第四節營養缺陷型菌株的篩選原養型菌株：即野生型菌株，可以合成生長所需的各種營養物質。營養缺陷型：指營養缺陷型菌株經過誘變或自然突變失去合成某種營養成分的能力，只有在基本培養基中補充所缺乏的營養因子才能生長。培養基類型基本培養基（MM）：能維持野生型菌株正常生長的培養基。營養貧乏，氮源是由一些無機物組成，碳源只能用純凈的蔗糖或葡萄糖。補充培養基（SM）：為了鑒別某一種營養缺陷型菌株，在基本培養基中加入該菌株不能合成的營養因子的培養基。完全培養基（CM）：能滿足各種缺陷型菌株生長的培養基。一、營養缺陷型菌株的

分離和篩選營養缺陷型的誘發營養缺陷型的誘變方法與普通誘變育種基本相同。但是營養缺陷型是單一基因突變，所以有的誘變劑不適合誘發營養缺陷型。如電離輻射，易引起染色體巨大損傷。誘發營養缺陷型的誘變劑一般有亞硝基胍、紫外線、亞硝酸等。其中亞硝基胍誘發頻率極高，一般可達10%以上，最高達80%。抗生素法原理青霉素等抗生素能抑制細胞壁粘肽組分的合成，處在生長繁殖過程分裂期的細胞對青霉素十分敏感，因而被殺死，但不能殺死停止分裂的細胞。將誘變后的菌懸液分離在加有抗生素的MM上，培養后野生型的被全部殺死，營養型菌株由于不能生長繁殖而被保留下來，從而得到富集。對于酵母等真菌用制霉菌素處理抗生素法處理方法①將誘變處理的菌體在完全培養基中進行振蕩培養2~3代，以結束表型延遲現象，達到穩定的表型和生理狀況。②收集菌體離心洗滌，然后轉到基本培養基中進行饑餓培養4~6小時，以消耗在完全培養基中攝取而儲存在體內的氮素營養，使其停止生長，否則也會被青霉素殺死。③再轉移到含無機氮的基本培養基中培養3~4小時，使野生型細胞剛剛進入對數期，加入一定濃度的青霉素，大量野生型細胞瓦解、死亡，釋放出細胞內的許多物質，其中有的被缺陷型作為營養利用而得以繼續生長，最終也被青霉素破壞，造成缺陷型篩選率大為下降。為防止這種現象的發生，可以在基本培養基中加入20%蔗糖，以提高滲透壓，使死亡的野生行細胞處于高滲透液的包圍中，阻止原生質體破裂。④在基本培養基和完全培養基上涂平板，比較兩種培養基上菌落的差數。在基本培養基上不長的就是營養缺陷型菌株。菌絲過濾法原理真菌和放線菌都是絲狀菌，其野生型孢子在基本培養基中能萌發長成菌絲，而營養缺陷型孢子則不能萌發。菌絲過濾法處理方法①將誘變處理后的孢子移入基本培養液中，振蕩培養10h左右，使野生型孢子萌發的菌絲剛剛肉眼可見；②用滅菌的脫脂棉、濾紙或玻璃漏斗除去菌絲；③繼續培養，每隔3~4h過濾一次，重復3~4次，以最大限度地除去野生型細胞；④稀釋，涂平板進行分離。高溫殺菌法原理主要是利用芽孢菌類的芽孢和營養體對熱敏感性的差異。高溫殺菌法處理方法①讓誘變后的細菌形成芽孢；②把處在芽孢階段的細菌轉移到基本培養基中，振蕩培養一定時間，野生型芽孢萌發，而營養缺陷型芽孢不萌發；③將培養物加熱到80℃，野生型細胞大部分被殺死，缺陷型則保存下來，起到濃縮的作用。二、營養缺陷型的檢出（一）點植對照檢出法（二）影印法絲絨印模本法適用于細菌、酵母菌以及小型菌落的放線菌和霉菌。采用影印法進行霉菌缺陷型檢出時，要注意兩點：第一，防止菌落擴散和蔓延，可在培養基中加入0.5%左右的脫氧膽酸鈉，或在基本培養基中用山梨糖作為碳源，再加入適量蔗糖使菌落長得小而密；第二，克服孢子擴散帶來的不純現象。用薄紙覆蓋代替影印。值得注意的是（三）夾層法（四）限量補給法將處理后的菌液涂布在含微量（0.01%或更少）營養補充劑（如蛋白胨）的基本培養基上，營養缺陷型長得慢，菌落小；野生型長得快，菌落大，可篩去野生型。三、營養缺陷型的鑒別營養缺陷型的測定方法一種方法：生長譜法，即在同一個平皿上測定一種缺陷型菌株對許多種生長因子的缺陷情況。另一種方法：在一個培養皿上加一種營養物質、測定許多缺陷型菌株（10~50個）對該種生長因子的缺陷情況。營養缺陷型鑒定步驟①測定缺陷型菌株所需生長因子的類別；②測定缺陷型在該大類中具體需要哪種生長因子；③進一步用單一生長因子進行復證試驗。1缺陷型菌株所需類別的測定通常用以下物質代表類別物質：①酵母浸出液，其中有AA、Vitamin、核酸堿基。②氨基酸混合物、酪素水解物或蛋白胨，代表氨基酸組。③維生素混合物，代表維生素組。④核酸堿基混合液或酵母核酸，代表嘌呤、嘧啶類。營養缺陷型類別的測定2缺陷型所需生長因子的測定這一步的主要目的就是鑒別其單一缺陷因子，或雙缺、三缺的生長因子。