微生物實(shí)驗(yàn)教案05(5)廈門大學(xué)微生物考研微生物實(shí)驗(yàn)教案05(5)廈門大學(xué)微生物考研微生物實(shí)驗(yàn)教案05(5)廈門大學(xué)微生物考研V:1.0精細(xì)整理，僅供參考微生物實(shí)驗(yàn)教案05(5)廈門大學(xué)微生物考研日期：20xx年X月實(shí)驗(yàn)一光學(xué)顯微鏡----油鏡的使用

一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?復(fù)習(xí)顯微鏡低倍鏡和高倍鏡的使用技術(shù)2了解油浸系物鏡的基本原理，掌握油浸系物鏡的使用方法。二、實(shí)驗(yàn)材料和用具細(xì)菌三型的染色裝片、香柏油、二甲苯、顯微鏡、擦鏡紙。三、操作步驟(一)觀察前的準(zhǔn)備1．將顯微鏡置于平穩(wěn)的實(shí)驗(yàn)臺(tái)上。2．調(diào)節(jié)光源。(二)低倍鏡觀察染色裝片首先上升鏡簡，將枯草芽孢桿菌染色裝片置于載物臺(tái)上，用標(biāo)本夾夾住，將觀察位置移至物鏡正下方，物鏡降至距裝片處，適當(dāng)縮小光圈然后兩眼從目鏡觀察，轉(zhuǎn)動(dòng)粗調(diào)節(jié)器使物鏡逐漸上升(或使鏡臺(tái)下降)至發(fā)現(xiàn)物像時(shí)，改用細(xì)調(diào)節(jié)器調(diào)節(jié)到物像清楚為止。移動(dòng)裝片，把合適的觀察部位移至視野中心。(三)高倍鏡觀察眼睛離開目鏡從側(cè)面觀察，旋轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)換器，將高倍鏡轉(zhuǎn)至正下方，注意避免鏡頭與玻片相懂。再由目鏡觀察，仔細(xì)調(diào)節(jié)光圈，使光線的明亮度適宜。用細(xì)調(diào)節(jié)器校正焦距使物鏡清晰為止。將最適宜觀察部位移至視野中心，繪圖。不要移動(dòng)裝片位置，準(zhǔn)備用油鏡觀察。(四)油鏡觀察1．提起鏡筒約2cm，將油鏡轉(zhuǎn)至正下方。在玻片標(biāo)本的鏡檢部位(鏡頭的正下方)滴一滴香柏油。2．從側(cè)面注視，小心慢慢降下鏡筒，使油鏡浸在油中至油圈不擴(kuò)大為止，鏡頭幾乎與裝片接觸，但不可壓及裝片，以免壓碎玻片，損壞鏡頭。3．將光線調(diào)亮，左眼從目鏡觀察，用粗調(diào)節(jié)器將鏡筒徐徐上升(切忌反方向旋轉(zhuǎn))，當(dāng)視野中有物像出現(xiàn)時(shí)，再用細(xì)調(diào)節(jié)器校正焦距。如因鏡頭下降未到位或鏡頭上升太快末找到物像，必須再從側(cè)面觀察，將油鏡降下，重復(fù)操作直至物像看清為止。仔細(xì)觀察并繪圖。4．再次觀察提起鏡筒，換上金黃色葡萄球菌染色裝片，依次用低倍鏡、高倍鏡和油鏡觀察，繪圖。重復(fù)觀察時(shí)可比第一次少加香柏油。(五)鏡檢完畢后的工作1．移開物鏡鏡頭。2．取出裝片。3．清潔油鏡。4．擦凈顯微鏡，將各部分還原。四、注意事項(xiàng)1．使用油鏡必須按先用低倍鏡和高倍鏡觀察，再用油鏡觀察。2．下降鏡頭時(shí)，一定要從側(cè)面注視，切忌用眼睛對(duì)著目鏡，邊觀察邊下降鏡頭的錯(cuò)誤操作，以免壓碎玻片而損壞鏡頭。3．使用二甲苯擦鏡頭時(shí)，注意二甲苯不能過多，以防溶解固定透鏡的樹脂。4．注意保持顯微鏡的潔凈，對(duì)金屬部分要用軟布擦拭，擦鏡頭必須用擦鏡紙，切勿用手或用普通布、紙等，以免損壞鏡頭。五、實(shí)驗(yàn)報(bào)告1．繪制油鏡下的細(xì)菌三型圖。2．使用油鏡應(yīng)特別注意哪些問題3．當(dāng)物鏡從低倍鏡轉(zhuǎn)到高倍鏡和油鏡時(shí)，對(duì)照明度有何要求應(yīng)如何調(diào)節(jié)實(shí)驗(yàn)二培養(yǎng)基的配制

