組織培養(yǎng)細(xì)胞的生物學(xué)第二章組織培養(yǎng)細(xì)胞的生物學(xué)第二章Contents細(xì)胞生存環(huán)境和代謝附著底物人工培養(yǎng)基教學(xué)內(nèi)容1235體內(nèi)、外細(xì)胞的差異和分化體外培養(yǎng)細(xì)胞的分型細(xì)胞相互關(guān)系細(xì)胞系（株）的建立87643組織培養(yǎng)細(xì)胞的生長和增殖過程2022/11/272Contents細(xì)胞生存環(huán)境和代謝附著底物人工培養(yǎng)基教學(xué)內(nèi)容在個體發(fā)生過程中，細(xì)胞通過不斷的生長和繁殖，數(shù)量增多，與此同時發(fā)生著分化。分化：及細(xì)胞在形態(tài)和功能上由一般發(fā)展到特殊的過程，由于分化的結(jié)果，形成了各種組織和器官。一、體內(nèi)、外細(xì)胞的差異和分化2022/11/273在個體發(fā)生過程中，細(xì)胞通過不斷的生長和繁殖，數(shù)量增多，因模擬的培養(yǎng)條件與體內(nèi)實際情況仍有很大差異，易發(fā)生以下變化：分化現(xiàn)象減少，形態(tài)和功能趨于單一，生存一定時間后衰退死亡或發(fā)生轉(zhuǎn)化，變成有無限生長能力的連續(xù)細(xì)胞系或惡性細(xì)胞系。如：腺細(xì)胞分泌機(jī)能喪失，肌細(xì)胞纖維細(xì)胞化。原因：細(xì)胞在人工培養(yǎng)以后，可能導(dǎo)致很多基因關(guān)閉，而導(dǎo)致分化停止、功能喪失。可以利用這一點(diǎn)，來研究基因表達(dá)和調(diào)控。（一）差異2022/11/274因模擬的培養(yǎng)條件與體內(nèi)實際情況仍有很大差異，易發(fā)生以下變化：體外培養(yǎng)細(xì)胞分化能力并未完全喪失，只是因環(huán)境改變其分化表現(xiàn)和原體內(nèi)不同。如：體內(nèi)：成纖維細(xì)胞、骨細(xì)胞→膠原體外：成纖維細(xì)胞、上皮細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞→膠原。如何揭示細(xì)胞分化的條件，闡明分化調(diào)控的機(jī)制是主要的。（二）分化2022/11/275體外培養(yǎng)細(xì)胞分化能力并未完全喪失，只是因環(huán)境改變其分化表現(xiàn)和據(jù)能否貼附在支持物上生長的性質(zhì)，分：2、懸浮型(ES細(xì)胞，老鼠，初生培養(yǎng)；熒光，DAPI染色劑)1、貼附型(心肌細(xì)胞，老鼠，初生培養(yǎng))二、體外培養(yǎng)細(xì)胞的分型2022/11/276據(jù)能否貼附在支持物上生長的性質(zhì)，分：2、懸浮型(ES細(xì)胞，老培養(yǎng)時能貼附在支持物上生長，大多數(shù)細(xì)胞呈貼附型生長。特點(diǎn)：1、分化現(xiàn)象變得不顯著，易失去它們在體內(nèi)時的原有特征。2、形態(tài)上常表現(xiàn)單一化的現(xiàn)象，并常反映其胚層起源，類似所謂“返祖”現(xiàn)象。如：起源于內(nèi)、外胚層的細(xì)胞多呈上皮型。

中胚層------------------呈成纖維細(xì)胞型。體外培養(yǎng)細(xì)胞的形態(tài)常表現(xiàn)有一般化的傾向。因此，判定細(xì)胞形態(tài)很難按體內(nèi)細(xì)胞標(biāo)準(zhǔn)確定，僅大致分成以下幾類：（一）貼附型2022/11/277培養(yǎng)時能貼附在支持物上生長，大多數(shù)細(xì)胞呈貼附型生長。（一）貼與體內(nèi)成纖維細(xì)胞的形態(tài)相似而得名。心肌、平滑肌、成骨細(xì)胞、血管內(nèi)皮（中胚層間充質(zhì)起源）都呈此形態(tài)。成纖維細(xì)胞型1、成纖維細(xì)胞型2022/11/278與體內(nèi)成纖維細(xì)胞的形態(tài)相似而得名。心肌、平滑肌、成骨細(xì)

