儀器分析課件_第03章第一頁，共49頁。第一節高效液相色譜法的特點一、概述二、特點

1．高壓：一般可達150～350×10Pa。

2.高速：一般可達1～10ml/min。

3.高效：近來研究出許多新型固定相，使分離效率大大提高。

4.高靈敏度：如熒光檢測器靈敏度可達10g。另外，用樣量小，一般幾個微升。

5.適應范圍寬：-1152022/11/10第二頁，共49頁。第二節、影響色譜峰擴展及色譜分離的因素

一、液相色譜速率理論—影響色譜峰擴展因素2022/11/10第三頁，共49頁。二、.影響分離的因素——流速

由圖3-1知，液相色譜H---u曲線與其相色譜不同，當流速大于0.5cm/s時，是一段斜率不大的直線，只是因為分子擴散相對H值的影響可以忽略不計。在液相色譜中，使用較高流速，柱效下降不明顯，有利于實現快速分離。提高柱效的途徑：減小填料粒度以加快傳質速率；提高柱內填料裝填的均勻性。2022/11/10第四頁，共49頁。

第三節、高效液相色譜法的主要分離類型

a.正相液—液分配色譜法:

流動相的極性小于固定液的極性。

b.反相液—液分配色譜法:

流動相的極性大于固定液的極性。

c.液—液分配色譜法的缺點：固定液在流動相中仍有微量溶解；流動相通過色譜柱時的機械沖擊力，會造成固定液流失。上世紀70年代末發展的化學鍵合固定相，可克服上述缺點。1．液—液分配色譜法及化學鍵合相色譜流動相和固定相都是液體。當試樣進入色譜柱，溶質在兩相間進行分配。達平衡時，服從于下式：2022/11/10第五頁，共49頁。2.吸附色譜（液-固吸附色譜）流動相為液體，固定相為吸附劑（如硅膠、氧化鋁等）。這是根據物質吸附作用的不同來進行分離的。其作用機制是：當試樣進入色譜柱時，溶質分子(X)和溶劑分子(S)對吸附劑表面活性中心發生競爭吸附（未進樣時，所有的吸附劑活性中心吸附的是S），可表示如下：Xm+nSa======Xa+nSm式中：Xm--流動相中的溶質分子；Sa--固定相中的溶劑分子；Xa--固定相中的溶質分子；Sm--流動相中的溶劑分子。當吸附競爭反應達平衡時：K=[Xa][Sm]/[Xm][Sa]式中：K為吸附平衡常數。[討論：K與保留值的關系]2022/11/10第六頁，共49頁。3.離子交換色譜

IEC是以離子交換劑作為固定相。IEC是基于離子交換樹脂上可電離的離子與流動相中具有相同電荷的溶質離子進行可逆交換，依據這些離子以交換劑具有不同的親和力而將它們分離。以陰離子交換劑為例，其交換過程可表示如下：X-(溶劑中)+(樹脂-R4N+Cl-)===(樹脂-R4N+X-)+Cl-

(溶劑中)當交換達平衡時：KX=[-R4N+X-][Cl-]/[-R4N+Cl-][X-]分配系數為：DX=[-R4N+X-]/[X-]=KX[-R4N+Cl-]/[Cl-][討論：DX與保留值的關系]2022/11/10第七頁，共49頁。4．離子對色譜法(IonPairChromatography)

離子對色譜法是將一種(或多種)與溶質分子電荷相反的離子(稱為對離子或反離子)加到流動相或固定相中，使其與溶質離子結合形成疏水型離子對化合物，從而控制溶質離子的保留行為。其原理可用下式表示：X+水相+Y-水相===X+Y-有機相式中：X+水相--流動相中待分離的有機離子）；Y-水相--流動相中帶相反電荷的對離子（如氫氧化四丁基銨、氫氧化十六烷基三甲銨等）；X+Y---形成的粒子對化合物。當達平衡時：KXY=[X+Y-]有機相/[X+]水相[Y-]水相根據定義，分配系數為：DX=[X+Y-]有機相/[X+]水相=KXY[Y-]水相離子對色譜法(特別是反相)發解決了以往難以分離的混合物的分離問題，諸如酸、堿和離子、非離子混合物，特別是一些生化試樣如核酸、核苷、生物堿以及藥物等分離。2022/11/10第八頁，共49頁。5．離子色譜法(IonChromatography)

