實驗八蛋白質的表達、分離、純化和鑒定

(1)了解重組蛋白表達的方法和意義。

(2)了解親和層析分離純化的方法。實驗八蛋白質的表達、分離、純化和鑒定(1)了解重組蛋白實驗原理克隆基因在細胞中表達對理論研究和實驗應用都具有重要的意義。通過表達能探索和研究基因的功能以及基因表達調控的機理，同時克隆基因表達出所編碼的蛋白質可供作結構與功能的研究。大腸桿菌是目前應用最廣泛的蛋白質表達系統，其表達外源基因產物的水平遠高于其它基因表達系統，表達的目的蛋白量甚至能超過細菌總蛋白量的80%。實驗原理本實驗中，攜帶有目標蛋白基因的質粒在大腸桿菌BL21中，在37℃，IPTG誘導下，超量表達攜帶有6個連續組氨酸殘基的重組氯霉素酰基轉移酶蛋白，該蛋白可用一種通過共價偶連的次氨基三乙酸（NTA）使鎳離子（Ni2+）固相化的層析介質加以提純，實為金屬熬合親和層析（MCAC）。蛋白質的純化程度可通過聚丙烯酰胺凝膠電泳進行分析。本實驗中，攜帶有目標蛋白基因的質粒在大腸桿菌BL材料與試劑試劑[1]LB液體培養基：Trytone10g,yeastextract5g,NaCl10g,用蒸餾水配至1000mL.[2]氨芐青霉素：100mg/mL[3]上樣緩沖液(GLB)：100mMNaH2PO4,10mMTris,8MUrea,10mM2-ME,pH8.0[4]WashingBuffer（UWB）：100mMNaH2PO4,10mMTris,8MUrea,pH6.3[5]ElutionBuffer(洗脫):100mMNaH2PO4,10mMTris,8MUrea,500mMImidazole,pH8.0[6]IPTG材料與試劑試劑實驗步驟一、氯霉素酰基轉移酶重組蛋白的誘導1.接種含有重組氯霉素酰基轉移酶蛋白的大腸桿菌BL21菌株于5mLLB液體培養基中（含100ug/mL氨芐青霉素），37℃震蕩培養過夜。2.轉接1mL過夜培養物于100mL（含100ug/mL氨芐青霉素）LB液體培養基中，37℃震蕩培養至OD600=0.6-0.8。取10ul樣品用于SDS分析。3.加入IPTG至終濃度0.5mmol/l,37℃繼續培養1-3h.4.12，000rpm離心10min,棄上清，菌體沉淀保存于-20℃或-70℃冰箱中。實驗步驟一、氯霉素酰基轉移酶重組蛋白的誘導二、氯霉素酰基轉移酶重組蛋白的分離，純化1.重組蛋白的變性裂解：在冰浴中凍融50ml菌體沉淀，加入5mL上樣緩沖液GLB,用吸管抽吸重懸,4℃12000rpm離心30min,將上清（總蛋白細胞裂解液）吸至一個干凈的容器中，并棄沉淀。2.NTA層析柱的準備：在層析柱中加入1mLNTA介質，并分別用8mL去離子水，8mL上樣緩沖液GLB洗滌。(調速0.5ml/3分鐘)。3.細胞裂解液3mL以10-15mL/h流速上Ni2+-NTA柱，收集流出液。4.洗脫雜蛋白：用50mL洗滌緩沖液UWB以10-15mL/h流速洗柱，分別取10ul洗滌開始與結束時的樣品用于SDS分析。5.洗脫目標蛋白：用10mL洗脫緩沖液洗柱，每管0.5－1mL，共收集6－10管，分別取10ul樣品用于SDS分析。二、氯霉素酰基轉移酶重組蛋白的分離，純化1．裝配制膠用的玻璃板（由助教演示）。2．制分離膠：按所需的濃度配制12.5％分離膠。30%Acr-Bis

Tris-HClpH8.8

H2O10%APTEMED5ml3ml4ml120ul20ul

灌完分離膠后在膠面上小心加水封（注意不要沖壞膠面），等膠自然凝聚后（這時候在膠面與水封之間可以看見清晰的界限）1．裝配制膠用的玻璃板（由助教演示）。30%Acr-Bis3．制濃縮膠：按所需的濃度配制4%的濃縮膠，配方如下：30%Arc-Bis

Tris-HClpH6.7

H2O10%APTEMED400ul750ul1800ul50ul10ul3．制濃縮膠：按所需的濃度配制4%的濃縮膠，配方如下：30%4.灌完濃縮膠，插入梳子。等到濃縮膠自然凝聚后，將裝置放入電泳槽內,加入電泳緩沖液,小心地拔出梳子，如果拔出梳子后加樣孔之間的間隔發生扭曲，可以用注射器針頭小心地加以整理。

