組之一，生物信息量排名第二，比大腸桿菌（E.coliK124639221bp）的基因組大近一倍；最大的為Bradyrhizobiumjaponicum（nt.9105828bp）。目前已完成測序94個細菌菌株（涉及51個細菌屬）。鏈霉菌基因組見下圖：

從上表可見，鏈霉菌的基因組是目前已完成測序的原核生物9鏈霉菌的基因組及其抗生素生物合成基因研究課件10二、鏈霉菌抗生素生物合成相關基因簇

研究已知，鏈霉菌抗生素生物合成相關基因在鏈霉菌細胞中有兩種存在方式：一是大多數抗生素其生物合成基因存在于染色體上。二是少數抗生素的生物合成基因存在于游離狀態的質粒上，如天藍色鏈霉菌3（2）菌株中的次甲霉素（Methylenomycin）的生物合成基因位于SCP（1）質粒上。

二、鏈霉菌抗生素生物合成相關基因簇

研究已知，11鏈霉菌抗生素生物合成相關基因在染色體或質粒上往往成簇排列,構成基因簇（Genecluster）。包括抗生素的生物合成基因、耐藥基因、轉運基因和調節基因，而耐藥、轉運與調節基因三者大多與抗生素生物合成基因緊密連鎖并存在一種協同調節機制。鏈霉菌抗生素生物合成相關基因在染色體或質粒上往12

例如目前用于治療急性白血病(Leukemia)與淋巴瘤(Lymphomas)有良好療效的阿克拉霉素（Aclacinomycin），它是由Streptomycesgalilaeus合成的聚酮類化合物，其合成酶的生物合成涉及13個基因，緊密成簇排列。請見下圖與表：例如目前用于治療急性白血病(Leukemia)13鏈霉菌的基因組及其抗生素生物合成基因研究課件14Gene203：1–9Gene203：1–915鏈霉菌抗生素生物合成相關基因在染色體或質粒上成簇排列的特性，為我們研究這些基因的結構、調控表達與進行基因克隆提供了方便。但是也帶來了一些問題，例如其中某一個基因一旦發生突變，有時往往要影響到鄰近基因的調控表達效率甚至關閉表達。這也可能是導致抗生素生產菌株常常表現出生產性能不穩定、效價達到一定水平后，進一步提高其發酵效價就十分艱難的重要原因之一。鏈霉菌抗生素生物合成相關基因在染色體或質粒上成16三、鏈霉菌抗生素抗性（耐藥）基因（Antibioticresistancegene）

抗生素普遍存在于環境中（尤其是土壤環境中），對細菌的生存造成了壓力。在長期的進化過程中，抗生素耐藥基因在細菌中已經普遍存在，這是自然選擇的結果。在非抗生素產生菌中，抗生素耐藥基因的表達主要是為了應對環境的抗生素壓力。三、鏈霉菌抗生素抗性（耐藥）基因（Antibioticre17而對某些產抗生素鏈霉菌而言，除了受到環境中的抗生素壓力外，還首當其沖地受到自身所產生的抗生素的更強的壓力，在長期的進化中，這些鏈霉菌也被認為是通過自然選擇積累了相應的抗生素耐藥基因和調節基因，以保護自身免受這些高濃度的致命代謝物的傷害。而這些基因又被認為是病原細菌獲得性耐藥因子的最初來源。而對某些產抗生素鏈霉菌而言，除了受到環境中的抗18

產抗菌株存在抗性基因，這不難理解。研究發現，產抗菌株不僅存在抗性基因，而且抗性基因還參與了抗生素的生物合成與調控，以確?？股啬退幮缘募皶r表達，從而免受自身抗生素的傷害。研究還發現，產抗菌株的抗性水平與該菌株自身的產抗水平呈正相關。產抗菌株存在抗性基因，這不難理解。研究發19

這就使研究者們很快設想到，提高產抗菌株存在的耐藥水平，就會提高菌株的產抗生素水平。因此，對產抗菌株的抗性基因的結構、表達調控研究，在理論與工農醫實踐上均有重要的意義而成為研究熱點之一。

到目前為止，已揭示了一些基本規律，也開展了有一定成效的應用研究。這就使研究者們很快設想到，提高產抗菌株存在的耐藥201、在產抗生素的鏈霉菌中，耐藥基因一般與抗生素合成基因緊密連鎖，而大部分抗生素合成基因簇位于染色體DNA上。因而與合成基因連鎖的耐藥基因也存在于染色體DNA上。到目前為止所發現的抗生素合成基因簇中只有位于SCP1質粒上的次甲霉素基因簇是一個例外，抗生素耐藥基因可以脫離抗生素合成基因簇而單獨存在于質粒上，隨質粒一起轉移和擴散。1、在產抗生素的鏈霉菌中，耐藥基因一般與抗生素合成基因緊21

