制備型高效液相制備型高效液相制備型高效液相色譜是一種快速,有效的分析分離工具。本文介紹了制備型高效液相色譜基礎理論及基本裝置,介紹了樣品的預處理和應用實例,分析了目前制備型高效液相色譜技術存在的問題并對該技

術未來的發展進行了展望。制備型高效液相色譜是一種快速,有效的分析分離工具。本文介紹2

高效液相色譜分析法

Highperformanceliquidchromatography一、液相色譜儀器

高效液相色譜分析法

Highperformanceli3制備型高效液相課件4

流程圖

流程圖5近年來,從自然資源中尋找具有生物活性化合物的探索

工作日益受到人們的關注。人們在運用高效的篩選方法,從

植物、海洋生物及微生物中發現新的先導化合物的同時需要

一個快速、有效的分離方法以分離目標化合物,而色譜技術

是迄今人類掌握的對復雜混合物分離效率最高的一種方法,

能夠分離物化性能差別很小的化合物[1]。分析型HPLC技

術一經出現就引起廣大研究者,特別是分析化學工作者的高

度重視,使這項技術在分析應用方面取得了巨大成功。現在

隨著人們大規模分離的需要,制備型高效液相色譜技術也相

應產生了,并受到了人們越來越廣泛的重視。在我國,該技

術已被列入863工程生物技術領域的攻關項目中[2]。由于

技術上的原因,長期以來制備型液相色譜技術發展緩慢,但

是隨著理論研究的深入,新穎的填料、新的填充方法以及在

儀器和流程上的進展,近年來該技術獲得了很大的發展。近年來,從自然資源中尋找具有生物活性化合物的探索

工作日益61基礎理論人們對色譜基礎理論進行不懈的研究,提出了眾多的理論。其中比較著名的有:1.平衡色譜理論。在1940年由Wilson[3]提出,該理論認為在整個色譜過程中,組分在流動相和固定相之間的分配平衡能瞬間達成;2.塔板理論。在1941年由Martin和Synge[4]提出,該理論將色譜過程比擬為蒸餾過程,把色譜柱看成是由一系列平衡單元!理論塔板所組成。在每一個塔板高度內,組分在流動相和固定相之間的分配平衡能瞬間達成;3.縱向擴散理論。由Amundson[5]等人通過大量實驗提出,該理論認為在色譜過程中,組分在流動相的軸向擴散是影響色譜區域譜帶擴張的主要因素,而有限的傳質速率對區域譜帶擴張沒有影響;4.速率理論。該理論認為組分在流動相和固定相之間有限的傳質速率是影響色譜區域譜帶擴張的主要因素,而軸向擴散的影響可以忽略;5.雙膜理論。Funk等人把流動相和固定相看成是兩塊相互緊密接觸的平面薄膜,整個傳質阻力為流動相膜的傳質阻力和固定相膜的傳質阻力所構成,組分在界面接觸處達到分配平衡。1基礎理論7簡單大男制備分離的色譜模型和分析分離的模型相似,但在具體操作中兩者的指導思想卻有著本質的不同。在制備分離中,人們總是希望在盡可能短的時間里得到盡可能多的純組分。欲得到負載必須以分離效果為代價,即在保持最低分辨率的前提下,使柱子超載以得到最大的物料通過量。而分析分離中在最短時間里得到最大的分離效率則是人們希望得到的[6]。制備分離選擇的是高柱效、高柱容量的色譜柱,而且使色譜柱在超載狀態下工作。所謂超載,通常將理論塔板數下降10%時柱容量[7]。較為理想的制備條件的選擇包括上柱量,容量因子,選擇性以及柱效[8]。簡單大男制備分離的色譜模型和分析分離的模型相似,但在具體82