一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?學(xué)習(xí)和掌握配制培養(yǎng)基的一般方法和步驟。2明確培養(yǎng)基的配制原理。二、實(shí)驗(yàn)材料和用具牛肉膏、蛋白胨、瓊脂、1mol/LNaOH、lmol/LHCl、NaCl。試管、三角瓶、燒杯、量筒、玻璃棒、天平、牛角匙、pH試紙、棉花、牛皮紙、記號(hào)筆、線繩、紗布、漏斗、漏斗架、膠管、止水夾等。三、操作步驟牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基的配制，其配方如下：牛肉膏3g，蛋白胨10g，NaCl5g，瓊脂15～20g，水1000mL，PH～1．稱藥品按實(shí)際用量計(jì)算后，按配方稱取各種藥品放入大燒杯中。牛肉膏可放在小燒杯或表面皿中稱量，用熱水溶解后倒入大燒杯；也可放在稱量紙上稱量，隨后放入熱水中，牛肉膏使與稱量紙分離，立即取出紙片。蛋白胨極易吸潮，故稱量時(shí)要迅速。2．加熱溶解此過程中，需不斷攪拌，以防瓊脂糊底或溢出，最后補(bǔ)足所失的水分。3．調(diào)pH檢測培養(yǎng)基的pH，若pH偏酸，可滴加lmol/LNaOH，邊加邊攪拌，并隨時(shí)用pH試紙檢測，直至達(dá)到所需pH范圍。若偏堿，則用lmol/LHCl進(jìn)行調(diào)節(jié)。pH的調(diào)節(jié)通常放在加瓊脂之前。應(yīng)注意pH值不要調(diào)過頭，以免回調(diào)而影響培養(yǎng)基內(nèi)各離子的濃度。4．過濾液體培養(yǎng)基可用濾紙過濾，固體培養(yǎng)基可用4層紗布趁熱過濾，以利培養(yǎng)的觀察。但是供一般使用的培養(yǎng)基，這步可省略。5．分裝按實(shí)驗(yàn)要求，可將配制的培養(yǎng)基分裝入試管或三角瓶內(nèi)。分裝時(shí)可用漏斗以免使培養(yǎng)基沾在管口或瓶口上而造成污染。分裝量：固體培養(yǎng)基約為試管高度的l/5，滅菌后制成斜面。分裝入三角瓶內(nèi)以不超過其容積的一半為宜。半固體培養(yǎng)基以試管高度的1/3為宜，滅菌后垂直待凝。6．加棉塞試管口和三角瓶口塞上用普通棉花(非脫脂棉)制作的棉塞。棉塞的形狀、大小和松緊度要合適，四周緊貼管壁，不留縫隙，才能起到防止雜菌侵入和有利通氣的作用。要使棉塞總長約3/5塞入試管口或瓶口內(nèi)，以防棉塞脫落。有些微生物需要更好的通氣，則可用8層紗布制成通氣塞。有時(shí)也可用試管帽或塑料塞代替棉塞。7．包扎加塞后，將三角瓶的棉塞外包一層牛皮紙或雙層報(bào)紙，以防滅菌時(shí)冷凝水沾濕棉塞。若培養(yǎng)基分裝于試管中，則應(yīng)以5支或7支在一起，再于棉塞外包一層牛皮紙，用繩扎好。然后用記號(hào)筆注明、培養(yǎng)基名稱、組別、日期。8．滅菌9．?dāng)[斜面滅菌后，擺斜面，便斜面的長度不超過試管總長的1/2。10．