原理：

用離子交換樹脂為固定相，電解質溶液為流動相。以陰離子交換樹脂(R-OH)作固定相，分離陰離子(如Br-)為例。當待測陰離子Br-隨流動相(NaOH)進入色譜柱時，發生如下交換反應(洗脫反應為交換反應的，的逆過程)：

以電導檢測器為通用檢測器，為消除流動相中強電解質背景離子對電導檢測器的干擾，設置了抑制柱。試樣組分在分離柱和抑制柱上的反應原理與離子交換色譜法相同。2022/11/10第九頁，共49頁。離子色譜具有以下優點：（1）分析速度快

可在數分鐘內完成一個試樣的分析；（2）分離能力高

在適宜的條件下，可使常見的各種陰離子混合物分離；例：使用雙柱法，在十幾分鐘內，可使七種陰離子完全分離。（3）分離混合陰離子的最有效方法（4）儀器流路采用全塑件，玻璃柱，耐腐蝕2022/11/10第十頁，共49頁。離子色譜的應用陰離子分析:

雙柱；薄殼型陰離子交換樹脂分離柱(3×250mm),流動相：0.003mol·L-1NaHCO3/0.0024mol·L-1Na2CO3，流量138mL/h。七種陰離子在20分鐘內基本上得到完全分離，各組分含量在3～50ppm。2022/11/10第十一頁，共49頁。6.空間排阻色譜(StericExclusionChromatography)

以凝膠為固定相。凝膠是一種經過交聯的、具有立體網狀結構和不同孔徑（xnm~x00nm）的多聚體的通稱。如葡聚糖凝膠、瓊脂糖等軟質凝膠；多孔硅膠、聚苯乙烯凝膠等硬質凝膠。

機理：當試樣進入凝膠色譜柱時，尺寸過大的分子完全不能滲透到膠孔中去而受到排阻，沿膠粒之間的間隙直接流出色譜柱，產生一個色譜峰；尺寸過小的分子可完全滲透到膠孔中去，流動速度慢，最后流出色譜柱，產生一個色譜峰；中等尺寸的分子，以其大小的不同，可滲透到某些孔穴而不能進入另一些空穴，流出速度取決于分子尺寸的大小,按分子尺寸由大到小的順序先后流出色譜柱，從而實現分離。

應用：適合分離分子量大的化合物（100~800,000)，只要相對分子量相差大于10%。2022/11/10第十二頁，共49頁。第四節液相色譜法固定相一、液—液色譜法及離子對色譜法固定相1．擔體(1)全多孔型擔體：a.HPLC早期使用的擔體與GC類似，是顆粒均勻的多孔球體，如有氧化鋁、氧化硅、硅藻土等制成的Φ100μm全多孔型擔體。缺點：填料的不規則性和較寬的粒度范圍會導致填充不易均勻，柱效低；填料孔徑分布不一，并存在“裂隙”在填料深孔中形成滯留液體（液坑），溶質分子在深孔中擴散和傳質慢，使色譜峰變寬，柱效下降。b.現在采用Φ〈10μm全多孔型擔體，它是由nm級的硅膠微粒堆積而成Φ為5μm或稍大的全多孔小球。優點：顆粒小而均勻，傳質快（距離短），柱效高。2022/11/10第十三頁，共49頁。擔體(2)表層多孔型擔體（薄殼型微珠擔體）：它是直徑為30～40μm的實心核(玻璃微珠)，表層上附有一層厚度約為1～2μm多孔表面(多孔硅膠)。2．固定液液—液色譜流動相和固定相都是液體，因此要求兩相要互不相容。在液-液色譜中常用的固定相也只有極性不同的幾種，如β，β'-氧二丙腈、聚已二醇-400和角鯊烷等。優點：孔穴淺（固定相僅為表面的一薄層），傳質速度快,易于填充均勻,柱效高。缺點：柱子容量低、需要配用高靈敏檢測器。這種擔體目前應用較為普遍。2022/11/10第十四頁，共49頁。液—液色譜法及離子對色譜法固定相3．化學鍵合固定相：