基本裝置

制備型HPLC是一種基于組分在固定相(柱填料)和流

動相(淋洗液)中分配系數的微小差異,當二相作相對運動

時,樣品中的各組分將形成不同的遷移速度的譜帶而實現分

離的新型高效分離技術。對于制備型HPLC而言,裝置不像對分析型HPLC那樣關鍵,使用不很高級,價格較低的裝置

往往可以獲得令人滿意的分離效果。

制備型HPLC裝置主要由輸液泵、進樣系統、色譜柱、檢

測器、餾分收集器、數據采集與處理系統等部分組成。2基本裝置

制備型HPLC是一種基于組分在固定相(92.1輸液泵在制備型HPLC不需要具有很高的輸送壓力,一般為19.6MPa。輸液泵采用的是恒流的機械往復泵或恒壓的氣動放大泵較理想,因為它們具有較高的輸送速率和連續輸出溶劑的能力。然而當采用裝入小顆粒固定相的粗柱進行制備型HPLC時,例外地需用能提供較大壓力的泵。在某些場合,所需壓力高達150bar,此時采用薄膜泵較合適。對于內徑較小的制備柱可使用分析型的輸液泵,內徑較大的制備柱,輸液泵所需的輸送能力可從分析型柱子所做的實驗條件參數計算出來。2.1輸液泵102.2進樣系統在制備型HPLC分離中,可以采用一個進樣閥(如六通進樣閥)將較大量的樣品方便的注入柱子而不影響流動相流動。通過更換樣品環可以方便的改變進樣量,最大可達10mL。如果使用注射器,一般采用停留進樣技術,即樣品在常壓下注入,然后再從新起動泵。若樣品量非常大,可以采用停留技術,借助于一臺小體積泵將樣品定量地注入柱中。也可采用隔膜進樣法,用注射器將樣品定量地注入柱中。2.2進樣系統2.3色譜柱

相對于分析型色譜,制備色譜的核心就是色譜柱。為提

供既穩定又高效的色譜柱,并用小尺寸顆粒進行填充,最常

用也是最易實現的效果較為理想的是動態軸向壓縮柱

(DACTM)技術[9]。DAC技術為使用者提供了用任一種填料

自己裝填色譜柱、方便快速地調整柱長度的可能性。在制備

型HPLC中,色譜柱的內徑可在100~500mm之間。一般增

大色譜柱的直徑意味著可以承載更多的樣品,從而增加產

量。增加色譜柱的長度則意味著可加入的樣品量和分辨率

的增大,但同時也增加了柱壓。研究表明對于難分離物系,

可以采用直徑較小的色譜填料,以提高分離效率,但在分離

度可以滿足分離要求的前提下,使用較大直徑的色譜填料將

更為有利[10]。2.3色譜柱

相對于分析型色譜,制備色譜的核心就是色譜柱

2.4檢測器在現有的檢測器中,示差折光檢測器通常適用于制備分離,不過在某些系統中為了準確地檢測樣品中所有峰,往往需要將示差與紫外分光光度檢測器配合使用。也可用薄層色譜對高濃度的流出液各流分進行檢測,所以當其他檢測方法不適用時,可求助于薄層色譜檢測2.4檢測器2.5餾分收集器

在制備型分離工作中,需使用大量的洗脫溶劑,因此要采用適當的收集器。若收集一個或幾個已分離的組分,用手動餾分收集器即可。然而當大量樣品組分必須一次分離或為了提高一個或多個組分的收集量而要進行多次重復性分離,使用自動餾分收集器更為方便。如有可能,應對溶劑回收再用,因而也應盡量不使用混合溶劑[11]。在使用反相或聚合物吸附進行分離時,有時從水液中回收樣品較困難。一種解決辦法是蒸除其中的有機溶劑,然后用甲苯或氯仿提取殘留水液2.5餾分收集器142.6數據采集與處理系統國外的一些公司已經相繼開發出商業化的具有某些人工智能特點的制備型HPLC整套設備。這些整套設備均是采用一臺計算機控制整個儀器的運轉,并進行數據的收集、貯存和處理等工作,從而使制備型HPLC的分離速度以及自動化程度等大為提高。2.6數據采集與處理系統國外的一些公司已經相繼開發出商業化153