起源于內(nèi)、外胚層細(xì)胞。如：皮膚表皮，消化管上皮、肝、胰、肺泡上皮等。

上皮細(xì)胞型2、上皮細(xì)胞型2022/11/279起源于內(nèi)、外胚層細(xì)胞。上皮細(xì)胞型2、上皮細(xì)胞型2022/此型不穩(wěn)定，有時難與其它細(xì)胞相區(qū)別。游走細(xì)胞型3、游走細(xì)胞型2022/11/2710此型不穩(wěn)定，有時難與其它細(xì)胞相區(qū)別。游走細(xì)胞型3、游走細(xì)胞型除上述三型外，其它難以確定它們規(guī)律和形態(tài)的，統(tǒng)歸為“多形細(xì)胞型”。如：神經(jīng)組織的細(xì)胞。多型細(xì)胞型4、多形細(xì)胞型2022/11/2711除上述三型外，其它難以確定它們規(guī)律和形態(tài)的，統(tǒng)歸為“多形細(xì)培養(yǎng)細(xì)胞的形態(tài)受多種因素的影響，如：溫度，二氧化碳，酸、堿、密度等。如：Hela細(xì)胞，本屬上皮型，但過酸、過堿變成梭形。上皮細(xì)胞數(shù)量少時，呈星形或三角形。數(shù)量多時，呈上皮型。它來源于美國的HelenLane，她1951年死于子宮頸癌2022/11/2712培養(yǎng)細(xì)胞的形態(tài)受多種因素的影響，它來源于美國的Hele培養(yǎng)時，不貼附與支持物上，而呈懸浮狀態(tài)生長。如：某些癌細(xì)胞、白細(xì)胞。其優(yōu)點(diǎn)：細(xì)胞生存空間大，容許長時間生長，能繁殖多量細(xì)胞，便于做細(xì)胞代謝研究。S180細(xì)胞（二）懸浮型2022/11/2713培養(yǎng)時，不貼附與支持物上，而呈懸浮狀態(tài)生長。S180細(xì)胞（二體外培養(yǎng)細(xì)胞的生存空間和營養(yǎng)是有限的，當(dāng)細(xì)胞增殖達(dá)到一定密度后，需要分離出一部分細(xì)胞和更新營養(yǎng)液。這一過程稱“傳代”。每次傳代都要影響細(xì)胞生長過程。另外，體外生存期一般也不是無限的。（一）組織培養(yǎng)細(xì)胞生命期（二）組織培養(yǎng)細(xì)胞一代生長過程（三）細(xì)胞周期三、組織培養(yǎng)細(xì)胞的生長和增殖過程2022/11/2714體外培養(yǎng)細(xì)胞的生存空間和營養(yǎng)是有限的，當(dāng)細(xì)胞增殖培養(yǎng)細(xì)胞生命期，是指細(xì)胞在培養(yǎng)中持續(xù)增殖和生長的時間。體內(nèi)組織細(xì)胞的生存期與完整機(jī)體的死亡衰老基本相一致。大多生存一年左右，傳30~50代，相當(dāng)150~300個細(xì)胞周期，在全生存過程中大致經(jīng)歷以下三個階段：1、第I期-----原代培養(yǎng)期（初代培養(yǎng)期）從體內(nèi)取出組織接種培養(yǎng)到第一次傳代階段，約1~4周。與體內(nèi)細(xì)胞性狀相似，適宜進(jìn)行疫苗制備、藥物測試、移植等。為保持二倍體體細(xì)胞性質(zhì)，應(yīng)在初代或傳代后早期冰凍。（一）組織培養(yǎng)細(xì)胞生命期2022/11/2715培養(yǎng)細(xì)胞生命期，是指細(xì)胞在培養(yǎng)中持續(xù)增殖和生長的時間。體2、第II期----傳代期初代培養(yǎng)細(xì)胞一經(jīng)傳代后，便稱做“細(xì)胞系”。此期，是生命期中持續(xù)時間最長、細(xì)胞增殖旺盛，呈二倍體核型的細(xì)胞系稱“二倍體細(xì)胞系”3、第III期-----衰退期細(xì)胞仍然生存，但不增殖或增殖很慢，細(xì)胞形態(tài)輪廓增強(qiáng)，最后衰退死亡。在細(xì)胞生命期階段，少數(shù)情況下，在不明原因的影響，細(xì)胞可能發(fā)生自發(fā)轉(zhuǎn)化。標(biāo)志之一，是細(xì)胞獲得不死性即持久性增殖能力，這樣的細(xì)胞群體稱“無限細(xì)胞系”。主要發(fā)生在II期，核型大多變成異倍體，轉(zhuǎn)化后的細(xì)胞可能具有惡性性質(zhì)，也可能僅有不死性而無惡性。（一）組織培養(yǎng)細(xì)胞生命期2022/11/27162、第II期----傳代期（一）組織培養(yǎng)細(xì)胞生命期2022初代培養(yǎng)有限細(xì)胞系

無限細(xì)胞系接種培養(yǎng)第一次傳代傳代傳代間隔老化死亡轉(zhuǎn)化指數(shù)細(xì)胞數(shù)量02468101216周22201816141210862022/11/2717初代培養(yǎng)有限細(xì)胞系所有體外培養(yǎng)細(xì)胞，包括初代培養(yǎng)及各種細(xì)胞系，當(dāng)生長達(dá)到一定密度后，都需做傳代處理。傳代的頻率或間隔與接種數(shù)量、細(xì)胞生物學(xué)性狀以及營養(yǎng)液的性質(zhì)等有關(guān)。細(xì)胞的“一代”僅指從細(xì)胞接種到分離再培養(yǎng)時的一段時間。如：某一細(xì)胞系為第153代細(xì)胞，即指該細(xì)胞系已傳代153次。它與細(xì)胞世代或倍增不同。在細(xì)胞一代中，細(xì)胞能倍增3~6次（二）組織培養(yǎng)細(xì)胞一代生長過程2022/11/2718所有體外培養(yǎng)細(xì)胞，包括初代培養(yǎng)及各種細(xì)胞系，當(dāng)生長達(dá)到一細(xì)胞傳一代后，一般要經(jīng)過以下幾個階段：1、游離期（懸浮期）2、貼壁期3、潛伏期4、指數(shù)生長期5、停止期（二）組織培養(yǎng)細(xì)胞一代生長過程來源：人體腎臟

形態(tài)：上皮細(xì)胞

生長特性：貼壁

注釋：該細(xì)胞含腺病毒5DNA

2022/11/2719細(xì)胞傳一代后，一般要經(jīng)過以下幾個階段：（二）組織培養(yǎng)細(xì)胞一代1、游離期（懸浮期）細(xì)胞接種后，在培養(yǎng)液中呈懸浮狀態(tài)的階段，細(xì)胞胞質(zhì)回縮，胞體變成圓形。（二）組織培養(yǎng)細(xì)胞一代生長過程2022/11/27201、游離期（懸浮期）（二）組織培養(yǎng)細(xì)胞一代生長過程2022/2、貼壁期：細(xì)胞附著于支持物上。原代細(xì)胞：24h內(nèi)貼壁。連續(xù)細(xì)胞系：5~30分鐘貼壁。單個細(xì)胞快于細(xì)胞團(tuán)、組織塊。貼壁與許多因素有關(guān)：培養(yǎng)基的酸度、污染，膠塞和培養(yǎng)器皿的清潔度，細(xì)胞本身的活性等等。血清中有許多促使細(xì)胞貼壁的冷析球蛋白（CIG）和纖粘素（FN）CIG與多聚賴氨酸聯(lián)用，有利于細(xì)胞迅速貼壁。貼壁后細(xì)胞變成放射延展細(xì)胞→極性細(xì)胞再經(jīng)過一個潛伏期階段后，才進(jìn)入生長期。細(xì)胞的貼壁和延展（二）組織培養(yǎng)細(xì)胞一代生長過程2022/11/27212、貼壁期：細(xì)胞的貼壁和延展（二）組織培養(yǎng)細(xì)胞一代生長過程23、潛伏期：此時，細(xì)胞有生長活動，而無細(xì)胞分裂。原代細(xì)胞潛伏期：24~96h或更長。連續(xù)細(xì)胞系、腫瘤細(xì)胞潛伏期短：僅6~24h。

