細胞培養簡介什么是細胞培養？細胞培養是指從動物或植物中取出細胞，然后使其在合適的人工環境中生長。這些細胞可于培養前直接從組織中取出并采用酶或機械方法進行解離，或者也可來自已經建立的細胞系或細胞株。原代培養原代培養是指將細胞從組織中分離后，使其在合適的條件下增殖直到占據所有可用基質(即：達到匯合狀態)的培養階段。在此階段，必須將細胞轉移到新的容器中并更換新鮮培養基，從而對細胞進行傳代培養，為其提供更多繼續生長的空間。細胞系首次傳代培養后，原代培養物即被稱為細胞系或者亞克隆。來自于原代培養的細胞系壽命有限(即：有限細胞系)，隨著細胞的傳代，生長能力最強的細胞會占據優勢，最終導致細胞群體在基因型和表型上達到一定程度的均一性。細胞株如果將細胞系的一個亞群通過克隆或者其他方法從培養物中明確地選擇出來，則此細胞系就成為一個細胞株。與親代細胞系起始時相比，細胞株往往會獲得其他一些遺傳學改變。細胞培養簡介有限細胞系與連續細胞系培養條件凍存

正常細胞通常只能分裂有限的次數，隨后就會喪失增殖的能力，這是一個由遺傳決定的事件，被稱為衰老；這種細胞系被稱為有限細胞系。但是，一些細胞系會通過被稱為轉化的過程變為永生性細胞系，這一過程可自然發生，也可經化學或病毒誘導發生。有限細胞系發生轉化獲得無限分裂能力后，就成為連續細胞系。各種細胞的培養條件相差很大，但是細胞培養的人工環境必須包括合適的容器，容器中含有一定的基質或介質，為細胞提供必需的營養素(氨基酸、碳水化合物、維生素、礦物質)、生長因子、激素和氣體(O2、CO2)，并可調節其物理化學環境(pH、滲透壓、溫度)。大多數細胞均具有貼壁依賴性，必須貼附在固體或半固體基質上培養(貼壁或者單層培養)，而另一些細胞則可在培養基中漂浮生長(懸浮培養)。如果傳代時有多余的細胞，可通過適當的保護劑(例如：DMSO或甘油)處理細胞，儲存在–130°C以下的溫度下(凍存)，直到需要使用之時。細胞培養實驗室