應用

3.1制備型HPLC的樣品預處理在高壓液相色譜進樣之前,需對樣品進行過濾。使用能套在注射器上的濾片可以除去樣品中混有的顆粒狀雜質,既方便又廉價。顆粒狀雜質可能損壞高壓液相色譜儀的閥門,阻塞管道或柱子入口端的濾板。濾片可以是不銹鋼或塑料套的,但通常用一次性的聚丙烯外殼的濾片。這種濾片一般有凹陷的入口及一細凹的出口,可與注射器相連。過濾膜的材料可以是聚四氟乙烯、乙酸纖維、尼龍、紙或無機膜。在選用過濾膜時應注意使其適合于所用的溶劑,這一點在使用含四氫呋喃的溶劑時尤其重要[12]。在色譜柱與進樣器之間安裝前置柱可除去顆粒狀雜質和吸附性強的樣品組分。前置柱通常裝有少量與色譜柱相同的填料,如填充得當,對系統分離效果不會造成很大影響。硅膠預處理柱可防止含有緩沖鹽或堿的流動相所引起的麻煩,上訴物質可破壞鍵合相填充料的硅膠骨架,常會在柱的上部形成空隙。預處理柱安裝在泵與進樣器之間,這樣盡管流動相被硅膠所飽和,但在進樣途中不會有空隙或氣泡3應用