潛伏期后，細(xì)胞分裂出現(xiàn)，并逐漸增多，進(jìn)入指數(shù)生長期。（二）組織培養(yǎng)細(xì)胞一代生長過程2022/11/27223、潛伏期：（二）組織培養(yǎng)細(xì)胞一代生長過程2022/11/24、指數(shù)生長期（對數(shù)生長期）此時期，細(xì)胞增殖旺盛，細(xì)胞數(shù)成倍增長，活力最佳，最適合進(jìn)行實驗研究。此階段可用細(xì)胞群體倍增時間、細(xì)胞分裂指數(shù)（MI）等來判斷。MI：細(xì)胞群中每1000個細(xì)胞中的分裂細(xì)0.2~0.5%，連續(xù)細(xì)胞系、腫瘤細(xì)胞的MI可高達(dá)3~5%。持續(xù)3~5天，細(xì)胞數(shù)量增多，最后生長面積消失，細(xì)胞相互接觸連接成片。此時，細(xì)胞由于相互接觸而發(fā)生“接觸抑制”。表現(xiàn)為細(xì)胞擴(kuò)展運(yùn)動停止。保證細(xì)胞不重疊生長。腫瘤細(xì)胞無接觸抑制特征，能相互重疊，向三維空間發(fā)展，只要原因充分，細(xì)胞仍能分裂、增多。正常細(xì)胞生長匯合成單層時，細(xì)胞達(dá)到一定密度，細(xì)胞停止分裂，這種現(xiàn)象稱“密度抑制”。導(dǎo)致細(xì)胞停止分裂。（二）組織培養(yǎng)細(xì)胞一代生長過程2022/11/27234、指數(shù)生長期（對數(shù)生長期）（二）組織培養(yǎng)細(xì)胞一代生長過程25、停止期：

數(shù)量已達(dá)飽和，停止增殖，但仍有代謝活動，營養(yǎng)枯竭，代謝產(chǎn)物積累，PH降低，細(xì)胞會中毒。通常，細(xì)胞長滿瓶底80%時即傳代，接種到2~3個新瓶中。（二）組織培養(yǎng)細(xì)胞一代生長過程2022/11/27245、停止期：（二）組織培養(yǎng)細(xì)胞一代生長過程2022/11/22022/11/27252022/11/2725是指細(xì)胞每一次增殖所經(jīng)歷的全過程。每經(jīng)過一個增殖周期，數(shù)量就增加一倍。據(jù)細(xì)胞周期不同時期的生化特點(diǎn)，可劃分為四個連續(xù)的時期：

G1期（DNA合成前期）細(xì)胞間期S期（DNA合成期）主要是DNA的復(fù)制。

G2期（DNA合成后期）

M期（有絲分裂期）：完成染色體的分配。細(xì)胞完成一次細(xì)胞周期所需要的時間稱為-----------“細(xì)胞周期時間”。（三）細(xì)胞周期2022/11/2726是指細(xì)胞每一次增殖所經(jīng)歷的全過程。（三）細(xì)胞周期2022/1

S期：DNA合成期間期：是細(xì)胞代謝、DNA復(fù)制旺盛時期。

G1、G2：兩個間隙有絲分裂：細(xì)胞核及其染色體分裂。細(xì)胞分裂期：胞質(zhì)分裂：細(xì)胞質(zhì)分裂成兩個子細(xì)胞。2022/11/2727

有絲分裂過程2022/11/2728有絲分裂過程2022/11/2728細(xì)胞生長的速度與細(xì)胞周期時間有關(guān)。正常細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞相比較，細(xì)胞周期時間大致相接近的。如：人的正常腸上皮細(xì)胞的細(xì)胞周期時間是：1~3天。人的結(jié)腸癌細(xì)胞的細(xì)胞周期時間是：2.5天。

急性白細(xì)胞的細(xì)胞周期時間是2~4天。正常白細(xì)胞的細(xì)胞周期時間是1天。所不同的是：正常細(xì)胞的增殖達(dá)到一定限度就停止了，而且增殖的細(xì)胞基本上相當(dāng)于丟失的細(xì)胞數(shù)，總數(shù)始終保持相對恒定。腫瘤細(xì)胞是以持續(xù)的無限制增殖、永不停止。一般說來，哺乳動物的細(xì)胞周期為10~30h，其中間期約10h。（三）細(xì)胞周期2022/11/2729細(xì)胞生長的速度與細(xì)胞周期時間有關(guān)。（三）細(xì)胞周期2022/1在體外培養(yǎng)中，單個細(xì)胞也能生存和生長，有很大的獨(dú)立性，但不是細(xì)胞永久存在的形式，不能長期生存，只有群體細(xì)胞才是細(xì)胞的基本存在形式。體外培養(yǎng)細(xì)胞間仍具有形態(tài)和功能的相互依存關(guān)系，細(xì)胞上仍有橋粒、縫隙連接，一旦兩相鄰細(xì)胞發(fā)生接觸，便呈接觸抑制現(xiàn)象，導(dǎo)致運(yùn)動停止。四、細(xì)胞相互關(guān)系2022/11/2730在體外培養(yǎng)中，單個細(xì)胞也能生存和生長，有很大的獨(dú)立性，無污染環(huán)境溫度氣體環(huán)境和氫離子濃度基本營養(yǎng)物質(zhì)促生長因子、激素滲透壓五、細(xì)胞生存環(huán)境和代謝2022/11/2731無污染環(huán)境五、細(xì)胞生存環(huán)境和代謝2022/11/2731（一）無污染環(huán)境

無菌、無毒是保證細(xì)胞生存的首要條件。（二）溫度：35~370C39~400C中1h，有一定損傷，但仍可以恢復(fù)。41~420C中1h，細(xì)胞嚴(yán)重?fù)p傷，但不致全部殺死，仍有可能恢復(fù)。430C時，很多細(xì)胞被殺死。溫度>00C：能抑制細(xì)胞代謝，并無傷害作用。