4.灌完濃縮膠，插入梳子。等到濃縮膠自然凝聚后，將裝置放入5．加樣：取大腸桿菌和BSA蛋白樣品加樣，每個加樣孔加樣不宜過多，一般每孔加樣10L。6．電泳：先恒壓80V，待樣品進入分離膠后，調電壓為120V（恒壓）。當溴酚藍移動到離底部約0.5cm時，停止電泳。5．加樣：取大腸桿菌和BSA蛋白樣品加樣，每個加樣孔加樣不宜7．翹開玻璃板，將濃縮膠切掉,剝下凝膠，準備染色。8．凝膠染色：使用考馬斯亮藍R250染色。兩塊膠（小盒子）或四塊膠（大盒子）同步染色脫色。蓋上蓋子用微波爐加熱約15-20秒，搖床振蕩15分鐘，回收染液至指定容器。清水漂洗后加入脫色液（25%乙醇，75%乙酸）脫色，用量和步驟與染色相同，脫色兩次，每次10分鐘。7．翹開玻璃板，將濃縮膠切掉,剝下凝膠，準備染色。注意事項(1)Acr和Bis均為神經毒劑，對皮膚有刺激作用，操作時應戴手套和口罩。

(2)玻璃板表面應光滑潔凈，否則在電泳時會造成凝膠板與玻璃板之間產生氣泡。

(3)樣品槽模板梳齒應平整光滑。

(4)灌凝膠時不能有氣泡，以免影響電泳時電流的通過。

(5)切勿破壞加樣凹槽底部的平整，以免電泳后區帶扭曲。（6）電泳時應選用合適的電流、電壓，過高或者過低都會影響電泳效果。

(7)稀釋5×SDS/電泳緩沖液至1×濃度灌入電泳槽，需800毫升。注意事項1.將紅色玻璃夾子底座朝下、卡口打開呈直角狀，放入厚薄兩片玻璃，薄玻璃朝向自己。注意厚玻璃箭頭向上，旁邊兩條小玻璃條與薄玻璃接觸，使之形成一個間隙。2.在平整的桌面上放下玻璃與夾子，使玻璃和夾子的底面完全對齊，向外扳動塑料卡口，關緊夾子。1.將紅色玻璃夾子底座朝下、卡口打開呈直角狀，放入厚薄兩片玻3.將做好的玻璃夾放在制膠架上，注意薄玻璃朝向自己，厚玻璃上的箭頭向上。按彈簧夾，將玻璃夾卡入制膠架。在玻璃的間隙內灌膠，放上梳子，待膠凝固。4.取出制好的玻璃（連帶膠），將玻璃放入電極架（卡在底面的卡口上），注意薄玻璃朝向電極架，厚玻璃的箭頭朝上，玻璃與紅色橡膠條必須完全緊貼。（需同時放置兩塊制好的膠，如只使用一塊則另一面須用提供的塑料板代替，注意塑料板上的提示，必須使塑料板與橡膠條完全緊貼。）正常安裝則會形成一個密閉的容器。3.將做好的玻璃夾放在制膠架上，注意薄玻璃朝向自己，厚玻璃上5.將底座的開關打開，并向外撥動透明的架子，使中間空隙增大，放入電極架。6.如圖所示將電極架往下壓（約1~2mm），使底面完全接觸。5.將底座的開關打開，并向外撥動透明的架子，使中間空隙增大，7.關上底座開關。8.放入電泳槽內，加上加樣架加樣。注意加樣架與剛才制膠所用的梳子齒數必須一致。7.關上底座開關。8.放入電泳槽內，加上加樣架加樣。注意加實驗八蛋白質的表達、分離、純化和鑒定