3.1制備型HPLC的樣品預處理3.2制備規模按照分離一次進樣量的多少,制備型HPLC有3種規

模,即半制備級HPLC、克級HPLC和工業級HPLC,如下表1所示。制備型HPLC以生產純物質為目的,在經濟合理的前提下,規模越大越好3.2制備規模按照分離一次進樣量的多少,制備型HPLC醫學壓力演示文稿3.3柱超載方式分析型HPLC與制備型HPLC的根本區別在于分離目的不同[13]。在分析型中,需要的是反映樣品組成的信息,不需要收集達到特定純度的餾分,洗提液通常是作為廢液來考慮的。但在制備型HPLC中,為了節省投資和操作費用,必須以最少的時間生產最大量的產品。由于目的不同,制備型HPLC與分析型HPLC所選用的操作方式有顯著不同。前者要求進樣量越小越好,而后者為了提高制備量,柱必須超載。柱的超載方式有兩種,一種是所謂的質量超載,即維持較小的進樣體積,但提高進樣濃度;另一種是所謂的體積超載,即保持較小的進樣濃度,但增加進樣體積。在制備型HPLC中,一般認為采用質量超載的方式較好。王志祥[14]等人建立的混合池模型可以較好的描述制備型HPLC分離過程,發現在制備型HPLC分離過程中,分離度和柱效均隨質量超載程度的增加而下降。但是,在分離度可以滿足分離要求的前提下,采用質量超載的方式操作,可以提高制備量。醫學壓力演示文稿3.3柱超載方式3.4流動相進行制備型液相色譜分離時,所用溶劑的純度很重要。即使含純化合物的流動相溶劑中含有微量的不揮發性雜質,當大量溶劑經蒸發后,其雜質濃度就會增高。制備型液相色譜往往需消耗大量溶劑,因此應在溶劑純度與所用數量之間進行權衡。流動相中的非揮發性添加劑會在產物回收時引起麻煩,這是可采用揮發性緩沖物來改進分離效果,又易于將其除去。3.4流動相3.5洗脫制備型HPLC所采用的洗脫方式主要有兩種。一種是維持流動相的熱力學參數不變的等度洗脫法;一種是改變流動相的一種或幾種熱力學參數的梯度洗脫法3.5洗脫3.6被分離物質的收集在制備型分離工作中,需使用大量的洗脫溶劑,因此要采用適當的收集器。如有可能,應對溶劑回收再用,因而也應盡量不使用混合溶劑。在使用反相或聚合物吸附劑進行分離時,有時從水液中回收樣品較困難。一種解決辦法是蒸除其中的有機溶劑,然后用甲苯或氯仿提取殘留水液。如以甲醇-水為洗脫液,可將收集的流分用水稀釋5倍,用泵加回到色譜柱上,然后用甲醇將化合物洗脫下來。如從環肽中脫鹽時,先用水洗脫重新加到柱上的流分,然后用純甲醇洗脫所需成分另一種方法是將收集的樣品加到SephadexLH-20柱上,如Seto等[15]在從植物薔薇中分離黃酮苷時,采用此法以水洗除HPLC洗脫液中含有的磷酸,而后用甲醇將純化合物洗下。目前的發展趨勢是實現進樣與流分收集的自動化,這樣可進行連續的操作及反復的分離[16]。3.6被分離物質的收集214在天然產物研究中的應用實例肖偉濤,朱小蘭等人用制備高效液相色譜技術對25%茶葉提取物中茶氨酸進行制備、分離純化。所得產品用外標法定量分析,純度大于98%,制備收率大于60%[17]。彭密軍,周春山等人采用制備型HPLC分離純化,制備回收率為83.3%,相對標準偏差為3.1%,綠原酸的純度達98.61%,同時可得到杜仲葉黃酮、桃葉珊瑚甙等副產品[18]。徐光國[19]運用國產YZS-3型制備液相色譜儀分離制備了抗癌藥葫蘆素B標準品,茯苓三萜酸成分和金銀花中的主要成分綠原酸;陳若蕓[20]等用制備液相色譜技術制備了靈芝中的三萜類化合物;張仁斌[21]等用該技術對青蒿素異構體進行了分離制備。李軍等用制備型HPLC對曲克蘆丁原料進行分離純化制得曲克蘆丁對照品,純度可達99%以上[22]。仲英等利用高效液相色譜Deltaprep3000制備系統純化藥典用葛根素對照品[23]。陳曉輝等利用制備型HPLC對野菊花的黃酮類化學成分進行分離研究,分離純化了6個化學品,純度均為99%以上[24]。尚慶坤等使用制備型HPLC法分離虻蟲中的多肽樣品,制備收集了4種主要組分,經檢測各組分達到很高純度[25]。彭密軍等使用制備HPLC從杜仲樣品中同時制備了AU、GPA、GP3種單體[26]。4在天然產物研究中的應用實例225結語與其他制備方法相比,液相色譜是目前技術手段最成熟、應用最為廣泛的一種。但是它的缺點也很明顯[27],如需消耗大量溶劑、產品過于稀釋以及往往無法避免有毒溶劑的使用。另外色譜技術的最大弱點是定性能力差。因此將分離手段和分析手段聯合成為一個整體,再配上專用的計算機,已成為近代分析儀器發展的又一個重要方向。當前對各種檢測手段及聯機的接口,都還趨于摸索階段或者只適用于某些領域,例如HPLC-AAS(原子吸收)、HPLC-LC(質譜)、HPLC-化學發光法、HPLC-化學發光法、HPLC-電子捕獲、HPLC-NMR(核磁共振)、HPLC-IR(紅外)等等。盡管如此,HPLC仍然是難以替代的分離方法。在蛋白質(包括酶)、核酸和糖等與生命科學密切相關的生物大分子的分離上,HPLC也是特別受寵的一項技術,多種可供選擇的分離模式(反相、正相、離子交換、體積排斥、疏水作用、親和色譜等)都有應用。在二十世紀最后的幾年里,高效液相色譜將與毛細管電泳、超臨界流體色譜法、逆流色譜法、場流分級等等繼續競爭下去,但由于HPLC的耐用、通用性強和分離能力高,液相色譜仍是分析實驗室的主力而不會被取代。5結語23謝謝

觀賞謝謝觀賞24制備型高效液相制備型高效液相制備型高效液相色譜是一種快速,有效的分析分離工具。本文介紹了制備型高效液相色譜基礎理論及基本裝置,介紹了樣品的預處理和應用實例,分析了目前制備型高效液相色譜技術存在的問題并對該技