40C數(shù)小時→370C培養(yǎng)，細(xì)胞仍能生長。

溫度降至冰點(diǎn)以下，細(xì)胞可因胞質(zhì)結(jié)冰而死亡。

在培養(yǎng)液中加一定量保護(hù)劑（二甲基亞砜或甘油），封入安瓿中后，凍于液氮中，-1960C，能長期貯存，解凍后細(xì)胞復(fù)蘇，仍能繼續(xù)生長，細(xì)胞的生物性狀不受任何影響，此為細(xì)胞保存的主要手段。五、細(xì)胞生存環(huán)境和代謝2022/11/2732（一）無污染環(huán)境五、細(xì)胞生存環(huán)境和代謝2022/11/273（三）氣體環(huán)境和氫離子濃度所需氣體主要有O2，CO2。1、O2：參與三羧酸循環(huán)，供能。缺O(jiān)2，多數(shù)不能生長。一般，95%空氣加5%CO2混合氣體。O2分壓太高，對細(xì)胞也有毒害作用。2、CO2：既是細(xì)胞代謝產(chǎn)物，也是細(xì)胞所需成分，與維持培養(yǎng)液的PH有直接關(guān)系。大多數(shù)細(xì)胞PH7.2~7.4，但各種細(xì)胞對PH的要求也不完全相同。原代細(xì)胞一般對PH變動耐受性差，無限細(xì)胞系耐受性強(qiáng)。總的來說，細(xì)胞耐酸性比耐堿性大一些，在偏酸中更有利于生長。如：原代羊水細(xì)胞，PH6.8時最適。五、細(xì)胞生存環(huán)境和代謝2022/11/2733（三）氣體環(huán)境和氫離子濃度五、細(xì)胞生存環(huán)境和代謝2022/1細(xì)胞在生長過程中，不斷釋放CO2，培養(yǎng)液變酸，為維持培養(yǎng)液中PH的恒定，最常用的方法是加磷酸鹽緩沖劑

其中，NaHCO3CO2能調(diào)節(jié)CO2的含量。NaHCO3+H2O→Na+HCO3-+H2O→Na++H2CO3+OH-→Na++OH-+H2O+CO2↑。CO2易于逸出，只適用于封閉式培養(yǎng)。開瓶培養(yǎng)時，需在5%CO2

氣體環(huán)境中（CO2

培養(yǎng)箱）。為克服NaHCO3的缺點(diǎn)，也可用Hepes（羥乙基派嗪乙硫磺酸）它對細(xì)胞無毒性，是具有較強(qiáng)緩沖能力的氫離子緩沖劑。主要能穩(wěn)定和抵抗快速PH變化。其最大優(yōu)點(diǎn)：開瓶通氣觀察也能維持PH值。五、細(xì)胞生存環(huán)境和代謝2022/11/2734細(xì)胞在生長過程中，不斷釋放CO2，培養(yǎng)液變酸，為維持培養(yǎng)液中（四）基本營養(yǎng)物質(zhì)1、糖：葡萄糖、核糖、丙酮酸。2、12種基本氨基酸：精氨酸、胱氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、賴氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、蘇氨酸、色氨酸、組氨酸、酪氨酸、纈氨酸。谷氨酰胺：作為氮源、碳源，能促進(jìn)各種氨基酸進(jìn)入細(xì)胞。3、維生素：VitA、D、E、K、B族、C。4、無機(jī)鹽：Fe++、Zn++、Cu++。五、細(xì)胞生存環(huán)境和代謝2022/11/2735（四）基本營養(yǎng)物質(zhì)五、細(xì)胞生存環(huán)境和代謝2022/11/27（五）促生長因子、激素如：胰島素-------促進(jìn)葡萄糖、氨基酸的吸收。氫化可的松--------細(xì)胞粘著，增殖。（六）滲透壓7.6個大氣壓（5776mmHg）=770KPa。五、細(xì)胞生存環(huán)境和代謝2022/11/2736（五）促生長因子、激素五、細(xì)胞生存環(huán)境和代謝2022/11/

半固體培養(yǎng)基按物理性狀：

液體培養(yǎng)基--------最主要的。按來源分：

天然培養(yǎng)基：合成培養(yǎng)基+血漿、血清、胎汁。

合成培養(yǎng)基：據(jù)細(xì)胞所需的嚴(yán)格配制。無血清培養(yǎng)基：增添促細(xì)胞生長因子。六、人工培養(yǎng)基2022/11/2737半固體培養(yǎng)基六、人工培養(yǎng)基202除少數(shù)懸浮型細(xì)胞外，絕大多數(shù)體外培養(yǎng)細(xì)胞需附著在適宜的底物上才能生長。細(xì)胞貼附底物生長的性質(zhì)稱“錨著依賴性”。原則上講，凡對細(xì)胞無毒性的物質(zhì)，都可用作底物。但不同的細(xì)胞對底物的要求各異，底物不合適，細(xì)胞生長不良。玻璃一次性塑料微載體飼細(xì)胞（也稱滋養(yǎng)細(xì)胞）七、附著底物2022/11/2738除少數(shù)懸浮型細(xì)胞外，絕大多數(shù)體外培養(yǎng)細(xì)胞需附著在適宜的底（一）玻璃是最常用的培養(yǎng)底物，透明、便于觀察、洗滌，能反復(fù)使用，質(zhì)地以中性玻璃為上，適合于各種細(xì)胞附著生長。缺點(diǎn)：易破碎。（二）一次性塑料聚苯乙烯。經(jīng)加工處理，表面具有親水性，聚四氟乙烯。七、附著底物2022/11/2739（一）玻璃七、附著底物2022/11/2739（三）微載體由聚苯乙烯和聚丙烯酰胺制成的小球體，附著面大，有利于大量繁殖細(xì)胞。天然葡萄糖聚合物（葡聚糖）作載體，直徑50um或數(shù)百um不等，如：微載體培養(yǎng)系統(tǒng)。（四）飼細(xì)胞（也稱滋養(yǎng)細(xì)胞）可用小鼠成纖維細(xì)胞或其它細(xì)胞長成單層后，再用大劑量射線照射，使細(xì)胞失去增殖力，但還存活，仍能進(jìn)行代謝活動，可支持其它細(xì)胞生長。七、附著底物2022/11/2740（三）微載體七、附著底物2022/11/2740（一）常用術(shù)語1、細(xì)胞培養(yǎng)：單個細(xì)胞在體外條件下的生長。2、組織或器官培養(yǎng)：是指組織、器官在體外的維持或生長，它們可以分化并保持原來的結(jié)構(gòu)或功能。3、外植塊：用于開始體外培養(yǎng)而切下的一小塊組織或器官。4、細(xì)胞系：原代培養(yǎng)物經(jīng)首次傳代成功后即成細(xì)胞系。