安全除了大多數日常工作場所共有的一些安全風險例如電擊和火災之外，細胞培養實驗室由于要操作和處理人或動物細胞和組織以及一些有毒、有腐蝕性或者有致突變性的溶劑和試劑，因而還具有一些特殊的危險。其中，最常見的一些危險包括：注射器針頭或者其他污染銳器刺傷、液體潑濺到皮膚和粘膜上、經口吞入毒物以及吸入感染性氣體揮發。任何生物安全程序的基本目的都是為了減少或避免實驗室工作人員和外部環境與潛在危害性生物物質的接觸。細胞培養實驗室中最重要的安全要素是嚴格遵守標準微生物學準則和技術。美國生物安全性法規和建議包含在由美國疾病預防控制中心(CDC)和國立衛生研究院(NIH)制定、美國衛生和福利部頒布的《微生物和生物醫學實驗室生物安全》文件中。該文件規定了四個逐級升高的控制等級，依次稱為生物安全1級至4級，介紹了按照操作某一制劑時對應的危險等級應遵守的微生物學準則、應使用的安全設備以及應采取的設施安全措施。生物安全1級(BSL-1)BSL-1為適合大多數研究和臨床實驗室的基礎防護等級，適用于不會導致健康正常人發生疾病的物質。生物安全2級(BSL-2)BSL-2適用于經口吞入或者經皮膚、粘膜接觸會導致人發生不同嚴重程度疾病的中度危險性物質。大多數細胞培養實驗室至少應達到BSL-2等級，但是確切要求取決于所用細胞系以及開展的工作類型。生物安全3級(BSL-3)BSL-3適用于已知可能會通過氣體揮發傳播的本地或外來性物質以及可導致嚴重、甚至致命感染的物質。生物安全4級(BSL-4)BSL-4適用于具有高度個體風險、可通過感染性氣體揮發導致威脅生命的不治之癥的外來性物質。應將此類物質控制在高防范等級的實驗室內。生物安全性等級安全數據表(SDS)，又被稱為材料安全數據表(MSDS)，是一種包含某物質各種屬性信息的表格。SDS中包括諸如熔點、沸點和閃點等物理數據、有關該物質毒性、反應性、健康影響、儲存和處置的信息，以及應對潑濺的推薦防護設備和措施。細胞培養實驗室的安全設備包括初級屏障，例如：生物安全柜、密閉容器及其他用于消除或盡量減少危險品接觸的工程控制設備，以及常與初級屏障配合使用的個人防護設備(PPE)。生物安全柜(即：細胞培養通風櫥)是最重要的安全設備，可以限制多種微生物學操作產生的感染性潑濺或氣體揮發，并可防止您培養的細胞受到污染。個人防護設備(PPE)在人員與危險品之間形成一道直接的屏障，包括用于個人防護的物品，例如：手套、實驗室工作服和隔離衣、鞋套、靴子、呼吸器、面罩、防護鏡或護目鏡。個人防護設備常與生物安全柜及其他可限制所操作物質或材料的裝置配合使用。安全數據表(SDS)安全設備個人防護設備(PPE)下列建議僅為實驗室安全規范的指導原則，不應將其視為完整的工作準則。?必須始終穿戴適當的個人防護設備。手套污染時應更換，將用過的手套與其他污染的實驗室廢物一起處置。?操作可能具有危害的物質后以及離開實驗室前應洗手。?在實驗室內不得進食、飲水、吸煙、處理隱形眼鏡、涂抹化妝品或者存放供人食用的食物。?遵守所在機構關于銳器(即：針頭、手術刀、吸管和破裂的玻璃器皿)安全操作的準則。?小心操作，盡量避免形成氣體揮發和/或潑濺。?實驗開始前、結束后以及可能具有傳染性的物質發生潑濺時，應立即使用適當的去污劑對所有工作臺面進行去污。無論實驗室設備是否被污染，均應定期進行清潔。?在對可能具有傳染性的物質進行處置前應先去除污染。?發生事故可能導致感染性物質暴露時，應向相應人員(例如：實驗室主管、安全員)報告。實驗室安全規范?細胞培養通風櫥(即：層流通風櫥或生物安全柜)?培養箱(推薦使用濕式二氧化碳培養箱)?水浴鍋?離心機?冰箱和冰柜(–20°C)?細胞計數器(例如：CountessR自動細胞計數器或血球計數器)?倒置顯微鏡?液氮(N2)冷凍柜或凍存容器?滅菌器(即：高壓滅菌器)?抽吸泵(蠕動泵或真空泵)?pH計?共聚焦顯微鏡?流式細胞儀?細胞培養容器(例如：培養瓶、培養皿、滾瓶、多孔板)?吸管和移液器?注射器和針頭?廢物容器?培養基、血清和試劑?細胞細胞培養設備基本設備擴增設備其他用品細胞培養通風櫥大小應足夠一人使用，內部和外部均易于清潔，具有充足的照明，使用舒適，不會導致體位不便。保持細胞培養通風櫥內工作空間整潔有序，將所有物品置于直視范圍內。向放入細胞培養通風櫥內的所有物品噴灑70%乙醇，擦拭清潔，進行消毒。細胞培養通風櫥內物品的擺放一般遵循以下右手使用習慣，并可根據特殊實驗中增加的物品進行相應的改動。?在通風櫥中部開闊區域放置細胞培養容器?移液器置于右前方易于取用的地方?試劑和培養基置于右后方，便于吸取?試管架置于中后部，用于固定其他試劑?小型容器置于左后部，用于盛放廢液細胞培養通風櫥布局培養箱的作用是為細胞生長提供合適的環境。培養箱大小應足夠滿足實驗室需要，具有強制空氣循環，并且具有溫度控制系統，可將溫度波動控制在±0.2°C范圍內。不銹鋼培養箱易于清潔，耐腐蝕，尤其適合使用濕化空氣進行培養的情況。雖然細胞培養箱的無菌性要求不如細胞培養通風櫥嚴格，但是必須經常對其進行清潔，以免培養的細胞受到污染。培養箱種類目前培養箱有兩種基本類型，即：干式培養箱和濕式二氧化碳培養箱。干式培養箱較為經濟，但是需要將細胞在密封的培養瓶中培養，以防止培養基蒸發。在干式培養箱中放置一只水盤可以增加一定的濕度，但是無法精確控制培養箱內的空氣條件。濕式二氧化碳培養箱較為昂貴，但是能夠準確控制培養條件。這種培養箱可用于培養皿或多孔板中細胞的培養，這種培養方式需要將空氣控制在高濕度、高二氧化碳壓力的狀態。培養箱一定濃度的CO2對細胞生長，尤其是原代培養和單細胞培養有促進作用（5%）。一定濃度的CO2可提供培養液恒定的pH。適用于開放培養，培養箱封口后，可在一般恒溫培養箱內培養，但是采用培養皿或多孔板培養時，則需高濕度和高CO2含量的空氣。它增加了濕度，箱體內裝有水浴，可以保證培養箱內的濕度。培養箱內裝有紫外燈。能過氣體流量計可以調節CO2和空氣的比例。在水中可加入防腐劑（二氧乙酸）。可防止因CO2培養箱中濕度較高，易長霉菌。培養箱細胞培養實驗室應設置多個儲存區，分別用于存放液體(如培養基和試劑)、化學品(如藥物和抗生素)、耗材(如一次性吸管、培養瓶和手套)、玻璃器皿(如培養基瓶和玻璃吸管)、特殊設備以及組織和細胞。玻璃器皿、塑料制品和特殊設備可置于架子上或抽屜中于室溫下存放；但是，所有培養基、試劑和化學品均應按照標簽說明存放。一些培養基、試劑和化學品對光線敏感，盡管其可耐受光照狀態下正常的實驗室使用，但是不使用時必須將其存放在暗處或者用鋁箔包裹起來。對于小型細胞培養實驗室，家用冰箱(最好是不含自動除霜冷凍室的冰箱)即可供試劑和培養基于2–8°C下存放之用，而且價格低廉。大型實驗室，采用專供細胞培養的冷藏室較為合適。應確保定期打掃冰箱或冷藏室，以防污染。大多數細胞培養試劑可于–5°C至–20°C下儲存；因此，可以采用超低溫冰柜(即：–80°C冰柜)存放多數試劑。與實驗室冰柜相比，家用冰柜是一種較為便宜的選擇。盡管大多數試劑可耐受自動除霜(即：自動解凍)冰柜內的溫度波動，但是有些試劑(例如抗生素和酶)則應儲存在無自動除霜功能的冰柜中。儲存冰箱冰柜隨著傳代次數的增加，連續培養的細胞系可能發生遺傳不穩定；因此，必須準備工作細胞儲備并將其存放于低溫狀態下。不得將細胞存放于–20°C或–80°C冰柜中，因為細胞存放于上述溫度條件下活力會迅速降低。目前主要有兩種液氮儲存系統，即：蒸汽相和液相儲存系統，分別采用廣口和細口儲存容器。蒸汽相系統可降低凍存管爆炸危險，儲存生物危害性物質時應使用該系統，液相系統通常具有更長的靜態保溫時間，因而更為經濟。細口容器中液氮蒸發速度較慢，更為經濟，而廣口容器存取方便，儲存容量較大。細胞計數器是定量監測細胞增殖動力學的必備工具，實驗室內同時培養2-3種以上細胞時，細胞計數器能夠提供巨大的便利。低溫儲存細胞計數器無菌技術簡介良好的個人衛生