即用化學反應的方法通過化學鍵把有機分子結合到擔體表面。根據在硅膠表面(具有≡Si－OH基團)的化學反應不同，鍵合固定相可分為：硅氧碳鍵型(≡Si－O－C):硅氧硅碳鍵型(≡Si－O－Si－C):穩定，耐水、耐光、耐有機溶劑，應用最廣。硅碳鍵型(≡Si－C):和硅氮鍵型（≡Si－N):2022/11/10第十五頁，共49頁。液—液色譜法及離子對色譜法固定相化學鍵合固定相具有如下一些特點：ⅰ.

表面沒有坑，比一般液體固定相傳質快得多；

ⅱ.

無固定液流失，增加了色譜柱的穩定性和壽命；

ⅲ.

可以鍵合不同官能團，能靈活地改變選擇性，應用于多種色譜類型及樣品的分析；

ⅳ.

有利于梯度洗提，也有利于配用靈敏的檢測器和餾分的收集。

2022/11/10第十六頁，共49頁。2022/11/10第十七頁，共49頁。液相色譜法固定相二、液－固吸附色譜法固定相

采用的吸附劑有硅膠、氧化鋁、分子篩、聚酰胺等，仍可分為全多孔性和薄殼型兩種，其特點如前所述。三、離子交換色譜法固定相

薄膜型離子交換樹脂:

即以薄殼玻璃珠為擔體，在它的表面涂約1%的離子交換樹脂而成。2.離子交換鍵合固定相:

用化學反應將離子交換基團鍵合在惰性擔體表面。2022/11/10第十八頁，共49頁。液相色譜法固定相四、排阻色譜法固定相1.軟質凝膠：如交聯葡聚糖凝膠、瓊脂糖凝膠等，適用于水為流動相，在常壓下使用。2.半硬質凝膠：如苯乙烯－二乙烯基苯交聯共聚凝膠（交聯聚苯乙烯凝膠），是應用最多的有機凝膠，適用于非極性有機溶劑。3.硬質凝膠：如多孔硅膠、多孔玻璃珠等，多孔硅膠是用得較多的無機凝膠。

化學穩定性、熱穩定性好、機械強度大，流動相性質影響小，可在較高流速下使用。2022/11/10第十九頁，共49頁。第五節液相色譜法流動相選擇流動相時應注意下列幾個因素：(1)流動相純度：防止微量雜質長期累積損壞色譜柱和使檢測器噪聲增加。(2)避免流動相與固定相發生作用而使柱效下降或損壞柱子：如在液-液色譜中，流動相應與固定液互不相容，否則，會使固定液溶解流失；酸性溶劑破壞氧化鋁固定相等。(3)對試樣要有適宜的溶解度：試樣在流動相中應有適宜的溶解度，防止產生沉淀并在柱中沉積。(4)溶劑的粘度小些為好：否則，會降低試樣組分的擴散系數，造成傳質速率緩慢，柱效下降。(5)應與檢測器相匹配：例如，當使用紫外檢測器時，流動相不應有紫外吸收。

2022/11/10第二十頁，共49頁。液相色譜法流動相

在選擇溶劑時，溶劑的極性是選擇的重要依據。例如，采用正相液-液分配分離時：首先選擇中等極性溶劑，若組分的保留時間太短，降低溶劑極性，反之增加。也可在低極性溶劑中，逐漸增加其中的極性溶劑，使保留時間縮短。