如果細(xì)胞系不能繼續(xù)傳代或傳代數(shù)有限------有限細(xì)胞系。如果細(xì)胞系可連續(xù)傳代-----連續(xù)細(xì)胞系，即已建成的細(xì)胞系。八、細(xì)胞系（株）的建立2022/11/2741（一）常用術(shù)語八、細(xì)胞系（株）的建立2022/11/27415、細(xì)胞一代時間：單個細(xì)胞兩次連續(xù)分裂的時間間隔。6、再培養(yǎng)：單層細(xì)胞不經(jīng)任何丟失而轉(zhuǎn)移到新鮮培養(yǎng)基的過程。7、原代培養(yǎng)：從機(jī)體取得材料（細(xì)胞、組織或器官）在培養(yǎng)瓶內(nèi)培養(yǎng)到第一次傳代前，即為原代培養(yǎng)或初代培養(yǎng)。8、傳代培養(yǎng)或傳代：指將細(xì)胞從一個培養(yǎng)容器移植到另一培養(yǎng)容器中培養(yǎng)。八、細(xì)胞系（株）的建立2022/11/27425、細(xì)胞一代時間：單個細(xì)胞兩次連續(xù)分裂的時間間隔。八、細(xì)胞系（二）建立細(xì)胞系（株）的要求限于初代培養(yǎng)的細(xì)胞，只要供體均一，取材部位及組織種類等條件穩(wěn)定，則無須多項鑒定。長期使用，特別是反復(fù)傳代的細(xì)胞，有以下一些要求：1、組織來源2、細(xì)胞生物學(xué)檢測3、培養(yǎng)條件和方法八、細(xì)胞系（株）的建立2022/11/2743（二）建立細(xì)胞系（株）的要求八、細(xì)胞系（株）的建立2022/1、組織來源：所屬物種（人或動物）、性別、年齡、所取的器官組織等。如系腫瘤組織，應(yīng)說明臨床和病理診斷、以及病理號。2、細(xì)胞生物學(xué)檢測：如：細(xì)胞的一般形態(tài)、特異結(jié)構(gòu)、細(xì)胞生長曲線、分裂指數(shù)、倍增指數(shù)、接種率等。如為腫瘤細(xì)胞，應(yīng)力求說明細(xì)胞確系來源于腫瘤組織。3、培養(yǎng)條件和方法：指明使用的培養(yǎng)基、血清種類、用量以及細(xì)胞生存的適宜PH值。八、細(xì)胞系（株）的建立2022/11/27441、組織來源：八、細(xì)胞系（株）的建立2022/11/2744再見2022/11/2745再見2022/11/2745組織培養(yǎng)細(xì)胞的生物學(xué)第二章組織培養(yǎng)細(xì)胞的生物學(xué)第二章Contents細(xì)胞生存環(huán)境和代謝附著底物人工培養(yǎng)基教學(xué)內(nèi)容1235體內(nèi)、外細(xì)胞的差異和分化體外培養(yǎng)細(xì)胞的分型細(xì)胞相互關(guān)系細(xì)胞系（株）的建立87643組織培養(yǎng)細(xì)胞的生長和增殖過程2022/11/2747Contents細(xì)胞生存環(huán)境和代謝附著底物人工培養(yǎng)基教學(xué)內(nèi)容在個體發(fā)生過程中，細(xì)胞通過不斷的生長和繁殖，數(shù)量增多，與此同時發(fā)生著分化。分化：及細(xì)胞在形態(tài)和功能上由一般發(fā)展到特殊的過程，由于分化的結(jié)果，形成了各種組織和器官。一、體內(nèi)、外細(xì)胞的差異和分化2022/11/2748在個體發(fā)生過程中，細(xì)胞通過不斷的生長和繁殖，數(shù)量增多，因模擬的培養(yǎng)條件與體內(nèi)實際情況仍有很大差異，易發(fā)生以下變化：分化現(xiàn)象減少，形態(tài)和功能趨于單一，生存一定時間后衰退死亡或發(fā)生轉(zhuǎn)化，變成有無限生長能力的連續(xù)細(xì)胞系或惡性細(xì)胞系。如：腺細(xì)胞分泌機(jī)能喪失，肌細(xì)胞纖維細(xì)胞化。原因：細(xì)胞在人工培養(yǎng)以后，可能導(dǎo)致很多基因關(guān)閉，而導(dǎo)致分化停止、功能喪失。可以利用這一點(diǎn)，來研究基因表達(dá)和調(diào)控。（一）差異2022/11/2749因模擬的培養(yǎng)條件與體內(nèi)實際情況仍有很大差異，易發(fā)生以下變化：體外培養(yǎng)細(xì)胞分化能力并未完全喪失，只是因環(huán)境改變其分化表現(xiàn)和原體內(nèi)不同。如：體內(nèi)：成纖維細(xì)胞、骨細(xì)胞→膠原體外：成纖維細(xì)胞、上皮細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞→膠原。如何揭示細(xì)胞分化的條件，闡明分化調(diào)控的機(jī)制是主要的。（二）分化2022/11/2750體外培養(yǎng)細(xì)胞分化能力并未完全喪失，只是因環(huán)境改變其分化表現(xiàn)和據(jù)能否貼附在支持物上生長的性質(zhì)，分：2、懸浮型(ES細(xì)胞，老鼠，初生培養(yǎng)；熒光，DAPI染色劑)1、貼附型(心肌細(xì)胞，老鼠，初生培養(yǎng))二、體外培養(yǎng)細(xì)胞的分型2022/11/2751據(jù)能否貼附在支持物上生長的性質(zhì)，分：2、懸浮型(ES細(xì)胞，老培養(yǎng)時能貼附在支持物上生長，大多數(shù)細(xì)胞呈貼附型生長。特點(diǎn)：1、分化現(xiàn)象變得不顯著，易失去它們在體內(nèi)時的原有特征。2、形態(tài)上常表現(xiàn)單一化的現(xiàn)象，并常反映其胚層起源，類似所謂“返祖”現(xiàn)象。如：起源于內(nèi)、外胚層的細(xì)胞多呈上皮型。

