實(shí)驗(yàn)十二

藥物研制工藝

——細(xì)胞色素C的制備及測(cè)定劉艷麗生科院249室一、目的要求： 掌握從心肌中提取細(xì)胞色素C的原理；學(xué)習(xí)測(cè)定細(xì)胞色素C含量的方法；了解細(xì)胞色素C活性測(cè)定方法。二、原理： 細(xì)胞色素是一類(lèi)含鐵卟啉基團(tuán)的電子傳遞蛋白，只存在于需氧細(xì)胞中，在線粒體內(nèi)膜上起傳遞電子的作用。細(xì)胞色素C是細(xì)胞色素的一種，是一種穩(wěn)定可溶性蛋白，易溶于水及酸性溶液，故常用酸性水提取。可分為氧化型和還原型兩種，氧化型水溶液呈深紅色，還原型水溶液呈桃紅色。其含量與組織的活動(dòng)強(qiáng)度成正比。以哺乳動(dòng)物的心肌、鳥(niǎo)類(lèi)的胸肌和昆蟲(chóng)的翼肌含量最多，肝、腎次之，皮膚和肺中最少。 本實(shí)驗(yàn)以豬心肌為原料經(jīng)過(guò)酸溶液抽提，人造沸石吸附及三氯乙酸沉淀得到細(xì)胞色素C粗制品。根據(jù)還原型細(xì)胞色素C在520nm有最高吸收峰，利用分光光度計(jì)測(cè)定其含量。三、試劑：1、制備用試劑1mol/L硫酸；1mol/L氨水；人造沸石60-80目；0.2%氯化鈉溶液；25%硫酸銨溶液；20%三氯乙酸；奈氏試劑或10%氯化鋇溶液。2、測(cè)定用試劑標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞色素C溶液（80mg/mL）；連二亞硫酸鈉。四、器材：新鮮或冰凍的豬心、離心機(jī)、分光光度計(jì)、層析柱、透析袋、尼龍紗布。六、操作方法：1、細(xì)胞色素C的制備（1）絞碎、提取、壓濾：將豬心絞碎后，稱(chēng)取100g肌肉糜，加入200mL水，用1M硫酸調(diào)pH至4.0，在室溫下攪拌提取2h。然后用1M氨水調(diào)pH至6.0，用尼龍紗布?jí)簽V，收集濾液，將濾渣按上述條件重提取1h，合并兩次提取濾液。（2）中和：用1M氨水將上述提取液調(diào)pH至7.5，靜置40min，3000rpm離心5min，棄沉淀，合并上清液。（3）吸附：在上清液中加入人造沸石（10g/L）,攪拌吸附40min，靜置5min，棄上層清液，收集吸附細(xì)胞色素C的人造沸石。用蒸餾水洗滌2次，0.2%的氯化鈉溶液洗滌2次，再用蒸餾水洗滌至液體澄清為止（1次）。（4）洗脫：將吸附細(xì)胞色素C的人造沸石裝入預(yù)先加入1/4體積蒸餾水的層析柱內(nèi)，注意要一次加完，避免產(chǎn)生氣泡及條帶。用25%硫酸銨溶液洗脫，流速約2mL/min，收集含細(xì)胞色素C的紅色洗脫液，當(dāng)洗脫液紅色開(kāi)始消失時(shí)，即洗脫完畢。（5）鹽析、濃縮、透析：洗脫液中加入固體硫酸銨（20g/100mL），邊加邊攪拌，靜置，1.5h后，10000rpm離心5min除去雜蛋白，收集透明液體，緩緩加入20%三氯乙酸溶液（25mL/L），邊加邊攪拌，立即于10000rpm離心5min，收集沉淀。加適量蒸餾水（1mL）剛好使沉淀完全溶解，裝入透析袋，攪拌下透析除鹽，透析三次，10min/次，第三次用奈氏試劑或氯化鋇檢測(cè)透析外液無(wú)銨根離子或硫酸根離子為止，收集透析液即為細(xì)胞色素C粗品。2、細(xì)胞色素C含量測(cè)定（1）標(biāo)準(zhǔn)曲線的制定：取1mL細(xì)胞色素C標(biāo)準(zhǔn)品（80mg/mL）加水稀釋至25mL。取0mL、0.2mL、0.4mL、0.6mL、0.8mL、1.0mL于試管中，加水至4mL，加入50L連二亞硫酸鈉，搖勻后，于520nm測(cè)光吸收值，做2個(gè)平行。以標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)，光吸收值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。（2）樣品的測(cè)定：根據(jù)制得樣品溶液顏色（與標(biāo)準(zhǔn)品比較）決定是否稀釋?zhuān)?mL原液或稀釋液加3mL水，加入50L連二亞硫酸鈉，搖勻后，于520nm測(cè)光吸收值，做2個(gè)平行，查標(biāo)準(zhǔn)曲線得到濃度。七、應(yīng)用 細(xì)胞色素C是一種重要的細(xì)胞呼吸激活劑，常作為組織缺氧治療的急救用藥和輔助用藥，如CO中毒、安眠藥中毒、初生嬰兒窒息、嚴(yán)重休克期缺氧、麻醉前處理以及肺部疾患引起的呼吸困難、高山缺氧、各種腦部疾病引起的腦缺氧、各種心臟疾患的缺氧。也用于腦血管障礙，中風(fēng)后遺癥、乙型腦炎后遺癥等的治療。另外細(xì)胞色素C還能促進(jìn)受損肝細(xì)胞的再生、骨髓造血機(jī)能修復(fù)以及顯著減輕由放療引起的白細(xì)胞減少