無菌檢查將滅菌的培養(yǎng)基放入37℃溫箱中培養(yǎng)24～48h，無菌生長即可使用，或貯存于冰箱或清潔的櫥內(nèi)，備用。四、注意事項(xiàng)稱藥品用的牛角匙不要混用，稱完藥品應(yīng)及時(shí)蓋緊瓶蓋。調(diào)pH時(shí)要小心操作，避免回調(diào)。不同培養(yǎng)基各有配制特點(diǎn)，要注意具體操作。五、實(shí)驗(yàn)報(bào)告1記錄本實(shí)驗(yàn)配制培養(yǎng)基的名稱、數(shù)量。2．配制培養(yǎng)基有哪幾個(gè)步驟在操作過程中應(yīng)注意些什么問題為什么3．培養(yǎng)基配制完成后，為什么必須立即滅菌若不能及時(shí)滅菌應(yīng)如何處理已滅菌的培養(yǎng)基如何進(jìn)行無菌檢查實(shí)驗(yàn)三高壓蒸汽滅菌一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?．了解高壓蒸汽滅菌的基本原理及應(yīng)用范圍。2．學(xué)習(xí)高壓蒸汽滅菌的操作方法。二、實(shí)驗(yàn)器材牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基，培養(yǎng)皿(6套一包)，立式高壓蒸汽滅菌鍋等。三、操作步驟1．首先將內(nèi)層鍋取出，再向外層鍋內(nèi)加入適量的水，使水面與三角擱架相平為宜。切勿忘記加水，同時(shí)水量不可過少，以防滅菌鍋燒干而引起炸裂事故。2．放回內(nèi)層鍋，并裝入待滅菌物品。注意不要裝得太擠，以免防礙蒸汽流通而影響滅菌效果。三角燒瓶與試管口端均不要與鍋壁接觸，以免冷凝水淋濕包口的紙而透入棉塞。3．加蓋，并將蓋上的排氣軟管插入內(nèi)層鍋的排氣槽內(nèi)。再以兩兩對(duì)稱的方式同時(shí)旋緊相對(duì)的兩個(gè)螺栓，使螺栓松緊一致，勿使漏氣。4．用電爐或煤氣加熱，并同時(shí)打開排氣閥，使水沸騰以排除鍋內(nèi)的冷空氣。待冷空氣完全排盡后，關(guān)上排氣閥，讓鍋內(nèi)的溫度隨蒸汽壓力增加到逐漸上升。當(dāng)鍋內(nèi)壓力升到所需壓力時(shí)，控制熱源，維持壓力至所需時(shí)間。本實(shí)驗(yàn)用，℃，20min滅菌。滅菌的主要因素是溫度而不是壓力。因此鍋內(nèi)冷空氣必須完全排盡后，才能關(guān)上排氣閥，維持所需壓力。5．滅菌所需時(shí)間到后，切斷電源或關(guān)閉煤氣，讓滅菌鍋內(nèi)溫度自然下降，當(dāng)壓力表的壓力降至“0”時(shí)，打開排氣閥，旋松螺栓，打開蓋子，取出滅菌物品。壓力一定要降到“0”時(shí)，才能打開排氣閥，開蓋取物。否則就會(huì)因鍋內(nèi)壓力突然下降，使容器內(nèi)的培養(yǎng)基由于內(nèi)外壓力不平衡而沖出燒瓶口或試管口，造成棉塞沾染培養(yǎng)基而發(fā)生污染，甚至灼傷操作者。6．將取出的滅菌培養(yǎng)基，需擺斜面的則擺成斜面，然后放入37℃溫箱培養(yǎng)24h，經(jīng)檢查若無雜菌生長，即可待用。四、實(shí)驗(yàn)報(bào)告l．高壓蒸汽滅菌開始之前，為什么要將鍋內(nèi)冷空氣排盡滅菌完畢后，為什么待壓力降低“0”時(shí)才能打開排氣閥，開蓋取物2．在使用高壓蒸汽滅菌鍋滅菌時(shí)，怎樣杜絕一切不安全的因素3．滅菌在微生物實(shí)驗(yàn)操作中有何重要意義實(shí)驗(yàn)四細(xì)菌的革蘭氏染色