術未來的發展進行了展望。制備型高效液相色譜是一種快速,有效的分析分離工具。本文介紹26

高效液相色譜分析法

Highperformanceliquidchromatography一、液相色譜儀器

高效液相色譜分析法

Highperformanceli27制備型高效液相課件28

流程圖

流程圖29近年來,從自然資源中尋找具有生物活性化合物的探索

工作日益受到人們的關注。人們在運用高效的篩選方法,從

植物、海洋生物及微生物中發現新的先導化合物的同時需要

一個快速、有效的分離方法以分離目標化合物,而色譜技術

是迄今人類掌握的對復雜混合物分離效率最高的一種方法,

能夠分離物化性能差別很小的化合物[1]。分析型HPLC技

術一經出現就引起廣大研究者,特別是分析化學工作者的高

度重視,使這項技術在分析應用方面取得了巨大成功。現在

隨著人們大規模分離的需要,制備型高效液相色譜技術也相

應產生了,并受到了人們越來越廣泛的重視。在我國,該技

術已被列入863工程生物技術領域的攻關項目中[2]。由于

技術上的原因,長期以來制備型液相色譜技術發展緩慢,但

是隨著理論研究的深入,新穎的填料、新的填充方法以及在

儀器和流程上的進展,近年來該技術獲得了很大的發展。近年來,從自然資源中尋找具有生物活性化合物的探索

工作日益301基礎理論人們對色譜基礎理論進行不懈的研究,提出了眾多的理論。其中比較著名的有:1.平衡色譜理論。在1940年由Wilson[3]提出,該理論認為在整個色譜過程中,組分在流動相和固定相之間的分配平衡能瞬間達成;2.塔板理論。在1941年由Martin和Synge[4]提出,該理論將色譜過程比擬為蒸餾過程,把色譜柱看成是由一系列平衡單元!理論塔板所組成。在每一個塔板高度內,組分在流動相和固定相之間的分配平衡能瞬間達成;3.縱向擴散理論。由Amundson[5]等人通過大量實驗提出,該理論認為在色譜過程中,組分在流動相的軸向擴散是影響色譜區域譜帶擴張的主要因素,而有限的傳質速率對區域譜帶擴張沒有影響;4.速率理論。該理論認為組分在流動相和固定相之間有限的傳質速率是影響色譜區域譜帶擴張的主要因素,而軸向擴散的影響可以忽略;5.雙膜理論。Funk等人把流動相和固定相看成是兩塊相互緊密接觸的平面薄膜,整個傳質阻力為流動相膜的傳質阻力和固定相膜的傳質阻力所構成,組分在界面接觸處達到分配平衡。1基礎理論31簡單大男制備分離的色譜模型和分析分離的模型相似,但在具體操作中兩者的指導思想卻有著本質的不同。在制備分離中,人們總是希望在盡可能短的時間里得到盡可能多的純組分。欲得到負載必須以分離效果為代價,即在保持最低分辨率的前提下,使柱子超載以得到最大的物料通過量。而分析分離中在最短時間里得到最大的分離效率則是人們希望得到的[6]。制備分離選擇的是高柱效、高柱容量的色譜柱,而且使色譜柱在超載狀態下工作。所謂超載,通常將理論塔板數下降10%時柱容量[7]。較為理想的制備條件的選擇包括上柱量,容量因子,選擇性以及柱效[8]。簡單大男制備分離的色譜模型和分析分離的模型相似,但在具體322