中胚層------------------呈成纖維細(xì)胞型。體外培養(yǎng)細(xì)胞的形態(tài)常表現(xiàn)有一般化的傾向。因此，判定細(xì)胞形態(tài)很難按體內(nèi)細(xì)胞標(biāo)準(zhǔn)確定，僅大致分成以下幾類：（一）貼附型2022/11/2752培養(yǎng)時能貼附在支持物上生長，大多數(shù)細(xì)胞呈貼附型生長。（一）貼與體內(nèi)成纖維細(xì)胞的形態(tài)相似而得名。心肌、平滑肌、成骨細(xì)胞、血管內(nèi)皮（中胚層間充質(zhì)起源）都呈此形態(tài)。成纖維細(xì)胞型1、成纖維細(xì)胞型2022/11/2753與體內(nèi)成纖維細(xì)胞的形態(tài)相似而得名。心肌、平滑肌、成骨細(xì)

起源于內(nèi)、外胚層細(xì)胞。如：皮膚表皮，消化管上皮、肝、胰、肺泡上皮等。

上皮細(xì)胞型2、上皮細(xì)胞型2022/11/2754起源于內(nèi)、外胚層細(xì)胞。上皮細(xì)胞型2、上皮細(xì)胞型2022/此型不穩(wěn)定，有時難與其它細(xì)胞相區(qū)別。游走細(xì)胞型3、游走細(xì)胞型2022/11/2755此型不穩(wěn)定，有時難與其它細(xì)胞相區(qū)別。游走細(xì)胞型3、游走細(xì)胞型除上述三型外，其它難以確定它們規(guī)律和形態(tài)的，統(tǒng)歸為“多形細(xì)胞型”。如：神經(jīng)組織的細(xì)胞。多型細(xì)胞型4、多形細(xì)胞型2022/11/2756除上述三型外，其它難以確定它們規(guī)律和形態(tài)的，統(tǒng)歸為“多形細(xì)培養(yǎng)細(xì)胞的形態(tài)受多種因素的影響，如：溫度，二氧化碳，酸、堿、密度等。如：Hela細(xì)胞，本屬上皮型，但過酸、過堿變成梭形。上皮細(xì)胞數(shù)量少時，呈星形或三角形。數(shù)量多時，呈上皮型。它來源于美國的HelenLane，她1951年死于子宮頸癌2022/11/2757培養(yǎng)細(xì)胞的形態(tài)受多種因素的影響，它來源于美國的Hele培養(yǎng)時，不貼附與支持物上，而呈懸浮狀態(tài)生長。如：某些癌細(xì)胞、白細(xì)胞。其優(yōu)點(diǎn)：細(xì)胞生存空間大，容許長時間生長，能繁殖多量細(xì)胞，便于做細(xì)胞代謝研究。S180細(xì)胞（二）懸浮型2022/11/2758培養(yǎng)時，不貼附與支持物上，而呈懸浮狀態(tài)生長。S180細(xì)胞（二體外培養(yǎng)細(xì)胞的生存空間和營養(yǎng)是有限的，當(dāng)細(xì)胞增殖達(dá)到一定密度后，需要分離出一部分細(xì)胞和更新營養(yǎng)液。這一過程稱“傳代”。每次傳代都要影響細(xì)胞生長過程。另外，體外生存期一般也不是無限的。（一）組織培養(yǎng)細(xì)胞生命期（二）組織培養(yǎng)細(xì)胞一代生長過程（三）細(xì)胞周期三、組織培養(yǎng)細(xì)胞的生長和增殖過程2022/11/2759體外培養(yǎng)細(xì)胞的生存空間和營養(yǎng)是有限的，當(dāng)細(xì)胞增殖培養(yǎng)細(xì)胞生命期，是指細(xì)胞在培養(yǎng)中持續(xù)增殖和生長的時間。體內(nèi)組織細(xì)胞的生存期與完整機(jī)體的死亡衰老基本相一致。大多生存一年左右，傳30~50代，相當(dāng)150~300個細(xì)胞周期，在全生存過程中大致經(jīng)歷以下三個階段：1、第I期-----原代培養(yǎng)期（初代培養(yǎng)期）從體內(nèi)取出組織接種培養(yǎng)到第一次傳代階段，約1~4周。與體內(nèi)細(xì)胞性狀相似，適宜進(jìn)行疫苗制備、藥物測試、移植等。為保持二倍體體細(xì)胞性質(zhì)，應(yīng)在初代或傳代后早期冰凍。（一）組織培養(yǎng)細(xì)胞生命期2022/11/2760培養(yǎng)細(xì)胞生命期，是指細(xì)胞在培養(yǎng)中持續(xù)增殖和生長的時間。體2、第II期----傳代期初代培養(yǎng)細(xì)胞一經(jīng)傳代后，便稱做“細(xì)胞系”。此期，是生命期中持續(xù)時間最長、細(xì)胞增殖旺盛，呈二倍體核型的細(xì)胞系稱“二倍體細(xì)胞系”3、第III期-----衰退期細(xì)胞仍然生存，但不增殖或增殖很慢，細(xì)胞形態(tài)輪廓增強(qiáng)，最后衰退死亡。在細(xì)胞生命期階段，少數(shù)情況下，在不明原因的影響，細(xì)胞可能發(fā)生自發(fā)轉(zhuǎn)化。標(biāo)志之一，是細(xì)胞獲得不死性即持久性增殖能力，這樣的細(xì)胞群體稱“無限細(xì)胞系”。主要發(fā)生在II期，核型大多變成異倍體，轉(zhuǎn)化后的細(xì)胞可能具有惡性性質(zhì)，也可能僅有不死性而無惡性。（一）組織培養(yǎng)細(xì)胞生命期2022/11/27612、第II期----傳代期（一）組織培養(yǎng)細(xì)胞生命期2022初代培養(yǎng)有限細(xì)胞系