細胞培養的成功很大程度上取決于保護細胞免受細菌、真菌和病毒等微生物的污染。非無菌物品、培養基和試劑、帶有微生物的空氣顆粒、不干凈的培養箱和污染的工作臺面均是導致微生物污染的來源。無菌技術的作用是在環境微生物與無菌的細胞培養物之間形成一道屏障，它通過一套操作流程來降低培養物被上述污染源污染的可能。無菌技術的組成要素包括：無菌工作區域、良好的個人衛生、無菌試劑和培養基以及無菌操作。無菌技術細胞培養物污染往往是細胞培養實驗室最常遇到的問題，有時會帶來十分嚴重的后果。凡混入細胞培養環境中對細胞生存有害的成分和造成細胞不純的異物都應視為污染。盡管無法徹底消除污染，但是可以通過充分了解污染源以及采用良好的無菌技術，降低污染發生的頻率和嚴重程度。。

物理污染

化學污染

生物污染掌握良好的無菌操作技術

建立細胞庫

合理應用抗生素

保持工作區清潔

建立良好的規章制度

檢測細胞污染細胞培養污染簡介分類控制污染新購買的血清用之前要試

應選用同一批次的血清

選用純度最高的試劑

經過權威機構認定

正確的儲存方法

用來配液和清洗容器

傳統用雙蒸和三蒸水

超純水放置過久導致純度下降

生產過程中有毒物質殘留，如內毒素

消毒劑和清洗劑的殘留

鋁箔和包裹紙殘留CO2混有有毒氣體

消毒劑和清洗劑的殘留化學污染血清培養液及試劑水培養用器皿孵箱容易發現的生物污染包括細菌、霉菌、酵母不容易被發現的生物污染包括病毒、支原體、原蟲以及其他細胞系的交叉污染。

