實驗六 間隔法測定過氧化物酶的活力(原理清晰,步驟清楚)_第1頁
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實驗六 間隔法測定過氧化物酶的活力(原理清晰,步驟清楚)_第3頁
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文檔簡介

一目的掌握間隔法定過氧化物酶活力的原理及操作方法二原理過氧化物酶（peroxidase，POD，EC，催化

HO2

氧化某些酚類、芳香胺和抗壞血酸等還原性物質它廣泛分布于生物界在細胞代謝的氧化還原過程中起重要作用如清除細胞內的有害物質素的形成等。

HO保護酶蛋白以及促進植物細胞木質2本實驗以愈創木鄰甲氧基苯酚

HO2

為底物氧化物酶催化放出新生態氧無色的愈木酚化成紅棕色的四鄰甲氧基連酚應式如下：過氧化物酶活力的大小在一定范圍內與產物顏色的深淺呈線性關系，該產物在460nm有最大的光吸收故可通過測定

A

460

的變化來測定過氧化物酶的活力。這里規定，一個過氧化物酶活力單位為在室溫pH5.4的條件下，酶反應體系中每分鐘A的增加值為1所需的酶量。460活力測定時，酶反應在分光光度計的比色杯內進行，由于酶反應產物增加而使A460增加，通過定時間隔記錄可獲得一A值。以時間為橫坐標A460

460值為縱坐標進行線性作圖（或用統計方法得回歸方程），進而計算A460的變化速率（D

A

·min），最后計算每克鮮重樣品中過氧化物酶活力的大小。460

三實驗材料設備1.材料禾本科植物葉片2.儀器電子天平

高速冷凍離心機

分光光度計

冰浴3.器材刻度試管：10mL×1移液管：5mL×1微量進樣器：1000ml燒

杯：250mL×250mL×1離心管：7mL×1（帶蓋）滴

管：2洗耳球：2硫酸紙研缽、剪刀、洗瓶、試管架、移液管架、玻棒：各四試劑的配1.酶提取緩沖液50mmol/L、pH8.7硼酸-硼砂緩沖液，內5mmol/L亞硫酸氫鈉和1%聚乙烯吡咯烷酮(PVP)（臨用前加）。2.酶活力測定緩沖液0.1mol/L、pH5.4醋酸-醋酸鈉緩沖液3.愈創木液（0.25%W/V（溶于50%乙醇中）（臨用前配制）4.

H

溶液（0.75%）（臨用前配制）五操作步驟1.酶液的制備(1)取材：稱取左右葉片，記下實際質量g。(2)研磨：將樣品剪碎于研缽中，加入預冷的酶提取緩沖液，置冰浴上充分研磨。(3)離心漿液全部轉入塑料離心管℃下10,000g離15min。上清液全部倒入試管，此上清液即為粗酶液，待測。2.酶活力測定(1)將分光光度計預熱，波長定于460nm處。(2)在玻璃比色杯內，先加入醋酸-醋酸鈉緩沖液和1mL0.25%創

--木酚溶液，0.1mL0.75%HO

再加入或0.1mL酶（視酶活力大小而定最后加入溶液，用硫酸紙蓋住比色皿迅速顛倒混勻。(3)立即把比色杯插入比色架，關蓋。迅速把A調至0并開始記時，460每隔30秒讀取并記錄

A

460

值，共讀3分鐘。（注：酶液加入量一般控制5min內使

A

460

達到0.5～0.8宜）六結果處理1.以時間為橫坐標，A統計方法求回歸方程）；

460

值為縱坐標，對所得數據進行線性作圖（或用2.求出上圖中所作直線（或回歸方程）的斜率，即A·min-1，此460為反應的初速度；3.求出每克鮮重植物樣品中過氧化物酶的活力

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