無限細(xì)胞系接種培養(yǎng)第一次傳代傳代傳代間隔老化死亡轉(zhuǎn)化指數(shù)細(xì)胞數(shù)量02468101216周22201816141210862022/11/2762初代培養(yǎng)有限細(xì)胞系所有體外培養(yǎng)細(xì)胞，包括初代培養(yǎng)及各種細(xì)胞系，當(dāng)生長達(dá)到一定密度后，都需做傳代處理。傳代的頻率或間隔與接種數(shù)量、細(xì)胞生物學(xué)性狀以及營養(yǎng)液的性質(zhì)等有關(guān)。細(xì)胞的“一代”僅指從細(xì)胞接種到分離再培養(yǎng)時的一段時間。如：某一細(xì)胞系為第153代細(xì)胞，即指該細(xì)胞系已傳代153次。它與細(xì)胞世代或倍增不同。在細(xì)胞一代中，細(xì)胞能倍增3~6次（二）組織培養(yǎng)細(xì)胞一代生長過程2022/11/2763所有體外培養(yǎng)細(xì)胞，包括初代培養(yǎng)及各種細(xì)胞系，當(dāng)生長達(dá)到一細(xì)胞傳一代后，一般要經(jīng)過以下幾個階段：1、游離期（懸浮期）2、貼壁期3、潛伏期4、指數(shù)生長期5、停止期（二）組織培養(yǎng)細(xì)胞一代生長過程來源：人體腎臟

形態(tài)：上皮細(xì)胞

生長特性：貼壁

注釋：該細(xì)胞含腺病毒5DNA

2022/11/2764細(xì)胞傳一代后，一般要經(jīng)過以下幾個階段：（二）組織培養(yǎng)細(xì)胞一代1、游離期（懸浮期）細(xì)胞接種后，在培養(yǎng)液中呈懸浮狀態(tài)的階段，細(xì)胞胞質(zhì)回縮，胞體變成圓形。（二）組織培養(yǎng)細(xì)胞一代生長過程2022/11/27651、游離期（懸浮期）（二）組織培養(yǎng)細(xì)胞一代生長過程2022/2、貼壁期：細(xì)胞附著于支持物上。原代細(xì)胞：24h內(nèi)貼壁。連續(xù)細(xì)胞系：5~30分鐘貼壁。單個細(xì)胞快于細(xì)胞團(tuán)、組織塊。貼壁與許多因素有關(guān)：培養(yǎng)基的酸度、污染，膠塞和培養(yǎng)器皿的清潔度，細(xì)胞本身的活性等等。血清中有許多促使細(xì)胞貼壁的冷析球蛋白（CIG）和纖粘素（FN）CIG與多聚賴氨酸聯(lián)用，有利于細(xì)胞迅速貼壁。貼壁后細(xì)胞變成放射延展細(xì)胞→極性細(xì)胞再經(jīng)過一個潛伏期階段后，才進(jìn)入生長期。細(xì)胞的貼壁和延展（二）組織培養(yǎng)細(xì)胞一代生長過程2022/11/27662、貼壁期：細(xì)胞的貼壁和延展（二）組織培養(yǎng)細(xì)胞一代生長過程23、潛伏期：此時，細(xì)胞有生長活動，而無細(xì)胞分裂。原代細(xì)胞潛伏期：24~96h或更長。連續(xù)細(xì)胞系、腫瘤細(xì)胞潛伏期短：僅6~24h。

潛伏期后，細(xì)胞分裂出現(xiàn)，并逐漸增多，進(jìn)入指數(shù)生長期。（二）組織培養(yǎng)細(xì)胞一代生長過程2022/11/27673、潛伏期：（二）組織培養(yǎng)細(xì)胞一代生長過程2022/11/24、指數(shù)生長期（對數(shù)生長期）此時期，細(xì)胞增殖旺盛，細(xì)胞數(shù)成倍增長，活力最佳，最適合進(jìn)行實驗研究。此階段可用細(xì)胞群體倍增時間、細(xì)胞分裂指數(shù)（MI）等來判斷。MI：細(xì)胞群中每1000個細(xì)胞中的分裂細(xì)0.2~0.5%，連續(xù)細(xì)胞系、腫瘤細(xì)胞的MI可高達(dá)3~5%。持續(xù)3~5天，細(xì)胞數(shù)量增多，最后生長面積消失，細(xì)胞相互接觸連接成片。此時，細(xì)胞由于相互接觸而發(fā)生“接觸抑制”。表現(xiàn)為細(xì)胞擴(kuò)展運(yùn)動停止。保證細(xì)胞不重疊生長。腫瘤細(xì)胞無接觸抑制特征，能相互重疊，向三維空間發(fā)展，只要原因充分，細(xì)胞仍能分裂、增多。正常細(xì)胞生長匯合成單層時，細(xì)胞達(dá)到一定密度，細(xì)胞停止分裂，這種現(xiàn)象稱“密度抑制”。導(dǎo)致細(xì)胞停止分裂。（二）組織培養(yǎng)細(xì)胞一代生長過程2022/11/27684、指數(shù)生長期（對數(shù)生長期）（二）組織培養(yǎng)細(xì)胞一代生長過程25、停止期：

數(shù)量已達(dá)飽和，停止增殖，但仍有代謝活動，營養(yǎng)枯竭，代謝產(chǎn)物積累，PH降低，細(xì)胞會中毒。通常，細(xì)胞長滿瓶底80%時即傳代，接種到2~3個新瓶中。（二）組織培養(yǎng)細(xì)胞一代生長過程2022/11/27695、停止期：（二）組織培養(yǎng)細(xì)胞一代生長過程2022/11/22022/11/27702022/11/2725是指細(xì)胞每一次增殖所經(jīng)歷的全過程。每經(jīng)過一個增殖周期，數(shù)量就增加一倍。據(jù)細(xì)胞周期不同時期的生化特點(diǎn)，可劃分為四個連續(xù)的時期：

G1期（DNA合成前期）細(xì)胞間期S期（DNA合成期）主要是DNA的復(fù)制。

G2期（DNA合成后期）

M期（有絲分裂期）：完成染色體的分配。細(xì)胞完成一次細(xì)胞周期所需要的時間稱為-----------“細(xì)胞周期時間”。（三）細(xì)胞周期2022/11/2771是指細(xì)胞每一次增殖所經(jīng)歷的全過程。（三）細(xì)胞周期2022/1

S期：DNA合成期間期：是細(xì)胞代謝、DNA復(fù)制旺盛時期。

G1、G2：兩個間隙有絲分裂：細(xì)胞核及其染色體分裂。細(xì)胞分裂期：胞質(zhì)分裂：細(xì)胞質(zhì)分裂成兩個子細(xì)胞。2022/11/2772