無抗生素污染易被發現

抗生素存在易造成隱性污染

隱性污染引起嚴重后果最難發現和清除

嚴格的宿主性

自限性

對實驗人員是一個潛在的危險因素生物污染細菌、霉菌和酵母病毒霉菌是真菌界的一種真核微生物，以被稱為菌絲的多細胞絲狀體形式生長。這些多細胞絲狀體構成的交聯網絡含有遺傳性相同的細胞核，被稱為集落或者菌絲體。與酵母污染類似，霉菌污染初期培養物pH值會維持穩定，污染加重后pH值會迅速升高，導致培養物渾濁。在顯微鏡下，菌絲體通常呈細束狀纖維，有時呈較為密集的孢子團塊。許多種霉菌的孢子在休眠期均可耐受極端嚴峻、不利的環境，當其遇到合適的生長條件時才會被活化。病毒是一種微觀感染性物質，利用宿主細胞結構進行復制。病毒體積極小，因而要檢測培養物中有無病毒以及將其從細胞培養實驗室所用試劑中去除都十分困難。由于大多數病毒對宿主有非常嚴格的要求，因此一般不會對與其宿主物種不同的細胞培養物造成不良影響。但是，使用病毒感染的細胞培養物時卻會對實驗室工作人員造成嚴重的健康威脅，特別是當實驗室培養的是人或靈長類動物細胞時。通過電子顯微鏡檢查、一組抗體的免疫染色、ELISA實驗或者采用適當病毒引物的PCR技術可以檢測出細胞培養物的病毒污染。生物污染霉菌病毒細菌是一大類廣泛存在的單細胞微生物。細菌直徑一般為幾個微米，外形多樣，例如：球狀、桿狀和螺旋狀。細菌由于分布廣泛、生長迅速以及體積大小的特點，與酵母和霉菌一起構成了細胞培養中最常遇到的生污染物。培養物被細菌污染后，幾天內即可通過簡單的肉眼觀察發現；被感染的培養物通常呈云霧狀(即：渾濁狀)，有時表面會覆蓋一層薄膜。另外，經常還會發現培養基的pH值突然降低。在低倍顯微鏡下可見，細菌為細胞之間移動的微小顆粒，在高倍顯微鏡下觀察可以分辨出各個細菌的形狀。生物污染細菌貼壁生長的293細胞被大腸桿菌污染酵母是真菌界的一種單細胞真核微生物，大小從數微米(多見)到40微米(罕見)不等。與細菌污染類似，培養物被酵母污染后也會變得渾濁，特別是進入污染后期時。培養物被酵母污染后pH值變化極小，污染嚴重時pH值才會升高。在顯微鏡下，酵母呈單個卵圓形或球形顆粒，有些會芽生出較小的顆粒。生物污染酵母貼壁生長的293細胞接種24小時后被酵母感染。