一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康恼莆占?xì)菌涂片方法及革蘭氏染色法步驟。二、實(shí)驗(yàn)材料和用具金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、大腸桿菌菌液，待測菌菌液1～2種。革蘭氏染色液(結(jié)晶紫染液、盧戈氏碘液、95%乙醇、石炭酸復(fù)紅液等)、香柏油、二甲苯；顯微鏡、擦鏡紙、接種環(huán)、載玻片、吸水紙、試管、小滴管、酒精燈。三、操作步驟(一)制片1．涂菌用無菌操作方法從試管中沾取菌液一環(huán)，用接種環(huán)在潔凈無脂的載玻片上做一薄而均勻、直徑約lcm的菌膜。涂菌后將接種環(huán)火焰滅菌。2．干燥于空氣中自然干燥。亦可把玻片置于火焰上部略加溫加速干燥(溫度不宜過高)。3．固定目的是殺死細(xì)菌并使細(xì)菌粘附在玻片上，便于染料著色，常用加熱法，即將細(xì)菌涂片膜向上，通過火焰3次，以熱而不燙為宜，防止菌體燒焦、變形。此制片可用于染色。(二)染色l．初染于制片上滴加結(jié)晶紫染液，染lmin后，用水洗去剩余染料。2．媒染滴加盧戈氏碘液，lmin后水洗。3．脫色滴加95%乙醇脫色，搖動(dòng)玻片至紫色不再為乙醇脫退為止(根據(jù)涂片之厚薄需時(shí)30s至lmin)，水洗。4．復(fù)染滴加石炭酸復(fù)紅液復(fù)染lmin，水洗。5．濾紙吸干，油鏡鏡檢。(三)結(jié)果革蘭氏陽性菌染成藍(lán)紫色，革蘭氏陰性菌染成淡紅色。四、注意事項(xiàng)1.涂片務(wù)求均勻，切忌過厚。2．在染色過程中，不可使染液干涸。3．脫色時(shí)間十分重要，過長，則脫色過度，會(huì)使陽性菌被染成陰性菌；脫色不夠，則會(huì)使陰性菌被染成陽性菌。4．老齡菌因體內(nèi)核酸減少，會(huì)便陽性菌被染成陰性菌，故不能選用。五、實(shí)驗(yàn)報(bào)吉(一)繪圖1．大腸桿菌革蘭氏染色視野圖。2．金黃色葡萄球菌或蘇云金桿菌革蘭氏染色視野圖。(二)問題和思考1．涂片后為什么要進(jìn)行固定固定時(shí)應(yīng)注意什么2．什么是革蘭氏染色法染色過程應(yīng)注意什么3.革蘭氏染色中哪一步是關(guān)鍵，為什么應(yīng)如何控制這一步實(shí)驗(yàn)五霉菌的形態(tài)觀察

一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康恼莆沼^察霉菌形態(tài)的基本方法，并觀察其形態(tài)特征。二、實(shí)驗(yàn)材料和用具產(chǎn)黃青霉(Penicfilliumchrysogenum)、黑曲霉(Aspergillusniger)、黑根霉(Rhizopusnigrians)、總狀毛霉(Mucorracemosus)等斜面菌種。半固體PDA培養(yǎng)基、乳酸苯酚固定液、棉藍(lán)染色液、20%甘油；培養(yǎng)皿、載玻片、U形玻棒擱架、蓋玻片、圓形濾紙片、細(xì)口滴管、鑷子、顯微鏡、接種環(huán)等。三、操作步驟(一)霉菌的載玻片濕室培養(yǎng)1．準(zhǔn)備濕室在培養(yǎng)皿底鋪一張圓形濾紙片，其上放一“冂”形載玻片擱架，在擱梁上放一塊載玻片和兩塊蓋玻片，蓋上皿蓋，外用紙包扎，經(jīng)12lC濕熱滅菌30min后，置60℃烘箱中烘干，備用。2．