有絲分裂過程2022/11/2773有絲分裂過程2022/11/2728細(xì)胞生長的速度與細(xì)胞周期時間有關(guān)。正常細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞相比較，細(xì)胞周期時間大致相接近的。如：人的正常腸上皮細(xì)胞的細(xì)胞周期時間是：1~3天。人的結(jié)腸癌細(xì)胞的細(xì)胞周期時間是：2.5天。

急性白細(xì)胞的細(xì)胞周期時間是2~4天。正常白細(xì)胞的細(xì)胞周期時間是1天。所不同的是：正常細(xì)胞的增殖達(dá)到一定限度就停止了，而且增殖的細(xì)胞基本上相當(dāng)于丟失的細(xì)胞數(shù)，總數(shù)始終保持相對恒定。腫瘤細(xì)胞是以持續(xù)的無限制增殖、永不停止。一般說來，哺乳動物的細(xì)胞周期為10~30h，其中間期約10h。（三）細(xì)胞周期2022/11/2774細(xì)胞生長的速度與細(xì)胞周期時間有關(guān)。（三）細(xì)胞周期2022/1在體外培養(yǎng)中，單個細(xì)胞也能生存和生長，有很大的獨(dú)立性，但不是細(xì)胞永久存在的形式，不能長期生存，只有群體細(xì)胞才是細(xì)胞的基本存在形式。體外培養(yǎng)細(xì)胞間仍具有形態(tài)和功能的相互依存關(guān)系，細(xì)胞上仍有橋粒、縫隙連接，一旦兩相鄰細(xì)胞發(fā)生接觸，便呈接觸抑制現(xiàn)象，導(dǎo)致運(yùn)動停止。四、細(xì)胞相互關(guān)系2022/11/2775在體外培養(yǎng)中，單個細(xì)胞也能生存和生長，有很大的獨(dú)立性，無污染環(huán)境溫度氣體環(huán)境和氫離子濃度基本營養(yǎng)物質(zhì)促生長因子、激素滲透壓五、細(xì)胞生存環(huán)境和代謝2022/11/2776無污染環(huán)境五、細(xì)胞生存環(huán)境和代謝2022/11/2731（一）無污染環(huán)境

無菌、無毒是保證細(xì)胞生存的首要條件。（二）溫度：35~370C39~400C中1h，有一定損傷，但仍可以恢復(fù)。41~420C中1h，細(xì)胞嚴(yán)重?fù)p傷，但不致全部殺死，仍有可能恢復(fù)。430C時，很多細(xì)胞被殺死。溫度>00C：能抑制細(xì)胞代謝，并無傷害作用。

40C數(shù)小時→370C培養(yǎng)，細(xì)胞仍能生長。

溫度降至冰點(diǎn)以下，細(xì)胞可因胞質(zhì)結(jié)冰而死亡。

在培養(yǎng)液中加一定量保護(hù)劑（二甲基亞砜或甘油），封入安瓿中后，凍于液氮中，-1960C，能長期貯存，解凍后細(xì)胞復(fù)蘇，仍能繼續(xù)生長，細(xì)胞的生物性狀不受任何影響，此為細(xì)胞保存的主要手段。五、細(xì)胞生存環(huán)境和代謝2022/11/2777（一）無污染環(huán)境五、細(xì)胞生存環(huán)境和代謝2022/11/273（三）氣體環(huán)境和氫離子濃度所需氣體主要有O2，CO2。1、O2：參與三羧酸循環(huán)，供能。缺O(jiān)2，多數(shù)不能生長。一般，95%空氣加5%CO2混合氣體。O2分壓太高，對細(xì)胞也有毒害作用。2、CO2：既是細(xì)胞代謝產(chǎn)物，也是細(xì)胞所需成分，與維持培養(yǎng)液的PH有直接關(guān)系。大多數(shù)細(xì)胞PH7.2~7.4，但各種細(xì)胞對PH的要求也不完全相同。原代細(xì)胞一般對PH變動耐受性差，無限細(xì)胞系耐受性強(qiáng)。總的來說，細(xì)胞耐酸性比耐堿性大一些，在偏酸中更有利于生長。如：原代羊水細(xì)胞，PH6.8時最適。五、細(xì)胞生存環(huán)境和代謝2022/11/2778（三）氣體環(huán)境和氫離子濃度五、細(xì)胞生存環(huán)境和代謝2022/1細(xì)胞在生長過程中，不斷釋放CO2，培養(yǎng)液變酸，為維持培養(yǎng)液中PH的恒定，最常用的方法是加磷酸鹽緩沖劑

其中，NaHCO3CO2能調(diào)節(jié)CO2的含量。NaHCO3+H2O→Na+HCO3-+H2O→Na++H2CO3+OH-→Na++OH-+H2O+CO2↑。CO2易于逸出，只適用于封閉式培養(yǎng)。開瓶培養(yǎng)時，需在5%CO2

氣體環(huán)境中（CO2

培養(yǎng)箱）。為克服NaHCO3的缺點(diǎn)，也可用Hepes（羥乙基派嗪乙硫磺酸）它對細(xì)胞無毒性，是具有較強(qiáng)緩沖能力的氫離子緩沖劑。主要能穩(wěn)定和抵抗快速PH變化。其最大優(yōu)點(diǎn)：開瓶通氣觀察也能維持PH值。五、細(xì)胞生存環(huán)境和代謝2022/11/2779細(xì)胞在生長過程中，不斷釋放CO2，培養(yǎng)液變酸，為維持培養(yǎng)液中（四）基本營養(yǎng)物質(zhì)1、糖：葡萄糖、核糖、丙酮酸。2、12種基本氨基酸：精氨酸、胱氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、賴氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、蘇氨酸、色氨酸、組氨酸、酪氨酸、纈氨酸。谷氨酰胺：作為氮源、碳源，能促進(jìn)各種氨基酸進(jìn)入細(xì)胞。3、維生素：VitA、D、E、K、B族、C。4、無機(jī)鹽：Fe++、Zn++、Cu++。五、細(xì)胞生存環(huán)境和代謝2022/11/2780（四）基本營養(yǎng)物質(zhì)五、細(xì)胞生存環(huán)境和代謝2022/11/27（五）促生長因子、激素如：胰島素-------促進(jìn)葡萄糖、氨基酸的吸收。氫