2、抗生素耐藥基因的抗抗生素種類（選擇性）與其位置有關?？股啬退幓驅股氐倪x擇性不同，其中具有較強的抗生素選擇性耐藥基因往往與抗生素合成基因成簇存在，而表達多種抗生素耐藥性的基因則不與抗生素合成基因成簇存在。

2、抗生素耐藥基因的抗抗生素種類（選擇性）與其位置有關。22如始旋鏈霉菌（S．pristinaespiralis）能夠合成鏈陽菌素類抗生素原霉素（Pristinamycin），它是兩種結構不同的分子的混合物，即原霉素Ⅰ（環形十六肽）和原霉素Ⅱ（多不飽和大環內酯）。從始旋鏈霉菌中克隆的原霉素耐藥基因Ptr能夠編碼膜轉運蛋白，Ptr在淺青紫鏈霉菌表達時，不僅可以提高對原霉素Ⅰ和Ⅱ的耐藥性，還可以提高利福平耐藥性。Ptr獨立于原霉素合成基因簇而存在。如始旋鏈霉菌（S．pristinaespiralis）能233、耐藥基因可能是抗生素合成基因簇的一部分，在抗生素合成過程中起限速作用。在吸水鏈霉菌（S．hydroscopicus）中，與抗生素bialaphos合成基因緊密連鎖的耐藥基因bar所編碼的產物與bialaphos生物合成途徑第10步所需的乙酸基轉移酶相同，bar可能是bialaphos生物合成途徑的一部分。3、耐藥基因可能是抗生素合成基因簇的一部分，在抗生素合成過程244、耐藥水平與抗生素合成水平呈正相關，抗生素產生能力的提高應該是抗生素合成調控基因的超量表達。這說明表達抗生素耐藥性的酶是抗生素生物合成途徑的限速酶.Fernandez從普卡霉素產生菌S．argillaceus中分離的2個普卡霉素耐藥基因mtmGⅠ和mtmGⅡ，4、耐藥水平與抗生素合成水平呈正相關，抗生素產生能力的提高25分別編碼普卡霉素生物合成過程中所必需的糖基轉移酶和葡萄糖醛酸苷轉移酶。分別將這2個基因通過基因置換失活后，高效液相色譜分析發現變異株失去了合成普卡霉素的能力，但積累了普卡霉素生物合成途徑中的中間產物。分別編碼普卡霉素生物合成過程中所必需的糖基轉移酶和葡萄糖265、在抗生素耐藥機制方面，在細菌中，至少存在以下幾種抗生素耐藥機制：

（1）合成鈍化抗生素的酶，如弗氏鏈霉菌的氨基糖在耐藥性主要通過產生催化抗生素共價修飾的酶；

（2）改變細菌細胞膜結構，如胰蛋白的缺失或變異、內膜滲透性的改變等；5、在抗生素耐藥機制方面，在細菌中，至少存在以下幾種抗生素耐27（3）通過主動排出機制降低細胞內的抗生素積累，如抗生鏈霉菌（S.antibioticus）oleC基因所控制的竹桃霉素主動外排；

（4）改變核糖體靶位，如從卡那霉素產生菌卡那霉素鏈霉菌（S．kanamyceticus）中分離得到的一種誘導性卡那霉素耐藥基因，（3）通過主動排出機制降低細胞內的抗生素積累，如抗生鏈霉菌（28通過修飾核糖體，調節蛋白質合成，可以賦子淺青紫鏈霉菌(S.lividans)、淡紫灰鏈霉菌（S．lavendulae）和微小鏈霉菌(S.parvulus)卡那霉素耐藥性；