(1)了解重組蛋白表達的方法和意義。

(2)了解親和層析分離純化的方法。實驗八蛋白質的表達、分離、純化和鑒定(1)了解重組蛋白實驗原理克隆基因在細胞中表達對理論研究和實驗應用都具有重要的意義。通過表達能探索和研究基因的功能以及基因表達調控的機理，同時克隆基因表達出所編碼的蛋白質可供作結構與功能的研究。大腸桿菌是目前應用最廣泛的蛋白質表達系統，其表達外源基因產物的水平遠高于其它基因表達系統，表達的目的蛋白量甚至能超過細菌總蛋白量的80%。實驗原理本實驗中，攜帶有目標蛋白基因的質粒在大腸桿菌BL21中，在37℃，IPTG誘導下，超量表達攜帶有6個連續組氨酸殘基的重組氯霉素酰基轉移酶蛋白，該蛋白可用一種通過共價偶連的次氨基三乙酸（NTA）使鎳離子（Ni2+）固相化的層析介質加以提純，實為金屬熬合親和層析（MCAC）。蛋白質的純化程度可通過聚丙烯酰胺凝膠電泳進行分析。本實驗中，攜帶有目標蛋白基因的質粒在大腸桿菌BL材料與試劑試劑[1]LB液體培養基：Trytone10g,yeastextract5g,NaCl10g,用蒸餾水配至1000mL.[2]氨芐青霉素：100mg/mL[3]上樣緩沖液(GLB)：100mMNaH2PO4,10mMTris,8MUrea,10mM2-ME,pH8.0[4]WashingBuffer（UWB）：100mMNaH2PO4,10mMTris,8MUrea,pH6.3[5]ElutionBuffer(洗脫):100mMNaH2PO4,10mMTris,8MUrea,500mMImidazole,pH8.0[6]IPTG材料與試劑試劑實驗步驟一、氯霉素酰基轉移酶重組蛋白的誘導1.接種含有重組氯霉素酰基轉移酶蛋白的大腸桿菌BL21菌株于5mLLB液體培養基中（含100ug/mL氨芐青霉素），37℃震蕩培養過夜。2.轉接1mL過夜培養物于100mL（含100ug/mL氨芐青霉素）LB液體培養基中，37℃震蕩培養至OD600=0.6-0.8。取10ul樣品用于SDS分析。3.加入IPTG至終濃度0.5mmol/l,37℃繼續培養1-3h.4.12，000rpm離心10min,棄上清，菌體沉淀保存于-20℃或-70℃冰箱中。實驗步驟一、氯霉素酰基轉移酶重組蛋白的誘導二、氯霉素酰基轉移酶重組蛋白的分離，純化1.重組蛋白的變性裂解：在冰浴中凍融50ml菌體沉淀，加入5mL上樣緩沖液GLB,用吸管抽吸重懸,4℃12000rpm離心30min,將上清（總蛋白細胞裂解液）吸至一個干凈的容器中，并棄沉淀。2.NTA層析柱的準備：在層析柱中加入1mLNTA介質，并分別用8mL去離子水，8mL上樣緩沖液GLB洗滌。(調速0.5ml/3分鐘)。3.細胞裂解液3mL以10-15mL/h流速上Ni2+-NTA柱，收集流出液。4.洗脫雜蛋白：用50mL洗滌緩沖液UWB以10-15mL/h流速洗柱，分別取10ul洗滌開始與結束時的樣品用于SDS分析。5.洗脫目標蛋白：用10mL洗脫緩沖液洗柱，每管0.5－1mL，共收集6－10管，分別取10ul樣品用于SDS分析。二、氯霉素酰基轉移酶重組蛋白的分離，純化1．裝配制膠用的玻璃板（由助教演示）。2．制分離膠：按所需的濃度配制12.5％分離膠。30%Acr-Bis

Tris-HClpH8.8

H2O10%APTEMED5ml3ml4ml120ul20ul

灌完分離膠后在膠面上小心加水封（注意不要沖壞膠面），等膠自然凝聚后（這時候在膠面與水封之間可以看見清晰的界限）1．裝配制膠用的玻璃板（由助教演示）。30%Acr-Bis3．制濃縮膠：按所需的濃度配制4%的濃縮膠，配方如下：30%Arc-Bis

Tris-HClpH6.7

H2O10%APTEMED400ul750ul1800ul50ul10ul3．制濃縮膠：按所需的濃度配制4%的濃縮膠，配方如下：30%4.灌完濃縮膠，插入梳子。等到濃縮膠自然凝聚后，將裝置放入電泳槽內,加入電泳緩沖液,小心地拔出梳子，如果拔出梳子后加樣孔之間的間隔發生扭曲，可以用注射器針頭小心地加以整理。

4.灌完濃縮膠，插入梳子。等到濃縮膠自然凝聚后，將裝置放入5．加樣：取大腸桿菌和BSA蛋白樣品加樣，每個加樣孔加樣不宜過多，一般每孔加樣10L。6．電泳：先恒壓80V，待樣品進入分離膠后，調電壓為120V（恒壓）。當溴酚藍移動到離底部約0.5cm時，停止電泳。5．加樣：取大腸桿菌和BSA蛋白樣品加樣，每個加樣孔加樣不宜7．翹開玻璃板，將濃縮膠切掉,剝下凝膠，準備染色。8．凝膠染色：使用考馬斯亮藍R250染色。兩塊膠（小盒子）或四塊膠（大盒子）同步染色脫色。蓋上蓋子用微波爐加熱約15-20秒，搖床振蕩15分鐘，回收染液至指定容器。清水漂洗后加入脫色液（25%乙醇，75%乙酸）脫色，用量和步驟與染色相同，脫色兩次，每次10分鐘。7．翹開玻璃板，將濃縮膠切掉,剝下凝膠，準備染色。注意事項(1)Acr和Bis均為神經毒劑，對皮膚有刺激作用，操作時應戴手套和口罩。

(2)玻璃板表面應光滑潔凈，否則在電泳時會造成凝膠板與玻璃板之間產生氣泡。

(3)樣品槽模板梳齒應平整光滑。

(4)灌凝膠時不能有氣泡，以免影響電泳時電流的通過。

(5)切勿破壞加樣凹槽底部的平整，以免電泳后區帶扭曲。（6）電泳時應選