影響細胞的生長狀態及形態

影響細胞的代謝和功能（1）培液中的精氨酸被支原體大量消耗，引起細胞蛋白質、DNA、rRNA、mRNA的合成障礙；（2）支原體活動使培液成分發生改變（如發酵型支原體降解糖類產生酸性物質），影響細胞代謝。（3）支原體吸附在細胞表面，破壞細胞膜的完整性，影響細胞信號傳遞；（4）支原體消耗細胞的核苷庫—染色體異常其他此外，支原體污染還會影響一些病毒在細胞中的產量、使惡性細胞致癌能力下降、影響淋巴細胞分化等。支原體支原體檢測方法方法敏感性優點缺點直接DNA染色（如Hoechst33258）低快速，便宜需要熒光顯微鏡，結果不易解釋指示細胞間接DNA染色（如Vero）中放大污染，結果易解釋費時免疫熒光單克隆抗體高易操作靈敏需要熒光顯微鏡肉湯和瓊脂培養高靈敏慢且需要專業解釋ELISA中快速檢查種類有限PCR中-高特異性強，快速需要PCR設備相差顯微鏡檢測能直接觀察到需要相差油鏡低張處理地衣紅染色法3-H胸腺嘧啶摻入法樹立“預防為主”的思想保證細胞來源干凈確保基質和器材無菌嚴格無菌操作細胞培養時避免交談操作結束時消毒臺面每傳15代細胞應更換所有細胞培養材料丟棄前應高壓消毒生物污染支原體細胞一旦發生了支原體污染，應當棄之。雖然已有了針對支原體的抗生素及最近出現的所謂支原體清除劑，這些方法只能殺滅細胞外的支原體，除非是不可替代或無法重新獲得的細胞，一般沒有必要進行支原體清除工作。四種支原體污染救治方案療效比較支原體污染方法時間細胞損傷價格是否復發加溫法短，約24h時間不易掌握，易對細胞造成損傷非常便宜可能多西環素、環丙沙星聯合治療較短，約48h藥物劑量不易控制，量大易對細胞造成損傷便宜可能BM-Cyclin-1,2排除法較長，約10天對細胞幾乎無損傷較昂貴一般不會裸鼠過繼法長，約1月對細胞無損傷昂貴不會不同公司支原體去除劑比較名稱MRAPlasmocintreatmentBM-CyclinBIOMYC-1BIOMYC-2BIOMYC-3產品貨號3050044ant-mpt1079905000103-036-103-037-103-038-1生產商MPBiochemicalsInvivoGenRocheBioindBioind有效成分喹諾酮類衍生物大環內脂類、喹諾酮類泰妙菌素二甲胺四環素泰妙菌素二甲胺四環素弗諾喹酮類有效濃度(ug/ml)0.512.5-37.5BC1:10，BC2:51ml/100ml1ml/100ml作用時間1周，短2周，長BC1三天，BC2四天，2次循環BM1四天，BM2三天，2-3次循環2周，每2-3天換藥產品總量5ml(50ug/ml)2*1ml(25mg/ml)BC1:25mgBC2:12.5mg100*10ml100*10ml細胞毒性+/-幾乎無+/-++/-+/-預防支原體污染可以，0.1ug/ml不可以不確定不確定不確定雖然不如微生物污染普遍，但是許多細胞系與HeLa細胞及其他生長迅速的細胞系間廣泛的交叉污染是一個明確的問題，會造成嚴重的后果。從聲譽好的細胞庫獲取細胞系、定期檢查細胞系的性質以及采用良好的無菌技術是有助于避免交叉污染的慣例方法。通過DNA指紋圖譜、核型分析和同位素分析可以確認細胞培養物有無交叉污染。細胞培養時不應常規使用抗生素，因為連續使用抗生素會促進抗生素耐藥性細胞株的產生，導致輕度污染持續存在。一旦將抗生素從培養基中去除，這種輕度污染最終將發展成大規模污染，而且連續使用抗生素還會掩蓋支原體感染及其他隱性污染。另外，有些抗生素會與細胞發生交叉反應，干擾您研究的細胞過程。抗生素只能作為對付污染的最后手段而且只能短期使用，并應盡快撤除。如果長期使用抗生素，則應同時進行無抗生素培養，以便作為鑒別隱性感染的對照。生物污染交叉污染抗生素的使用控制污染清洗和消毒清洗1玻璃器皿的清洗玻璃器皿的清洗配方成分弱酸次強酸強酸重鉻酸鉀(g)5010060清水(ml)10001000200濃硫酸(ml)90160800硫酸濃度(v/v)8%14%80%Note：

選用酎酸塑料桶或不銹鋼桶配制為宜。

先將重鉻酸鉀溶于水（用玻璃棒攪拌助溶，有時不能完全溶解。

緩緩加入濃硫酸，切忌過急，否則將產熱而發生危險（絕不可將重鉻酸鉀倒入濃硫酸中）。

清潔液配好呈棕紅色，待變綠色時表明失效，由于清潔液的腐蝕性極強，配制與應用時必須小心，并做好防護。重鉻酸鉀-濃硫酸復合清潔液玻璃器皿的清洗矽酸鈉洗液貯存液（100×）矽酸鈉80g加偏磷酸鈉9g在加熱溶在1000ml水中。使用時用水稀釋100倍，將器皿放入煮沸20min，冷卻后沖洗，再用2%HCl浸泡2h后，自來水沖洗。矽酸鈉洗液較清潔液安全，但價格較貴。除菌濾器的處理用過的濾器將濾膜去除，用三蒸水充分洗凈殘余液體，置于干燥箱中烘干備用。塑料器皿的清洗膠塞等橡膠類的處理及清洗金屬器械的清洗包裝包裝的目的是防止消毒滅菌后再次遭受污染，所以經清洗烤干或晾干的器材，應嚴格包裝后再行消毒滅菌處理消毒滅菌適用于玻璃器皿的消毒，160-170℃，90-120min或180℃45-60min。優點：使用簡便，消毒后的物品干燥，易于保存。缺點：干熱傳導較慢，需較長時間。用于玻璃制品、濾器、橡膠塞、解剖用具、耐熱塑料器具、受熱不變性的溶液等，不同物品的有效滅菌壓力和時間不同，如：培養液、橡膠制品、塑料器皿等[68kPa（115℃），10min]；布類、玻璃制品、金屬器械等[103kPa(121℃)，15min]。