常用溶劑的極性順序：水(最大)>甲酰胺>乙腈>甲醇>乙醇>丙醇>丙酮>二氧六環>四氫呋喃>甲乙酮>正丁醇>乙酸乙酯>乙醚>異丙醚>二氯甲烷>氯仿>溴乙烷>苯>四氯化碳>二硫化碳>環己烷>己烷>煤油(最小)

有時還需要選用二元或多元溶劑，以靈活調節流動相的極性或增加選擇性，以改進分離或調整出峰時間。選擇時要參閱有關手冊，并通過實驗確定。2022/11/10第二十一頁，共49頁。第六節、高效液相色譜儀液相色譜儀(1)2022/11/10第二十二頁，共49頁。液相色譜儀（2）2022/11/10第二十三頁，共49頁。液相色譜儀（3）2022/11/10第二十四頁，共49頁。液相色譜儀（4）2022/11/10第二十五頁，共49頁。高

效

液

相

色

譜

儀

流

程

圖2022/11/10第二十六頁，共49頁。高效液相色譜儀

1.高壓輸液泵

HPLC使用的高壓泵應滿足下列條件：a.

流量恒定，無脈動，并有較大的調節范圍（一般為1~10mL/min）；b.

能抗溶劑腐蝕；c.

有較高的輸液壓力；對一般分離，60×105Pa的壓力就滿足了，對高效分離，要求達到150~300×105Pa。(1)往復式柱塞泵

2022/11/10第二十七頁，共49頁。高效液相色譜儀(2)氣動放大泵

2022/11/10第二十八頁，共49頁。高效液相色譜儀

2.梯度淋洗裝置

梯度洗提，就是載液中含有兩種（或更多）不同極性的溶劑，在分離過程中按一定的程序連續改變載液中溶劑的配比和極性，通過載液中極性的變化來改變被分離組分的分離因素，以提高分離效果。梯度洗提可以分為兩種：

a.低壓梯度（也叫外梯度）：在常壓下，預先按一定程序將兩種或多種不同極性的溶劑混合后，再用一臺高壓泵輸入色譜柱。

2022/11/10第二十九頁，共49頁。梯度淋洗裝置b.高壓梯度(或稱內梯度系統)：利用兩臺高壓輸液泵，將兩種不同極性的溶劑按按設定的比例送入梯度混合室，混合后，進入色譜柱。2022/11/10第三十頁，共49頁。高效液相色譜儀3.進樣裝置(1).注射器進樣裝置：進樣所用微量注射器及進樣方式與GC法一樣。進樣壓力<150×105Pa，當進樣壓力>150×105Pa時，必須采用停流進樣。(2).高壓定量進樣閥：與GC法用的流通法相似，能在高壓下進樣。其結構如圖所示：2022/11/10第三十一頁，共49頁。高效液相色譜儀4.高效分離柱常用的標準柱型是內徑為4.6或3.9mm，長度為15～30cm的直形不銹鋼柱。填料顆粒度5～10μm，柱效以理論塔板數計大約7000～10000。

在高效液相色譜中，分離柱的制備是一項技術要求非常高的工作，一般很少自行制備。

發展趨勢是減小填料粒度及柱徑和柱長，以提高分析速度和柱效；研制高效柱填料是一活躍領域。2022/11/10第三十二頁，共49頁。高效液相色譜儀5.高效液相色譜檢測器(1).紫外光度檢測器特點：a.靈敏度高；b.

線性范圍寬；c.

流通池可做的很小（1mm×10mm，容積8μL）；d.

對流動相的流速和溫度變化不敏感,可用于梯度洗脫；e.