基本裝置

制備型HPLC是一種基于組分在固定相(柱填料)和流

動相(淋洗液)中分配系數的微小差異,當二相作相對運動

時,樣品中的各組分將形成不同的遷移速度的譜帶而實現分

離的新型高效分離技術。對于制備型HPLC而言,裝置不像對分析型HPLC那樣關鍵,使用不很高級,價格較低的裝置

往往可以獲得令人滿意的分離效果。

制備型HPLC裝置主要由輸液泵、進樣系統、色譜柱、檢

測器、餾分收集器、數據采集與處理系統等部分組成。2基本裝置

制備型HPLC是一種基于組分在固定相(332.1輸液泵在制備型HPLC不需要具有很高的輸送壓力,一般為19.6MPa。輸液泵采用的是恒流的機械往復泵或恒壓的氣動放大泵較理想,因為它們具有較高的輸送速率和連續輸出溶劑的能力。然而當采用裝入小顆粒固定相的粗柱進行制備型HPLC時,例外地需用能提供較大壓力的泵。在某些場合,所需壓力高達150bar,此時采用薄膜泵較合適。對于內徑較小的制備柱可使用分析型的輸液泵,內徑較大的制備柱,輸液泵所需的輸送能力可從分析型柱子所做的實驗條件參數計算出來。2.1輸液泵342.2進樣系統在制備型HPLC分離中,可以采用一個進樣閥(如六通進樣閥)將較大量的樣品方便的注入柱子而不影響流動相流動。通過更換樣品環可以方便的改變進樣量,最大可達10mL。如果使用注射器,一般采用停留進樣技術,即樣品在常壓下注入,然后再從新起動泵。若樣品量非常大,可以采用停留技術,借助于一臺小體積泵將樣品定量地注入柱中。也可采用隔膜進樣法,用注射器將樣品定量地注入柱中。2.2進樣系統2.3色譜柱

相對于分析型色譜,制備色譜的核心就是色譜柱。為提

供既穩定又高效的色譜柱,并用小尺寸顆粒進行填充,最常

用也是最易實現的效果較為理想的是動態軸向壓縮柱

(DACTM)技術[9]。DAC技術為使用者提供了用任一種填料

自己裝填色譜柱、方便快速地調整柱長度的可能性。在制備

型HPLC中,色譜柱的內徑可在100~500mm之間。一般增

大色譜柱的直徑意味著可以承載更多的樣品,從而增加產

量。增加色譜柱的長度則意味著可加入的樣品量和分辨率

的增大,但同時也增加了柱壓。研究表明對于難分離物系,

可以采用直徑較小的色譜填料,以提高分離效率,但在分離

度可以滿足分離要求的前提下,使用較大直徑的色譜填料將

更為有利[10]。2.3色譜柱

相對于分析型色譜,制備色譜的核心就是色譜柱

2.4檢測器在現有的檢測器中,示差折光檢測器通常適用于制備分離,不過在某些系統中為了準確地檢測樣品中所有峰,往往需要將示差與紫外分光光度檢測器配合使用。也可用薄層色譜對高濃度的流出液各流分進行檢測,所以當其他檢測方法不適用時,可求助于薄層色譜檢測2.4檢測器2.5餾分收集器

在制備型分離工作中,需使用大量的洗脫溶劑,因此要采用適當的收集器。若收集一個或幾個已分離的組分,用手動餾分收集器即可。然而當大量樣品組分必須一次分離或為了提高一個或多個組分的收集量而要進行多次重復性分離,使用自動餾分收集器更為方便。如有可能,應對溶劑回收再用,因而也應盡量不使用混合溶劑[11]。在使用反相或聚合物吸附進行分離時,有時從水液中回收樣品較困難。一種解決辦法是蒸除其中的有機溶劑,然后用甲苯或氯仿提取殘留水液2.5餾分收集器382.6數據采集與處理系統國外的一些公司已經相繼開發出商業化的具有某些人工智能特點的制備型HPLC整套設備。這些整套設備均是采用一臺計算機控制整個儀器的運轉,并進行數據的收集、貯存和處理等工作,從而使制備型HPLC的分離速度以及自動化程度等大為提高。2.6數據采集與處理系統國外的一些公司已經相繼開發出商業化393