（5）改變靶酶，如青霉素結合蛋白；

（6）過量合成靶酶；

（7）存在抗生素抑制的旁路。通過修飾核糖體，調節蛋白質合成，可以賦子淺青紫鏈霉菌(S.l29四、產抗鏈霉菌的基因工程

隨著對抗生素生物合成基因以及調控基因的深入了解，人們已可以在分子水平上改造鏈霉菌使它們過量合成抗生素或改造抗生素的結構獲得新功效抗生素。

目前提高產抗鏈霉菌產抗水平的基因工程所采用的主要策略與有關基因克隆實例：四、產抗鏈霉菌的基因工程

隨著對抗生素生物合成基因以及調30

（一）策略

１、改善或提高限速步驟相關酶的活性，或增加單位細胞內控制限速步驟相關酶的基因拷貝數，解除或一定程度上解除該酶的限速性；

２、用強啟動子替換相關基因簇中的弱啟動子；

３、增加細胞內攜帶抗生素生物合成基因簇質粒的拷貝數；（一）策略

１、改善或提高限速步驟相關酶的活性，或增加單位31４、抑制負調控蛋白的合成或敲除編碼負調控蛋白的基因；

５、將經改造的或篩選獲得的強抗生素抗性基因導入低耐藥菌，提高產抗菌株的抗生素抗性；

6、引入編碼抗生素分子結構修飾酶之基因，改變原抗生素分子結構，獲得具有新功能的抗生素。４、抑制負調控蛋白的合成或敲除編碼負調控蛋白的基因；

５、將32（二）實例１（二）實例１33

抗生素（公司）克隆方法與類型β-內酰胺類克拉維酸（Beecham）頭霉素C（Panlabs）芳香聚酮體類放線紫紅素榴菌素土霉素（Pfizer)

突變互補全部生物合成基因克隆在異源宿主中

突變互補actI基因作為雜交探針抗性基因抗生素（公司）克隆方法與類34

抗生素（公司）克隆方法與類型

大環內酯類泰樂星（EliLilly)碳霉素（EliLilly)紅霉素(EliLilly,Abbott)Avermectin(merck)

根據O-轉甲基酶序列合成的寡聚核苷酸探針，抗性基因選擇抗性基因抗性基因突變互補抗生素（公司）克隆方法與35

抗生素（公司）克隆方法與類型氨基糖苷類鏈霉素西索米星(Scheriny)

突變互補抗性基因

抗生素（公司）克隆方法36

抗生素（公司）克隆方法與類型其他種類諾西肽(MitsubishiChemicalIndustries)次甲霉素

十一烷基靈菌紅素放線菌素DBialaphos(MeijiSeika,Biogen)嘌呤霉素

抗性基因突變克隆，全部生物合成途徑基因克隆于異源宿主突變互補酚口惡嗪酮合成酶活性基因克隆抗性基因選擇，突變互補抗性基因

抗生素（公司）克隆方37

謝謝！謝謝！38

鏈霉菌的基因組

及其抗生素生物合成基因研究

吳雪昌

浙江大學遺傳學研究所

InstituteofGeneticsZhejiangUniversity

鏈霉菌的基因組

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鏈霉菌是一類主要來源于土壤的革蘭氏陽性菌，約占土壤可培養微生物的1—20%。在系統生物學上它歸于鏈霉菌屬（Streptomyces），鏈霉菌屬中的鏈霉菌，迄今有約500個種。它與其它原核生物相比，鏈霉菌具有比較復雜的形態結構、生活周期與遺傳特性。其重要特點之一是具有豐富的次級代謝多樣性。鏈霉菌是一類主要來源于土壤的革蘭氏陽性菌，約占40

在已知的微生物所產生的抗生素中，約2／3由放線菌產生，而其中的80％來源于鏈霉菌，可見鏈霉菌在醫藥上的重要性。鏈霉菌由于它與我們人類健康的密切關系及商業上的重要價值而成為當代生命科學中的研究熱點之一。下面擇幾個較重要問題加以探討：

在已知的微生物所產生的抗生素中，約2／3由放線菌41鏈霉菌的基因組及其抗生素生物合成基因研究課件42鏈霉菌的基因組及其抗生素生物合成基因研究課件43

這一研究計劃共有44位學者參與完成，涉及四個單位。主要完成單位是WellcomeTrustSangerInstitute,Hinxton,Cambridge，UK.，世界著名的鏈霉菌遺傳學學者D.A.Hopwood及他所在的JohnInnesCenter(Norwich,UK)也參與了研究，這一研究計劃共有44位學者參與完成，涉及四個單位。主要44

參與研究的還有Departmentofchemistry,UniversityofWarwich,Coventry,UK.，

我國臺灣的InstituteofGenetics,NationalYang-MingUniversity也有一位學者（C.W.Chen）參與了這一計劃的研究工作［1］。

已公布的鏈霉菌的基因組的基本信息見Table1：參與研究的還有Departmentofchemis45表表46

從上表可見，鏈霉菌的基因組是目前已完成測序的原核生物基因組中生物信息量較大的基因組之一，生物信息量排名第二，比大腸桿菌（E.coliK124639221bp）的基因組大近一倍；最大的為Bradyrhizobiumjaponicum（nt.9105828bp）。目前已完成測序94個細菌菌株（涉及51個細菌屬）。鏈霉菌基因組見下圖：