波長可選,易于操作。

缺點:對紫外光完全不吸收的試樣不能檢測；同時溶劑的選擇受到限制。2022/11/10第三十三頁，共49頁。高效液相色譜檢測器(2).光電二極管陣列檢測器紫外檢測器的重要進展；陣列由1024個光電二極管陣列，各檢測一窄段波長，計算機快速處理，三維立體譜圖，如圖所示。2022/11/10第三十四頁，共49頁。2022/11/10第三十五頁，共49頁。光電二極管陣列檢測器2022/11/10第三十六頁，共49頁。高效液相色譜檢測器(3).熒光檢測器

高靈敏度、高選擇性；對多環芳烴，維生素B、黃曲霉素、卟啉類化合物、農藥、藥物、氨基酸、甾類化合物等有響應；2022/11/10第三十七頁，共49頁。高效液相色譜檢測器

(4).示差折光檢測器

除紫外檢測器之外應用最多的檢測器；可連續檢測參比池和樣品池中流動相之間的折光指數差值。差值與濃度呈正比。

通用型檢測器（每種物質具有不同的折光指數）；靈敏度低、對溫度敏感、不能用于梯度洗脫；偏轉式、反射式和干涉型三種；2022/11/10第三十八頁，共49頁。高效液相色譜檢測器

(5).電導檢測器

其作用原理是根據物質在某些介質中電離后所產生電導變化來測定電離物質含量。2022/11/10第三十九頁，共49頁。第七節高效液相色譜分離類型的選擇

要正確地選擇色譜分離方法，首先必須盡可能多的了解樣品的有關性質，其次必須熟悉各種色譜方法的主要特點及其應用范圍。選擇色譜分離方法的主要根據是樣品的相對分子質量的大小，在水中和有機溶劑中的溶解度，極性和穩定程度以及化學結構等物理、化學性質。1、相對分子質量對于相對分子質量較低（一般在200以下），揮發性比較好，加熱又不易分解的樣品，可以選擇氣相色譜法進行分析。相對分子質量在200~2000的化合物，可用液固吸附、液-液分配和離子交換色譜法。相對分子質量高于2000，則可用空間排阻色譜法。2022/11/10第四十頁，共49頁。2.溶解度水溶性樣品最好用離子交換色譜法和液液分配色譜法；微溶于水，但在酸或堿存在下能很好電離的化合物，也可用離子交換色譜法；油溶性樣品或相對非極性的混合物，可用液-固色譜法。3.化學結構若樣品中包含離子型或可離子化的化合物，或者能與離子型化合物相互作用的化合物（例如配位體及有機螯合劑），可首先考慮用離子交換色譜，但空間排阻和液液分配色譜也都能順利地應用于離子化合物；異構體的分離可用液固色譜法；具有不同官能團的化合物、同系物可用液液分配色譜法；對于高分子聚合物，可用空間排阻色譜法。高效液相色譜分離類型的選擇2022/11/10第四十一頁，共49頁。高效液相色譜分離類型的選擇2022/11/10第四十二頁，共49頁。第八節高效液相色譜儀應用實例固定相：薄殼型硅膠(37～50m)

流動相：正己烷流速：1.5mL/min

色譜柱：50cm2.5mm(內徑)

檢測器：差示折光檢測器

可對水果、蔬菜中的農藥殘留量進行分析。1.環境中有機氯農藥殘留量分析2022/11/10第四十三頁，共49頁。

2.稠環芳烴的分析

稠環芳烴多為致癌物質。

固定相：十八烷基硅烷化鍵合相流動相：20%甲醇-水～100%甲醇線性梯度淋洗，2%/min

流速：1mL/min

柱溫：50oC

柱壓：70104Pa

檢測器：紫外檢測器高效液相色譜儀應用實例2022/11/10第四十四頁，共49頁。高效液相色譜儀應用實例3.陰離子分析雙柱；薄殼型陰離子交換樹脂分離柱(3×250mm),

流動相：0.003mol·L-1NaHCO3/0.0024mol·L-1Na2CO3，流量138mL/h。七種陰離子在20分鐘內基本上得到完全分離，各組分含量在3～50ppm。2022/11/10第四十五頁，共49頁。第九節液相制備色譜分析型色譜:分離;

柱徑1～6cm，長度為15～30cm）

制備型色譜:獲得試樣中需要組分的較大量純品。制備柱：內徑由約10mm的實驗室