鑒定因子生長因子的配制方法用于營養缺陷型鑒定的氨基酸21種。21種氨基酸編成6組用于營養缺陷型鑒定的維生素15種。15種維生素編成5組用于營養缺陷型鑒定的核酸堿基有7種。7種核酸堿基單一配制氨基酸組合表組別氨基酸名稱1賴氨酸精氨酸蛋氨酸胱氨酸亮氨酸異亮氨酸2纈氨酸精氨酸苯丙氨酸酪氨酸色氨酸組氨酸3蘇氨酸蛋氨酸苯丙氨酸谷氨酸脯氨酸天冬氨酸4丙氨酸胱氨酸酪氨酸谷氨酸甘氨酸絲氨酸5鳥氨酸亮氨酸色氨酸脯氨酸甘氨酸谷氨酰胺6胍氨酸異亮氨酸組氨酸天冬氨酸絲氨酸谷氨酰胺維生素組合表組合維生素名稱1維生素A維生素B1維生素B2維生素B6維生素B122維生素C維生素B1維生素D維生素E煙酰胺3葉酸維生素B2維生素D膽堿泛酸鈣4對氨基苯甲酸維生素B6維生素E膽堿肌醇5生物素維生素B12煙酰胺泛酸鈣肌醇單一營養缺陷型的檢出生長組合和氨基酸缺陷對應表組組合的生長因子生長組合缺陷氨基酸生長組合缺陷氨基酸一17891011一1二與三12二2712131415二2二與四13三3812161718三3二與五14四4913161920四4二與六15五51014171921五5三與四16六61115182021六6三與五17一與二7三與六18一與三8四與五19一與四9四與六20一與五10五與六21一與六11氨基酸營養缺陷型測定生長組合和氨基酸缺陷對應表組組合的生長因子生長組合缺陷氨基酸生長組合缺陷氨基酸一17891011一1二與三12二2712131415二2二與四13三3812161718三3二與五14四4913161920四4二與六15五51014171921五5三與四16六61115182021六6三與五17一與二7三與六18一與三8四與五19一與四9四與六20一與五10五與六21一與六11氨基酸組合表組別氨基酸名稱1賴氨酸精氨酸蛋氨酸胱氨酸亮氨酸異亮氨酸2纈氨酸精氨酸苯丙氨酸酪氨酸色氨酸組氨酸3蘇氨酸蛋氨酸苯丙氨酸谷氨酸脯氨酸天冬氨酸4丙氨酸胱氨酸酪氨酸谷氨酸甘氨酸絲氨酸5鳥氨酸亮氨酸色氨酸脯氨酸甘氨酸谷氨酰胺6胍氨酸異亮氨酸組氨酸天冬氨酸絲氨酸谷氨酰胺氨基酸營養缺陷型測定生長組合和氨基酸缺陷對應表組組合的生長因子生長組合缺陷氨基酸生長組合缺陷氨基酸一17891011一1二與三12二2712131415二2二與四13三3812161718三3二與五14四4913161920四4二與六15五51014171921五5三與四16六61115182021六6三與五17一與二7三與六18一與三8四與五19一與四9四與六20一與五10五與六21一與六11氨基酸組合表組別氨基酸名稱1賴氨酸精氨酸蛋氨酸胱氨酸亮氨酸異亮氨酸2纈氨酸精氨酸苯丙氨酸酪氨酸色氨酸組氨酸3蘇氨酸蛋氨酸苯丙氨酸谷氨酸脯氨酸天冬氨酸4丙氨酸胱氨酸酪氨酸谷氨酸甘氨酸絲氨酸5鳥氨酸亮氨酸色氨酸脯氨酸甘氨酸谷氨酰胺6胍氨酸異亮氨酸組氨酸天冬氨酸絲氨酸谷氨酰胺氨基酸營養缺陷型測定生長組合和氨基酸缺陷對應表組組合的生長因子生長組合缺陷氨基酸生長組合缺陷氨基酸一17891011一1二與三12二2712131415二2二與四13三3812161718三3二與五14四4913161920四4二與六15五51014171921五5三與四16六61115182021六6三與五17一與二7三與六18一與三8四與五19一與四9四與六20一與五10五與六21一與六11氨基酸組合表組別氨基酸名稱1賴氨酸精氨酸蛋氨酸胱氨酸亮氨酸異亮氨酸2纈氨酸精氨酸苯丙氨酸酪氨酸色氨酸組氨酸3蘇氨酸蛋氨酸苯丙氨酸谷氨酸脯氨酸天冬氨酸4丙氨酸胱氨酸酪氨酸谷氨酸甘氨酸絲氨酸5鳥氨酸亮氨酸色氨酸脯氨酸甘氨酸谷氨酰胺6胍氨酸異亮氨酸組氨酸天冬氨酸絲氨酸谷氨酰胺維生素組合表組合維生素名稱1維生素A維生素B1維生素B2維生素B6維生素B122維生素C維生素B1維生素D維生素E煙酰胺3葉酸維生素B2維生素D膽堿泛酸鈣4對氨基苯甲酸維生素B6維生素E膽堿肌醇5生物素維生素B12煙酰胺泛酸鈣肌醇生長組合和生長因子對應表組組合的生長因子生長組合缺陷生長因子一12345一1二26789二6三37101112三10四48111314四13五59121415五15一與二2一與三3一與四4一與五5二與三7二與四8二與五9三與四11三與五12四與五14維生素營養缺陷型測定這里測定的都是單缺菌株，如果要測定雙缺以上的菌株，可以采用每一培養皿中都缺一種生長因子的做法。例如：測定維生素缺陷株把15種維生素混合制備15套平板，每個