從上表可見，鏈霉菌的基因組是目前已完成測序的原核生物47鏈霉菌的基因組及其抗生素生物合成基因研究課件48二、鏈霉菌抗生素生物合成相關基因簇

研究已知，鏈霉菌抗生素生物合成相關基因在鏈霉菌細胞中有兩種存在方式：一是大多數抗生素其生物合成基因存在于染色體上。二是少數抗生素的生物合成基因存在于游離狀態的質粒上，如天藍色鏈霉菌3（2）菌株中的次甲霉素（Methylenomycin）的生物合成基因位于SCP（1）質粒上。

二、鏈霉菌抗生素生物合成相關基因簇

研究已知，49鏈霉菌抗生素生物合成相關基因在染色體或質粒上往往成簇排列,構成基因簇（Genecluster）。包括抗生素的生物合成基因、耐藥基因、轉運基因和調節基因，而耐藥、轉運與調節基因三者大多與抗生素生物合成基因緊密連鎖并存在一種協同調節機制。鏈霉菌抗生素生物合成相關基因在染色體或質粒上往50

例如目前用于治療急性白血病(Leukemia)與淋巴瘤(Lymphomas)有良好療效的阿克拉霉素（Aclacinomycin），它是由Streptomycesgalilaeus合成的聚酮類化合物，其合成酶的生物合成涉及13個基因，緊密成簇排列。請見下圖與表：例如目前用于治療急性白血病(Leukemia)51鏈霉菌的基因組及其抗生素生物合成基因研究課件52Gene203：1–9Gene203：1–953鏈霉菌抗生素生物合成相關基因在染色體或質粒上成簇排列的特性，為我們研究這些基因的結構、調控表達與進行基因克隆提供了方便。但是也帶來了一些問題，例如其中某一個基因一旦發生突變，有時往往要影響到鄰近基因的調控表達效率甚至關閉表達。這也可能是導致抗生素生產菌株常常表現出生產性能不穩定、效價達到一定水平后，進一步提高其發酵效價就十分艱難的重要原因之一。鏈霉菌抗生素生物合成相關基因在染色體或質粒上成54三、鏈霉菌抗生素抗性（耐藥）基因（Antibioticresistancegene）

抗生素普遍存在于環境中（尤其是土壤環境中），對細菌的生存造成了壓力。在長期的進化過程中，抗生素耐藥基因在細菌中已經普遍存在，這是自然選擇的結果。在非抗生素產生菌中，抗生素耐藥基因的表達主要是為了應對環境的抗生素壓力。三、鏈霉菌抗生素抗性（耐藥）基因（Antibioticre55而對某些產抗生素鏈霉菌而言，除了受到環境中的抗生素壓力外，還首當其沖地受到自身所產生的抗生素的更強的壓力，在長期的進化中，這些鏈霉菌也被認為是通過自然選擇積累了相應的抗生素耐藥基因和調節基因，以保護自身免受這些高濃度的致命代謝物的傷害。而這些基因又被認為是病原細菌獲得性耐藥因子的最初來源。而對某些產抗生素鏈霉菌而言，除了受到環境中的抗56

產抗菌株存在抗性基因，這不難理解。研究發現，產抗菌株不僅存在抗性基因，而且抗性基因還參與了抗生素的生物合成與調控，以確?？股啬退幮缘募皶r表達，從而免受自身抗生素的傷害。研究還發現，產抗菌株的抗性水平與該菌株自身的產抗水平呈正相關。產抗菌株存在抗性基因，這不難理解。研究發57

這就使研究者們很快設想到，提高產抗菌株存在的耐藥水平，就會提高菌株的產抗生素水平。因此，對產抗菌株的抗性基因的結構、表達調控研究，在理論與工農醫實踐上均有重要的意義而成為研究熱點之一。

到目前為止，已揭示了一些基本規律，也開展了有一定成效的應用研究。這就使研究者們很快設想到，提高產抗菌株存在的耐藥581、在產抗生素的鏈霉菌中，耐藥基因一般與抗生素合成基因緊密連鎖，而大部分抗生素合成基因簇位于染色體DNA上。因而與合成基因連鎖的耐藥基因也存在于染色體DNA上。到目前為止所發現的抗生素合成基因簇中只有位于SCP1質粒上的次甲霉素基因簇是一個例外，抗生素耐藥基因可以脫離抗生素合成基因簇而單獨存在于質粒上，隨質粒一起轉移和擴散。1、在產抗生素的鏈霉菌中，耐藥基因一般與抗生素合成基因緊59