應用

3.1制備型HPLC的樣品預處理在高壓液相色譜進樣之前,需對樣品進行過濾。使用能套在注射器上的濾片可以除去樣品中混有的顆粒狀雜質,既方便又廉價。顆粒狀雜質可能損壞高壓液相色譜儀的閥門,阻塞管道或柱子入口端的濾板。濾片可以是不銹鋼或塑料套的,但通常用一次性的聚丙烯外殼的濾片。這種濾片一般有凹陷的入口及一細凹的出口,可與注射器相連。過濾膜的材料可以是聚四氟乙烯、乙酸纖維、尼龍、紙或無機膜。在選用過濾膜時應注意使其適合于所用的溶劑,這一點在使用含四氫呋喃的溶劑時尤其重要[12]。在色譜柱與進樣器之間安裝前置柱可除去顆粒狀雜質和吸附性強的樣品組分。前置柱通常裝有少量與色譜柱相同的填料,如填充得當,對系統分離效果不會造成很大影響。硅膠預處理柱可防止含有緩沖鹽或堿的流動相所引起的麻煩,上訴物質可破壞鍵合相填充料的硅膠骨架,常會在柱的上部形成空隙。預處理柱安裝在泵與進樣器之間,這樣盡管流動相被硅膠所飽和,但在進樣途中不會有空隙或氣泡3應用

3.1制備型HPLC的樣品預處理3.2制備規模按照分離一次進樣量的多少,制備型HPLC有3種規

模,即半制備級HPLC、克級HPLC和工業級HPLC,如下表1所示。制備型HPLC以生產純物質為目的,在經濟合理的前提下,規模越大越好3.2制備規模按照分離一次進樣量的多少,制備型HPLC醫學壓力演示文稿3.3柱超載方式分析型HPLC與制備型HPLC的根本區別在于分離目的不同[13]。在分析型中,需要的是反映樣品組成的信息,不需要收集達到特定純度的餾分,洗提液通常是作為廢液來考慮的。但在制備型HPLC中,為了節省投資和操作費用,必須以最少的時間生產最大量的產品。由于目的不同,制備型HPLC與分析型HPLC所選用的操作方式有顯著不同。前者要求進樣量越小越好,而后者為了提高制備量,柱必須超載。柱的超載方式有兩種,一種是所謂的質量超載,即維持較小的進樣體積,但提高進樣濃度;另一種是所謂的體積超載,即保持較小的進樣濃度,但增加進樣體積。在制備型HPLC中,一般認為采用質量超載的方式較好。王志祥[14]等人建立的混合池模型可以較好的描述制備型HPLC分離過程,發現在制備型HPLC分離過程中,分離度和柱效均隨質量超載程度的增加而下降。但是,在分離度可以滿足分離要求的前提下,采用質量超載的方式操作,可以提高制備量。醫學壓力演示文稿3.3柱超載方式3.4流動相進行制備型液相色譜分離時,所用溶劑的純度很重要。即使含純化合物的流動相溶劑中含有微量的不揮發性雜質,當大量溶劑經蒸發后,其雜質濃度就會增高。制備型液相色譜往往需消耗大量溶劑,因此應在溶劑純度與所用數量之間進行權衡。流動相中的非揮發性添加劑會在產物回收時引起麻煩,這是可采用揮發性緩沖物來改進分離效果,又易于將其除去。3.4流動相3.5洗脫制備型HPLC所采用的洗脫方式主要有兩種。一種是維持流動相的熱力學參數不變的等度洗脫法;一種是改變流動相的一種或幾種熱力學參數的梯度洗脫法3.5洗脫3.6被分離物質的收集在制備型分離工作中,需使用大量的洗脫溶劑,因此要采用適當的收集器。如有可能,應對溶劑回收再用,因而也應盡量不使用混合溶劑。在使用反相或聚合物吸附劑進行分離時,有時從水液中回收樣品較困難。一種解決辦法是蒸除其中的有機溶劑,然后用甲苯或氯仿提取殘留水液。如以甲醇-水為洗脫液,可將收集的流分用水稀釋5倍,用泵加回到色譜柱上,然后用甲醇將化合物洗脫下來。如從環肽中脫鹽時,先用水洗脫重新加到柱上的流分,然后用純甲醇洗脫所需成分另一種方法是將收集的樣品加到SephadexLH-20柱上,如Seto等[15]在從植物薔薇中分離黃酮苷時,采用此法以水洗除HPLC洗脫液中含有的磷酸,而后用甲醇將純化合物洗下。目前的發展趨勢是實現進樣與流分收集的