接種用接種環(huán)挑取少量待觀察的霉菌孢子至濕室內(nèi)的載玻片上，每張載玻片可接同一菌種的孢子兩處。接種時(shí)只要將帶菌的接種環(huán)在載玻片上輕輕碰幾下即可(務(wù)必記住接種的位置)。3．加培養(yǎng)基用無菌細(xì)口滴管吸取少量融化約60℃的培養(yǎng)基，滴加到載玻片的接種處，培養(yǎng)基應(yīng)滴得圓而薄，其直徑約為(滴加量一般以l/2小滴為宜)。4．加蓋玻片在培養(yǎng)基未徹底凝固前．用無菌鑷子將皿內(nèi)蓋玻片蓋在瓊脂塊薄層上，用鑷子輕壓，使蓋玻片和載玻片間的距離相當(dāng)接近，但不能壓扁，否則不透氣。5．倒保濕劑每皿倒大約3mL20%的無菌甘油，使皿內(nèi)的濾紙完全潤濕，以保持皿內(nèi)濕度，皿蓋上注明菌名、組別和接種日期。此為制成的載玻片濕室，置28℃恒溫培養(yǎng)3～5d。(二)黑根霉假根的培養(yǎng)將融化的PDA培養(yǎng)基，冷卻至50℃倒入無菌平皿，其量約為平皿高度的l/2。冷凝后，用接種環(huán)沾取根霉孢子，在平板表面劃線接種。然后將平皿倒置，在皿蓋內(nèi)放一無菌載玻片，于28℃培養(yǎng)2～3d后，可見根霉的氣生菌絲倒掛成胡須狀，有許多菌絲與載玻片接觸，并在載玻片上分化出假根和匍匐菌絲等結(jié)構(gòu)。(三)鏡檢觀察1．濕室培養(yǎng)霉菌鏡檢載玻片從培養(yǎng)16～20h開始，通過連續(xù)觀察，可了解孢子的萌發(fā)、菌絲體的生長分化和子實(shí)體的形成過程。將濕室內(nèi)的載玻片取出，直接置于低倍鏡和高倍鏡下觀察曲霉、青霉、毛霉、根霉等霉菌的形態(tài)，重點(diǎn)觀察菌絲是否分隔，曲霉和青霉的分生孢子形成特點(diǎn)，曲霉的足細(xì)胞，根霉和毛霉的孢子囊和孢囊孢子。繪圖。2．粘片觀察取一滴棉藍(lán)染色液置于載玻片中央，取一段透明膠帶，打開霉菌平板培養(yǎng)物，粘取菌體，粘面朝下，放在染液上。鏡檢。3．假根觀察用低倍鏡就能觀察到假根及從根節(jié)上分化出的孢子囊梗、孢子囊、孢囊孢子和兩個(gè)假根間的匍匐菌絲，觀察時(shí)注意調(diào)節(jié)焦距以看清各種構(gòu)造。4．制成永久裝片制備方法是，輕輕揭去蓋玻片，如果載玻片上有瓊脂，仔細(xì)挑去，然后滴加少量乳酸苯酚固定液，蓋上清潔蓋玻片，在蓋玻片四周滴加樹膠封固。四、實(shí)驗(yàn)報(bào)告(一)繪制鏡檢形態(tài)圖1．毛霉和根霉形態(tài)圖，示各部。2．青霉和曲霉形態(tài)圖，示各部（二）載玻片觀察記錄各菌種的載玻片標(biāo)本觀察結(jié)果：菌種菌絲體（氣生菌絲、營養(yǎng)菌絲的粗細(xì)、色澤、菌絲有隔或無隔等）無性孢子特征（孢子梗的分化特征，孢子著生特征等）其他特征結(jié)構(gòu)（有無假根、足細(xì)胞匍匐菌絲、囊軸等）實(shí)驗(yàn)六細(xì)菌大小的測定

一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康恼莆沼蔑@微測微尺測量微生物大小的基本方法。二、實(shí)驗(yàn)材料和用具釀酒酵母的玻片標(biāo)本；香柏油、二甲苯；顯微鏡、目鏡測微尺、鏡臺(tái)測微尺、擦鏡紙。三、操作步驟l．測微尺的構(gòu)造顯微鏡測微尺是由目鏡測微尺和鏡臺(tái)接物測微尺組成，目鏡測微尺是一塊圓形玻璃片，其中有精確的等分刻度，在5mm刻尺上分50份(圖14一lC)。