2、抗生素耐藥基因的抗抗生素種類（選擇性）與其位置有關。抗生素耐藥基因對抗生素的選擇性不同，其中具有較強的抗生素選擇性耐藥基因往往與抗生素合成基因成簇存在，而表達多種抗生素耐藥性的基因則不與抗生素合成基因成簇存在。

2、抗生素耐藥基因的抗抗生素種類（選擇性）與其位置有關。60如始旋鏈霉菌（S．pristinaespiralis）能夠合成鏈陽菌素類抗生素原霉素（Pristinamycin），它是兩種結構不同的分子的混合物，即原霉素Ⅰ（環形十六肽）和原霉素Ⅱ（多不飽和大環內酯）。從始旋鏈霉菌中克隆的原霉素耐藥基因Ptr能夠編碼膜轉運蛋白，Ptr在淺青紫鏈霉菌表達時，不僅可以提高對原霉素Ⅰ和Ⅱ的耐藥性，還可以提高利福平耐藥性。Ptr獨立于原霉素合成基因簇而存在。如始旋鏈霉菌（S．pristinaespiralis）能613、耐藥基因可能是抗生素合成基因簇的一部分，在抗生素合成過程中起限速作用。在吸水鏈霉菌（S．hydroscopicus）中，與抗生素bialaphos合成基因緊密連鎖的耐藥基因bar所編碼的產物與bialaphos生物合成途徑第10步所需的乙酸基轉移酶相同，bar可能是bialaphos生物合成途徑的一部分。3、耐藥基因可能是抗生素合成基因簇的一部分，在抗生素合成過程624、耐藥水平與抗生素合成水平呈正相關，抗生素產生能力的提高應該是抗生素合成調控基因的超量表達。這說明表達抗生素耐藥性的酶是抗生素生物合成途徑的限速酶.Fernandez從普卡霉素產生菌S．argillaceus中分離的2個普卡霉素耐藥基因mtmGⅠ和mtmGⅡ，4、耐藥水平與抗生素合成水平呈正相關，抗生素產生能力的提高63分別編碼普卡霉素生物合成過程中所必需的糖基轉移酶和葡萄糖醛酸苷轉移酶。分別將這2個基因通過基因置換失活后，高效液相色譜分析發現變異株失去了合成普卡霉素的能力，但積累了普卡霉素生物合成途徑中的中間產物。分別編碼普卡霉素生物合成過程中所必需的糖基轉移酶和葡萄糖645、在抗生素耐藥機制方面，在細菌中，至少存在以下幾種抗生素耐藥機制：

（1）合成鈍化抗生素的酶，如弗氏鏈霉菌的氨基糖在耐藥性主要通過產生催化抗生素共價修飾的酶；

（2）改變細菌細胞膜結構，如胰蛋白的缺失或變異、內膜滲透性的改變等；5、在抗生素耐藥機制方面，在細菌中，至少存在以下幾種抗生素耐65（3）通過主動排出機制降低細胞內的抗生素積累，如抗生鏈霉菌（S.antibioticus）oleC基因所控制的竹桃霉素主動外排；

（4）改變核糖體靶位，如從卡那霉素產生菌卡那霉素鏈霉菌（S．kanamyceticus）中分離得到的一種誘導性卡那霉素耐藥基因，（3）通過主動排出機制降低細胞內的抗生素積累，如抗生鏈霉菌（66通過修飾核糖體，調節蛋白質合成，可以賦子淺青紫鏈霉菌(S.lividans)、淡紫灰鏈霉菌（S．lavendulae）和微小鏈霉菌(S.parvulus)卡那霉素耐藥性；

（5）改變靶酶，如青霉素結合蛋白；

（6）過量合成靶酶；

（7）存在抗生素抑制的旁路。通過修飾核糖體，調節蛋白質合成，可以賦子淺青紫鏈霉菌(S.l67四、產抗鏈霉菌的基因工程

隨著對抗生素生物合成基因以及調控基因的深入了解，人們已可以在分子水平上改造鏈霉菌使它們過量合成抗生素或改造抗生素的結構獲得新功效抗生素。

目前提高產抗鏈霉菌產抗水平的基因工程所采用的主要策略與有關基因克隆實例：四、產抗鏈霉菌的基因工程

隨著對抗生素生物合成基因以及調68

（一）策略

１、改善或提高限速步驟相關酶的活性，或增加單位細胞內控制限速步驟相關酶的基因拷貝數，解除或一定程度上解除該酶的限速性；

２、用強啟動子替換相關基因簇中的弱啟動子；

３、增加細胞內攜帶抗生素生物合成基因簇質粒的拷貝數；（一）策略

１、改善或提高限速步驟相關酶的活性，或增加單位