目鏡測微尺每格實(shí)際代表的長度隨使用接目鏡和接物鏡的放大倍數(shù)而改變，因此在使用前必須用鏡臺(tái)測微尺進(jìn)行標(biāo)定。鏡臺(tái)測微尺為一專用中央有精確等分線的載玻片(圖14—1A)，一般將長為1mm的直線等分成100個(gè)小格，每格長即10μm，是專用于校正目鏡測微尺每格長度的。2．目鏡測微尺的標(biāo)定把目鏡的上透鏡旋開，將目鏡測微尺輕輕放在目鏡的隔板上，使有刻度的一面朝下。將鏡臺(tái)測微尺放在顯微鏡的載物臺(tái)上，使有刻度的一面朝上。先用低倍鏡觀察，調(diào)焦距，待看清鏡臺(tái)測微尺的刻度后，轉(zhuǎn)動(dòng)目鏡，使目鏡測微尺的刻度與鏡臺(tái)測微尺的刻度相平行，并使兩尺左邊的一條線重合，向右尋找另外一條兩尺相重合的直線(圖15—lB)。3．計(jì)算方法標(biāo)定公式：

目鏡測微尺每格長度（μm）=兩條重合線間鏡臺(tái)測微尺的格數(shù)×10÷兩條重合線間目鏡測微尺的格數(shù)

例如，目鏡測微尺20個(gè)小格等于鏡臺(tái)測微尺3小格，已知鏡臺(tái)測微尺每格為10μm，則3小格的長度為3×10=30μm，那么相應(yīng)地在目鏡測微尺上每小格長度為3×10÷20=μm。用以上計(jì)算方法分別校正低倍鏡、高倍鏡及油鏡下目鏡測微尺每格實(shí)際長度。4．菌體大小的測定將鏡臺(tái)測微尺取下，分別換上大腸桿菌及金黃色葡萄球菌玻片標(biāo)本，先在低倍鏡和高倍鏡下找到目的物，然后在油鏡下用目鏡測微尺測量菌體的大小。先量出菌體的長和寬占目鏡測微尺的格數(shù)，再以目鏡測微尺每格的長度計(jì)算出菌體的長和寬。并詳細(xì)記錄于表15—1中。例如，目鏡測微尺在這架顯微鏡下，每格相當(dāng)于μm，測量的結(jié)果，若菌體的平均長度相當(dāng)于目鏡測微尺的2格，則菌體長應(yīng)為3×μm=μm。一般測量菌體的大小，應(yīng)測定10～20個(gè)菌體，求出平均值，才能代表該菌的大小。四、注意事項(xiàng)1．鏡臺(tái)測微尺的玻片很薄，在標(biāo)定油鏡頭時(shí)，要格外注意，以免壓碎鏡臺(tái)測微尺或損壞鏡頭。2．標(biāo)定目鏡測微尺時(shí)要注意準(zhǔn)確對(duì)正目鏡測微尺與鏡臺(tái)測微尺的重合線。五、實(shí)驗(yàn)報(bào)告1．目鏡測微尺標(biāo)定結(jié)果：低倍鏡下倍目鏡測微尺每格長度是μm。高倍鏡下倍目鏡測微尺每格長度是μm。油鏡下倍目鏡測微尺每格長度是μm。2．菌體大小測定結(jié)果：菌號(hào)大腸桿菌測定結(jié)果金黃色葡萄球菌的直徑大小測定結(jié)果目鏡測微尺格數(shù)實(shí)際長度目鏡測微尺格數(shù)實(shí)際直徑/μm寬長寬長

實(shí)驗(yàn)七微生物數(shù)量的測定

一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?．了解血細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)的原理。2．掌握使用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板進(jìn)行微生物計(jì)數(shù)的方法。二、實(shí)驗(yàn)器材1．菌種釀酒酵母2．儀器或其他用具血細(xì)胞計(jì)數(shù)板，顯微鏡，蓋玻片，無菌毛細(xì)滴管。三、操作步驟l．菌懸液制備